化合物、乙醛脫氫酶2激活劑、醫藥組合物、以及治療及/或預防藥的制作方法

1.本發明涉及化合物、乙醛脫氫酶2激活劑、醫藥組合物、以及治療及/或預防藥。


背景技術：

2.乙醛脫氫酶2(aldh2)是分解乙醛等醛類的酶，已報道了其與各種疾病(例如，范科尼貧血、骨質疏松癥、非酒精性脂肪性肝病(nafld)、非酒精性脂肪性肝炎(nash)、酒精性肝損傷、胰腺炎、缺血再灌注損傷、外周動脈疾病、阿爾茨海默病、帕金森氏病、食道癌、頭頸癌、及疼痛)的關系。
3.范科尼貧血(fa)是遺傳性的骨髓衰竭疾病，伴有再生障礙性貧血、白血病、癌、畸形等癥狀。在骨髓中制作血液的干細胞中，適當地分解醛、修復損傷的基因組是重要的，然而，有報道稱在fa患者中無法修復由醛導致的基因組損傷而導致貧血發展(例如，非專利文獻1)。
4.在與骨質疏松癥的關系上，有報道稱：在aldh2基因突變模型小鼠中呈現出骨質疏松癥的癥狀，骨密度降低；前述模型小鼠的成骨細胞的分化形成能力顯著降低；以及，在人類中，具有aldh2基因突變的成骨細胞的形成能力也降低(例如，非專利文獻2)。
5.nafld及nash是以代謝性疾病為背景、由于在肝臟中蓄積中性脂肪而發病的，有報道稱：在aldh2的低活性基因型的人中，nafld的發病率高(例如，非專利文獻3)。另外，酒精性肝損傷及胰腺炎是由于過量的飲酒而引起的，認為乙醇在生物體內被分解而產生的乙醛是其主要原因。此外，有報道稱：在nafld、nash、酒精性肝損傷、及胰腺炎的病理模型中，通過aldh2激活化合物或aldh2基因的導入而改善了病狀(例如，非專利文獻4、5及6)。
6.缺血再灌注損傷是因動脈的阻塞而使器官的缺血狀態持續后、由于恢復血液供給而產生的組織損傷。為了針對缺血再灌注損傷進行保護，有報道稱aldh2激活化合物是有效的(例如，專利文獻1)。另外，還提示了外周動脈疾病與aldh2的關聯(例如，非專利文獻7)。
7.阿爾茨海默病、帕金森氏病是原因不明的神經變性疾病，但有報道稱飲酒、aldh2基因突變有助于病狀的發病、發展(例如，非專利文獻8及9)。
8.食道癌的危險因素被認為是吸煙、飲酒、及熱飲、食物的過量攝取，國際癌癥研究機構(iarc)在2010年將酒精飲料認定為食道鱗狀細胞癌的致癌物質。已報道了食道癌與飲酒及aldh2的關聯性，即，有報道稱：根據食道癌及頭頸癌患者的分析，提示了通過戒酒來抑制食道癌進展的可能性；在敲入了低活性突變型的人ald h2基因的小鼠中，通過飲酒而更強烈地受到食道中的dna損傷；等等(例如，非專利文獻10及11)。同樣地，已報道了頭頸癌與aldh2的關聯性(例如，非專利文獻12)。
9.作為疼痛，大體上已知有炎癥性(損傷感受性)、神經性、及原因不明的疼痛，有報道稱：在使用了小鼠的炎癥性疼痛模型中，aldh2突變型導入小鼠更容易感到疼痛刺激，可利用aldh2激活化合物解除(例如，非專利文獻13)。
10.如上所述，已報道了aldh2與各種疾病的關系，因此期待將aldh2激活對于各種疾
病的治療及/或預防而言有效。作為具有ald h2的激活作用的化合物，例如，已知有專利文獻1～4中記載的化合物。
11.現有技術文獻
12.專利文獻
13.專利文獻1：國際公開第2008/112164號公報
14.專利文獻2：國際公開第2014/160185號公報
15.專利文獻3：國際公開第2015/127137號公報
16.專利文獻4：國際公開第2019/151241號公報
17.非專利文獻
18.非專利文獻1：blood(2013)122(18):3206-3209
19.非專利文獻2：journal of bone and mineral research(2012)27(9):2015-2023
20.非專利文獻3：nutrition&diabetes(2016)6,e210
21.非專利文獻4：redox biology(2019)24:101205
22.非專利文獻5：journal of hepatology(2015)62:647-656
23.非專利文獻6：biochemical and biophysical research commun ications(2020)522:518-524
24.非專利文獻7：pharmacological research(2017)115:96-106
25.非專利文獻8：biochemical and biophysical research commun ications(2000)273:192-196
26.非專利文獻9：neurology(2014)82:419-426
27.非專利文獻10：gastroenterology(2016)151:860-869
28.非專利文獻11：carcinogenesis(2020)41:194-202
29.非專利文獻12：international journal of oncology(2008)32:945-973
30.非專利文獻13：science translational medicine(2014)6:251ra118


技術實現要素：

31.發明所要解決的課題
32.本發明的目的是提供具有aldh2激活作用的化合物、或包含前述化合物的aldh2激活劑、醫藥組合物、或者治療或預防藥。
33.用于解決課題的手段
34.本技術的發明人進行了深入研究，結果發現，具有規定結構的化合物具有aldh2激活作用，從而完成了本發明。
35.本發明包括以下的實施方式。
36.1.37.下述式(1)表示的化合物、其醫藥上可容許的鹽或它們的前藥。
38.[化學式1]
[0039][0040]
[式中，
[0041]
a為雜環，
[0042]
r1及r2各自獨立地為氫、烷基、烯基、或炔基，
[0043]
r3為烷基、烯基、或炔基，
[0044]
x1及x2各自獨立地為鹵素]
[0045]
[2]
[0046]
如[1]所述的化合物、其醫藥上可容許的鹽或它們的前藥，其中，a包含至少1個氮原子作為環成員原子。
[0047]
[3]
[0048]
如[1]或[2]所述的化合物、其醫藥上可容許的鹽或它們的前藥，其中，a為5或6元環。
[0049]
[4]
[0050]
如[1]～[3]中任一項所述的化合物、其醫藥上可容許的鹽或它們的前藥，其中，a為芳香族雜環。
[0051]
[5]
[0052]
如[1]～[4]中任一項所述的化合物、其醫藥上可容許的鹽或它們的前藥，其中，式(1)表示的化合物為下述式(2)或(3)表示的化合物。
[0053]
[化學式2]
[0054][0055]
[化學式3]
[0056][0057]
[式中，r1、r2、r3、x1及x2如上所述]
[0058]
[6]
[0059]
如[1]～[5]中任一項所述的化合物、其醫藥上可容許的鹽或它們的前藥，其中，r1為氫或烷基。
[0060]
[6-1]
[0061]
如[1]～[6]中任一項所述的化合物、其醫藥上可容許的鹽或它們的前藥，其中，r1為氫或甲基。
[0062]
[6-2]
[0063]
如[1]～[6-1]中任一項所述的化合物、其醫藥上可容許的鹽或它們的前藥，其中，r1為氫。
[0064]
[7]
[0065]
如[1]～[6-2]中任一項所述的化合物、其醫藥上可容許的鹽或它們的前藥，其中，r2為氫或烷基。
[0066]
[7-1]
[0067]
如[1]～[7]中任一項所述的化合物、其醫藥上可容許的鹽或它們的前藥，其中，r2為氫或甲基。
[0068]
[7-2]
[0069]
如[1]～[7-1]中任一項所述的化合物、其醫藥上可容許的鹽或它們的前藥，其中，r2為氫。
[0070]
[8]
[0071]
如[1]～[7-2]中任一項所述的化合物、其醫藥上可容許的鹽或它們的前藥，其中，r3為被鹵素取代的烷基或未取代的烷基。
[0072]
[8-1]
[0073]
如[1]～[8]中任一項所述的化合物、其醫藥上可容許的鹽或它們的前藥，其中，r3為被氟取代的甲基或未取代的甲基。
[0074]
[8-2]
[0075]
如[1]～[8-1]中任一項所述的化合物、其醫藥上可容許的鹽或它們的前藥，其中，r3為未取代的甲基。
[0076]
[9]
[0077]
如[1]～[8-2]中任一項所述的化合物、其醫藥上可容許的鹽或它們的前藥，其中，x1為氟或氯。
[0078]
[10]
[0079]
如[1]～[9]中任一項所述的化合物、其醫藥上可容許的鹽或它們的前藥，其中，x2為氟。
[0080]
[11]
[0081]
如[1]～[10]中任一項所述的化合物、其醫藥上可容許的鹽或它們的前藥，其中，式(1)表示的化合物選自由下述化合物組成的組。
[0082]
[化學式4]
[0083][0084]
[12]
[0085]
如[1]～[11]中任一項所述的前藥或其醫藥上可容許的鹽，其中，r1為-ch
2-o-po3h2。
[0086]
[13]
[0087]
如[1]～[11]中任一項所述的前藥或其醫藥上可容許的鹽，其中，a包含至少1個氮原子作為環成員原子，前述氮原子中的至少1個被-ch
2-o-po3h2取代。
[0088]
[14]
[0089]
如[1]～[13]中任一項所述的前藥或其醫藥上可容許的鹽，其中，前藥或其醫藥上可容許的鹽選自由下述化合物組成的組。
[0090]
[化學式5]
[0091][0092]
[15]
[0093]
乙醛脫氫酶2激活劑，其包含[1]～[14]中任一項所述的化合物、其醫藥上可容許的鹽或它們的前藥。
[0094]
[16]
[0095]
醫藥組合物，其包含[1]～[14]中任一項所述的化合物、其醫藥上可容許的鹽或它們的前藥。
[0096]
[17]
[0097]
疾病的治療及/或預防藥，所述疾病選自由范科尼貧血、骨質疏松癥、非酒精性脂肪性肝病(nafld)、非酒精性脂肪性肝炎(na sh)、酒精性肝損傷、胰腺炎、缺血再灌注損傷、外周動脈疾病、阿爾茨海默病、帕金森氏病、食道癌、頭頸癌、及疼痛組成的組，所述治療及/或預防藥包含[1]～[14]中任一項所述的化合物、其醫藥上可容許的鹽或它們的前藥。
[0098]
[a1]
[0099]
將乙醛脫氫酶2激活的方法，所述方法包括向有需要的患者施予有效量的[1]～[14]中任一項所述的化合物、其醫藥上可容許的鹽或它們的前藥。
[0100]
[a2]
[0101]
治療及/或預防疾病的方法，所述疾病選自由范科尼貧血、骨質疏松癥、非酒精性脂肪性肝病(nafld)、非酒精性脂肪性肝炎(nash)、酒精性肝損傷、胰腺炎、缺血再灌注損傷、外周動脈疾病、阿爾茨海默病、帕金森氏病、食道癌、頭頸癌、及疼痛組成的組，所述方法包括向有需要的患者施予有效量的[1]～[14]中任一項所述的化合物、其醫藥上可容許的鹽或它們的前藥。
[0102]
[b1]
[0103]
如[1]～[14]中任一項所述的化合物、其醫藥上可容許的鹽或它們的前藥，其用于乙醛脫氫酶2的激活。
[0104]
[b2]
[0105]
如[1]～[14]中任一項所述的化合物、其醫藥上可容許的鹽或它們的前藥，其用于
疾病的治療及/或預防，所述疾病選自由范科尼貧血、骨質疏松癥、非酒精性脂肪性肝病(nafld)、非酒精性脂肪性肝炎(nash)、酒精性肝損傷、胰腺炎、缺血再灌注損傷、外周動脈疾病、阿爾茨海默病、帕金森氏病、食道癌、頭頸癌、及疼痛組成的組。
[0106]
[c1]
[0107]
[1]～[14]中任一項所述的化合物、其醫藥上可容許的鹽或它們的前藥用于將乙醛脫氫酶2激活的用途。
[0108]
[c2]
[0109]
[1]～[14]中任一項所述的化合物、其醫藥上可容許的鹽或它們的前藥用于治療及/或預防疾病的用途，所述疾病選自由范科尼貧血、骨質疏松癥、非酒精性脂肪性肝病(nafld)、非酒精性脂肪性肝炎(nash)、酒精性肝損傷、胰腺炎、缺血再灌注損傷、外周動脈疾病、阿爾茨海默病、帕金森氏病、食道癌、頭頸癌、及疼痛組成的組。
[0110]
[d1]
[0111]
[1]～[14]中任一項所述的化合物、其醫藥上可容許的鹽或它們的前藥在乙醛脫氫酶2激活劑的制造中的用途。
[0112]
[d2]
[0113]
[1]～[14]中任一項所述的化合物、其醫藥上可容許的鹽或它們的前藥在疾病的治療及/或預防藥的制造中的用途，所述疾病選自由范科尼貧血、骨質疏松癥、非酒精性脂肪性肝病(nafld)、非酒精性脂肪性肝炎(nash)、酒精性肝損傷、胰腺炎、缺血再灌注損傷、外周動脈疾病、阿爾茨海默病、帕金森氏病、食道癌、頭頸癌、及疼痛組成的組。
[0114]
發明效果
[0115]
根據本發明，可以提供具有aldh2激活作用的化合物、或包含前述化合物的aldh2激活劑、醫藥組合物、或者治療或預防藥。
具體實施方式
[0116]
以下，對本發明的實施方式進行具體說明，但本發明不限于此，可在不脫離其要旨的范圍內進行各種變形。
[0117]
《化合物》
[0118]
本發明的一個實施方式涉及下述式(1)表示的化合物、其醫藥上可容許的鹽或它們的前藥。
[0119]
[化學式6]
[0120][0121]
[式中，
[0122]
a為雜環，
[0123]
r1及r2各自獨立地為氫、烷基、烯基、或炔基，
[0124]
r3為烷基、烯基、或炔基，
[0125]
x1及x2各自獨立地為鹵素]
[0126]
式(1)中，a優選包含至少1個氮原子作為環成員原子。a優選為5或6元環。a優選為芳香族雜環。雖無特別限定，但a優選為吡啶環或吡唑環。
[0127]
式(1)中，r1～r3的烷基、烯基、及炔基可以為直鏈狀，也可以為支鏈狀。r1～r3的烷基、烯基、及炔基可以被取代基取代，也可以未取代。作為前述取代基，例如，可以舉出鹵素(氟、氯、溴、或碘)。具有取代基的情況下，作為取代基的數量，例如，可以舉出1個、2個或3個。
[0128]
式(1)中，r1～r3的烷基各自獨立地優選為碳原子數1～6的烷基，更優選為碳原子數1～3的烷基，進一步優選為甲基。r1～r3的烯基各自獨立地優選為碳原子數2～6的烯基，更優選為碳原子數2～4的烯基。r1～r3的炔基各自獨立地優選為碳原子數2～6的炔基，更優選為碳原子數2～4的炔基。
[0129]
式(1)中，從aldh2活性及代謝穩定性的觀點考慮，r1優選為氫或烷基，更優選為氫或甲基，進一步優選為氫。
[0130]
式(1)中，從aldh2活性及代謝穩定性的觀點考慮，r2優選為氫或烷基，更優選為氫或甲基，進一步優選為氫。
[0131]
式(1)中，從代謝穩定性的觀點考慮，r3優選為被鹵素取代的烷基或未取代的烷基，更優選為被氟取代的甲基或未取代的甲基，進一步優選為未取代的甲基。
[0132]
式(1)中，x1優選為氟、氯、溴、或碘，更優選為氟或氯，進一步優選為氟。
[0133]
式(1)中，x2優選為氟、氯、溴、或碘，更優選為氟或氯，進一步優選為氟。
[0134]
式(1)表示的化合物沒有特別限定，優選為下述式(2)或(3)表示的化合物。
[0135]
[化學式7]
[0136][0137]
[化學式8]
[0138][0139]
[式中，r1、r2、r3、x1及x2如上所述]
[0140]
式(1)表示的化合物沒有特別限定，但優選為下述的化合物。
[0141]
[化學式9]
[0142][0143]
作為上述的化合物的前藥，例如，可以舉出磷酸化前藥，更具體而言，可以舉出r1為-ch
2-o-po3h2的前藥、及作為a的環成員原子的氮原子中的至少1個被-ch
2-o-po3h2取代的前藥。
[0144]
前藥或其醫藥上可容許的鹽沒有特別限定，但優選為下述的化合物。
[0145]
[化學式10]
[0146][0147]
上述的化合物或前藥的醫藥上可容許的鹽只要能用作醫藥即可，沒有特別限定，例如，可以舉出鹽酸鹽、硫酸鹽、硝酸鹽、磷酸鹽、氫溴酸鹽等無機酸鹽；富馬酸鹽、馬來酸鹽、蘋果酸鹽、酒石酸鹽、琥珀酸鹽、檸檬酸鹽、甲磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽、乙酸鹽、乳酸鹽、棕櫚酸鹽等有機酸鹽；堿金屬鹽；及堿土金屬鹽。
[0148]
上述的化合物、其醫藥上可容許的鹽或它們的前藥也可以形成水合物等溶劑合物。本說明書中，溶劑合物被包括在上述的化合物、其醫藥上可容許的鹽或它們的前藥中。
[0149]
上述的化合物、其醫藥上可容許的鹽或它們的前藥存在立體異構體(例如，對映異構體、非對映異構體)的情況下，各個立體異構體及它們的混合物(例如，消旋體)被包括在上述的化合物、其醫藥上可容許的鹽或它們的前藥中。
[0150]
《乙醛脫氫酶2激活劑》
[0151]
本發明的一個實施方式涉及aldh2激活劑，其包含上述的化合物、其醫藥上可容許的鹽或它們的前藥。本實施方式的aldh2激活劑不僅aldh2激活作用優異，而且具有更優異的性質(例如，優異的代謝穩定性，抑制反應性代謝物的生成，避免對herg的抑制)。
[0152]
通過使用本實施方式的aldh2激活劑，能夠治療及/或預防與aldh2相關的疾病。
[0153]
《醫藥組合物以及治療及/或預防藥》
[0154]
本發明的一個實施方式涉及醫藥組合物，其包含上述的化合物、其醫藥上可容許的鹽或它們的前藥。另外，本發明的一個實施方式涉及治療及/或預防藥，其包含上述的化合物、其醫藥上可容許的鹽或它們的前藥。
[0155]
作為本實施方式的醫藥組合物以及治療及/或預防藥的對象疾病，例如，可舉出范科尼貧血、骨質疏松癥、非酒精性脂肪性肝病(nafld)、非酒精性脂肪性肝炎(nash)、酒精性肝損傷、胰腺炎、缺血再灌注損傷、外周動脈疾病、阿爾茨海默病、帕金森氏病、食道癌、頭頸癌、及疼痛等。
[0156]
本實施方式的醫藥組合物以及治療及/或預防藥可以經口或非經口地施予。作為經口施予用的劑型，例如，可舉出片劑、丸劑、顆粒劑、散劑、膠囊劑、糖漿劑、乳劑、及混懸劑。作為非經口施予用的劑型，例如，可舉出注射劑、注入劑、點滴劑、滴眼劑及栓劑。
[0157]
本實施方式的醫藥組合物以及治療及/或預防藥可以根據需要包含賦形劑、粘合劑、潤滑劑、崩解劑、甜味劑、表面活性劑、懸浮劑、乳化劑、著色劑、防腐劑、芳香劑、矯味劑、穩定劑、增粘劑等。
[0158]
本實施方式的醫藥組合物以及治療及/或預防藥的施予量(以有效成分為基準)根據患者的狀態、體重、化合物的種類、疾病的種類、施予途徑等而不同，醫生可以確定適當的量。作為一例，在治療范科尼貧血、骨質疏松癥、非酒精性脂肪性肝病(nafld)、非酒精性脂肪性肝炎(nash)、酒精性肝損傷、胰腺炎、缺血再灌注損傷、外周動脈疾病、阿爾茨海默病、帕金森氏病、食道癌、頭頸癌、及疼痛等時，對于成人(體重為約60kg)而言，在經口施予的情況下，可以施予1～2000(mg)，在非經口施予的情況下，可以施予0.01～200(mg)。
[0159]
《化合物的制造方法》
[0160]
上述的化合物或其醫藥上可容許的鹽可以適宜地利用已知的方法合成。作為合成方法的一例，可以舉出下述的合成路徑a。
[0161]
[化學式11]
[0162]
《合成路徑a》
[0163][0164]
[r2、r3、x1及x2如上所述，xa及xb各自獨立地為鹵素。]
[0165]
工序a1中，使用碘甲烷將化合物(a1)酯化，得到化合物(a2)。
[0166]
工序a2中，使化合物(a2)與還原劑(例如，硼氫化鈉)反應，得到化合物(a3)。
[0167]
工序a3中，使化合物(a3)與強堿(例如，氫化鈉)反應后，使其與提供r3的鹵化物(例如，碘甲烷)反應，得到化合物(a4)。
[0168]
工序a4中，使用氰基化試劑(例如，氰化鋅)將化合物(a4)氰基化，得到化合物(a5)。
[0169]
工序a5中，使化合物(a5)與還原劑(例如，硼烷二甲硫醚絡合物)反應，得到化合物(a6)。
[0170]
工序a6中，使化合物(a6)與化合物(a7)反應，得到化合物(a8)。
[0171]
工序a7中，使化合物(a8)與雙(頻哪醇合)二硼反應，得到化合物(a9)。
[0172]
工序a8中，使化合物(a9)與2-鹵代吡啶3-甲醛反應，得到化合物(a10)。
[0173]
工序a9中，使化合物(a10)與還原劑(例如，硼氫化鈉)或提供r2的格氏試劑反應，得到化合物(a11)。
[0174]
作為上述的化合物或其醫藥上可容許的鹽的其他合成方法，也可以舉出下述的合成路徑b。
[0175]
[化學式12]
[0176]
《合成路徑b》
[0177][0178]
[r2、r3、x1及x2如上所述，xc為鹵素。]
[0179]
工序b1中，使化合物(b1)與化合物(b2)反應，得到化合物(b3)。
[0180]
工序b2中，使化合物(b3)與化合物(a6)反應，得到化合物(b4)。
[0181]
工序b3中，使化合物(b4)與還原劑(例如，硼氫化鈉)反應，得到化合物(b5)。
[0182]
作為上述的化合物或其醫藥上可容許的鹽的其他合成方法，也可以舉出下述的合成路徑c。
[0183]
[化學式13]
[0184]
《合成路徑c》
[0185][0186]
[r1～r3、x1及x2如上所述，xd為鹵素。]
[0187]
工序c1中，使化合物(c1)與化合物(a9)反應，得到化合物(c2)。
[0188]
上述的化合物或其醫藥上可容許的鹽的合成方法不限于上述合成路徑a～c，本領域技術人員可以根據最終化合物的結構而適宜地設定適當的合成路線及反應條件。例如，最終化合物具有吡啶環以外的雜環(例如吡唑環)的情況下，代替合成路徑c中的化合物(c1)而使用具有對應的雜環的化合物即可。
[0189]
對于上述的化合物或其醫藥上可容許的鹽的前藥而言，利用已知的方法導入例如磷酸基來合成即可。
[0190]
式(1)表示的化合物、其醫藥上可容許的鹽或它們的前藥存在立體異構體的情況
下，可以利用已知的方法對各異構體進行拆分。作為已知的方法，例如，可以舉出色譜法、酶法、及結晶法。
[0191]
實施例
[0192]
以下，使用實施例及比較例對本發明進行更詳細的說明，但本發明的技術范圍不限于此。
[0193]
[制造例1-1]
[0194]
4-溴-2-氟苯甲酸甲酯
[0195]
[化學式14]
[0196][0197]
于室溫向4-溴-2-氟苯甲酸(30g，0.14mol)、碳酸鉀(38g，0.27mol)、及n,n-二甲基甲酰胺(dmf)(300ml)的混合物中加入碘甲烷(16ml，0.27mol)，于相同溫度攪拌16小時。向反應混合物中加入水(200ml)，用乙酸乙酯(300ml)萃取。用硫酸鈉使有機層干燥，在減壓下將溶劑蒸餾除去，得到標題化合物(30g)。
[0198]1h-nmr波譜(cdcl3)δ(ppm):3.94(3h,s),7.81(1h,s,j＝16hz),7.32(2h,m).
[0199]
[制造例1-2]
[0200]
(4-溴-2-氟苯基)甲醇
[0201]
[化學式15]
[0202][0203]
于0℃，經30分鐘將硼氫化鈉(0.38g，10mmol)加入制造例1-1中得到的4-溴-2-氟苯甲酸甲酯(30g，0.13mol)與甲醇(300ml)的混合物中，于60℃攪拌16小時。向反應混合物中加入水(20ml)，在減壓下將反應混合物中的甲醇蒸餾除去。向反應混合物中加入水(250ml)，用二氯甲烷(200ml，2次)萃取。將2個有機層合并，用硫酸鈉使有機層干燥，在減壓下將溶劑蒸餾除去，得到標題化合物(25g)。
[0204]1h-nmr波譜(cdcl3)δ(ppm):4.72(2h,s),7.25(1h,m),7.34(2h,m).
[0205]
[制造例1-3]
[0206]
4-溴-2-氟-1-(甲氧基甲基)苯
[0207]
[化學式16]
[0208][0209]
于0℃，經20分鐘將制造例1-2中得到的(4-溴-2-氟苯基)甲醇(25g，0.12mol)與dmf(50ml)的混合物加入60％氫化鈉(7.3g，0.18mol)與dmf(150ml)的混合物中。于室溫向反應混合物中加入碘甲烷(15ml，0.24mol)，于相同溫度攪拌16小時。將反應混合物冷卻至0
℃，加入冰冷卻水(500ml)，用乙酸乙酯(250ml，接著150ml)萃取。將2個有機層合并，用硫酸鈉使有機層干燥，在減壓下將溶劑蒸餾除去，得到標題化合物(20g)。
[0210]1h-nmr波譜(cdcl3)δ(ppm):3.40(3h,s),4.47(2h,s),7.23(1h,m),7.28(2h,m).
[0211]
[制造例1-4]
[0212]
3-氟-4-(甲氧基甲基)苯甲腈
[0213]
[化學式17]
[0214][0215]
使用氬氣，對制造例1-3中得到的4-溴-2-氟-1-(甲氧基甲基)苯(20g，91mmol)、鋅粉(0.29g，4.6mmol)、氰化鋅(16g，0.14mol)、及dmf(250ml)的混合物進行脫氣置換。于相同溫度向反應混合物中加入三(二亞芐基丙酮)二鈀(0)(4.2g，4.6mmol)及1,1
’?
雙(二苯基膦基)二茂鐵(5.1g，9.1mmol)，再次使用氬氣進行脫氣置換。于100℃將反應混合物攪拌16小時。向反應混合物中加入水(500ml)，用乙酸乙酯(500ml，接著200ml)萃取。將2個有機層合并，用硫酸鈉使有機層干燥，在減壓下將溶劑蒸餾除去。利用硅膠柱色譜法(15～20％乙酸乙酯-正己烷溶液)對殘余物進行純化，得到標題化合物(10g)。
[0216]1h-nmr波譜(cdcl3)δ(ppm):3.45(3h,s),4.56(2h,s),7.35(1h,d,j＝9.2hz),7.48(1h,d,j＝8hz),7.58(1h,t,j＝14hz).
[0217]
[制造例1-5]
[0218]
(3-氟-4-(甲氧基甲基)苯基)甲胺鹽酸鹽
[0219]
[化學式18]
[0220][0221]
于0℃，經20分鐘將硼烷-二甲硫醚絡合物(18ml，0.24mol)滴加至制造例1-4中得到的3-氟-4-(甲氧基甲基)苯甲腈(10g，61mmol)與四氫呋喃(thf)(100ml)的混合物中，于80℃攪拌16小時。將反應混合物冷卻至0℃，于相同溫度加入甲醇(25～30ml)，在減壓下將溶劑蒸餾除去。向殘余物中加入二氯甲烷(100ml)，加入足以形成鹽的量的4m鹽酸-1,4-二氧雜環己烷溶液，于室溫攪拌30分鐘。在減壓下將溶劑蒸餾除去，用乙醚對殘余物進行洗滌，得到標題化合物(5.0g)。
[0222]1h-nmr波譜(dmso-d6)δ(ppm):3.37(3h,s),4.00(2h,s),4.54(2h,s),7.31(1h,d,j＝7.6hz),7.39(1h,d,j＝11hz),7.46(1h,t,j＝7.6hz),8.19(3h,s).
[0223]
[制造例1-6]
[0224]
5-溴-2-氟-n-(3-氟-4-(甲氧基甲基)芐基)苯甲酰胺
[0225]
[化學式19]
[0226][0227]
于0℃，向5-溴-2-氟苯甲酸(5.0g，23mmol)、制造例1-5中得到的(3-氟-4-(甲氧基甲基)苯基)甲胺鹽酸鹽(5.6g，27mmol)、及dmf(50ml)的混合物中依次加入二異丙基乙基胺(13ml，46mmol)和丙烷磷酸酐(15ml，46mmol)。于室溫將反應混合物攪拌3小時。向反應混合物中加入水(200ml)，攪拌30分鐘。濾取所生成的固體，用水(100ml，2次)清洗。在減壓下使固體干燥，得到標題化合物(5.2g)。
[0228]1h-nmr波譜(dmso-d6)δ(ppm):3.28(3h,s),4.46(4h,m),7.16(2h,m),7.40(2h,m),7.78(2h,m),9.03(1h,m)
[0229]
[制造例1-7]
[0230]
2-氟-n-(3-氟-4-(甲氧基甲基)芐基)-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜環戊硼烷-2-基)苯甲酰胺
[0231]
[化學式20]
[0232][0233]
使用氬氣，對制造例1-6中得到的5-溴-2-氟-n-(3-氟-4-(甲氧基甲基)芐基)苯甲酰胺(4.0g，19mmol)、雙(頻哪醇合)二硼(6.8g，10mmol)、乙酸鉀(3.5g，9.1mmol)、及dmf(50ml)的混合物進行脫氣置換。于相同溫度向反應混合物中加入(1,1
’?
雙(二苯基膦基)二茂鐵)二氯化鈀(0.16g，0.23mmol)，再次使用氬氣進行脫氣置換。于100℃將反應混合物攪拌16小時。向反應混合物中加入水(100ml)，用乙酸乙酯(100ml，2次)萃取。將2個有機層合并，用硫酸鈉使有機層干燥，在減壓下將溶劑蒸餾除去。利用硅膠柱色譜法(15～20％乙酸乙酯-正己烷溶液)對殘余物進行純化，作為粗體而得到標題化合物(4g)。不進行進一步純化地用于后面的反應。
[0234]
[制造例1-8]
[0235]
2-氟-n-(3-氟-4-(甲氧基甲基)芐基)-5-(3-甲酰基吡啶-2-基)苯甲酰胺
[0236]
[化學式21]
[0237][0238]
使用氮氣，對制造例1-7中得到的2-氟-n-(3-氟-4-(甲氧基甲基)芐基)-5-(4,4,
正己烷溶液)對殘余物進行純化，得到標題化合物(0.23g)。
[0251]1h-nmr波譜(dmso-d6)δ(ppm):1.23(3h,d,j＝6.4hz),3.28(3h,s),4.42(2h,s),4.48(2h,d,j＝6hz),4.77-4.81(1h,m),5.30(1h,d,j＝4hz),7.13-7.18(2h,m),7.36-7.46(3h,m),7.64-7.67(1h,m),7.72-7.75(1h,m),8.03-8.04(1h,d,j＝6.4hz),8.52-8.54(1h,m),9.03(1h,t,j＝6hz).
[0252]
[實施例3及4]
[0253]
手性2-氟-n-(3-氟-4-(甲氧基甲基)芐基)-5-(3-(1-羥基乙基)吡啶-2-基)苯甲酰胺
[0254]
[化學式24]
[0255][0256]
針對實施例2中得到的外消旋的2-氟-n-(3-氟-4-(甲氧基甲基)芐基)-5-(3-(1-羥基乙基)吡啶-2-基)苯甲酰胺(0.80g)，使用超臨界流體色譜法(sfc)將鏡像異構體分離(chiralpak-ig，含有0.2％三乙胺的20％甲醇-二氧化碳)。得到早溶出的鏡像異構體(0.26g，實施例3)和晚溶出的鏡像異構體(0.32g，實施例4)。
[0257]
[制造例5-1]
[0258]
4-((二氟甲氧基)甲基)-3-氟苯甲腈
[0259]
[化學式25]
[0260][0261]
于室溫，向4-(羥基甲基)-3-氟苯甲腈(1.0g，6.6mmol)與二氯甲烷(5ml)的混合物中依次加入2n氫氧化鈉水溶液(0.53g，13mmol)和(溴二氟甲基)三甲基硅烷(1.6ml，9.9mmol)，于相同溫度攪拌48小時。向反應混合物中加入水，用二氯甲烷(50ml，2次)萃取。將有機層合并，用飽和食鹽水清洗，接著用硫酸鈉干燥。在減壓下將溶劑蒸餾除去。利用硅膠柱色譜法(2％乙酸乙酯-正己烷溶液)對殘余物進行純化，得到標題化合物(0.25g)。
[0262]1h-nmr波譜(dmso-d6)δ(ppm):5.05(2h,s),6.82(1h,t,j＝75hz),7.69-7.76(2h,m),7.91(1h,d,j＝9.2hz).
[0263]
[制造例5-2]
[0264]
(4-((二氟甲氧基)甲基)-3-氟苯基)甲胺
[0265]
[化學式26]
[0266][0267]
于0℃，向制造例5-1中得到的4-((二氟甲氧基)甲基)-3-氟苯甲腈(0.30g，1.5mmol)與甲醇(5ml)的混合物中緩慢地加入六水合氯化鎳(ii)(39mg，0.30mmol)和硼氫化鈉(0.17g，4.5mmol)，于相同溫度攪拌1小時。向反應混合物中加入冰水，用二氯甲烷(25ml，2次)萃取。將2個有機層合并，用飽和食鹽水對有機層進行清洗，接著用硫酸鈉干燥。在減壓下將溶劑蒸餾除去。利用硅膠柱色譜法(8％甲醇-二氯甲烷溶液)對殘余物進行純化，得到標題化合物(200mg)。
[0268]1h-nmr波譜(dmso-d6)δ(ppm):3.72(2h,s),4.91(2h,s),6.77(1h,t,j＝75hz),7.15-7.23(2h,m),7.37-7.41(1h,m).
[0269]
[制造例5-3]
[0270]
5-(3-乙酰基吡啶-2-基)-2-氟苯甲酸
[0271]
[化學式27]
[0272][0273]
于室溫將碳酸鉀(4.5g，33mmol)加入3-羧基-4-氟苯硼酸(3.0g，16mmol)、3-乙酰基-2-溴吡啶(3.3g，16mmol)、1,4-二氧雜環己烷(30ml)、及水(10ml)的混合物中，使用氮氣進行脫氣置換。于相同溫度向反應混合物中加入(1,1
’?
雙(二苯基膦基)二茂鐵)二氯化鈀二氯甲烷復合物(0.67g，0.82mmol)，于100℃攪拌16小時。使反應混合物成為室溫，在減壓下將溶劑蒸餾除去。向殘余物中加入二氯甲烷(75ml)，進行過濾，用二氯甲烷(75ml)對殘余物進行清洗。對于濾液，在減壓下將溶劑蒸餾除去，利用硅膠柱色譜法(10％～12％甲醇-二氯甲烷溶液)對殘余物進行純化，得到標題化合物(2.1g)。
[0274]1h-nmr波譜(dmso-d6)δ(ppm):2.37(3h,s),7.28-7.31(1h,m),7.37-7.42(1h,m),7.70-7.72(1h,m),7.98-8.00(1h,m),8.10-8.12(1h,m),8.76-8.77(1h,m),13.34(1h,bs).
[0275]
[制造例5-4]
[0276]
5-(3-乙酰基吡啶-2-基)-n-(4-((二氟甲氧基)甲基)-3-氟芐基)-2-氟苯甲酰胺
[0277]
[化學式28]
[0278][0279]
在氮氣氛下，于0℃，向制造例5-3中得到的5-(3-乙酰基吡啶-2-基)-2-氟苯甲酸(0.10g，0.39mmol)與dmf(3ml)的混合物中依次加入二異丙基乙基胺(0.21ml，1.2mmol)和丙烷磷酸酐(50％乙酸乙酯溶液)(0.24ml，0.78mmol)，于相同溫度攪拌15分鐘。于相同溫度向反應混合物中加入制造例5-2中得到的(4-((二氟甲氧基)甲基)-3-氟苯基)甲胺(79mg，0.39mmol)，于室溫攪拌16小時。向反應混合物中加入水，用乙酸乙酯(20ml，2次)萃取。將2個有機層合并，用飽和食鹽水對有機層進行清洗，接著用硫酸鈉干燥。在減壓下將溶劑蒸餾除去，利用硅膠柱色譜法(55％乙酸乙酯-正己烷溶液)對殘余物進行純化，得到標題化合物(60mg)。
[0280]1h-nmr波譜(dmso-d6)δ(ppm):2.38(3h,s),4.02(2h,d,j＝5.6hz),4.93(2h,s),6.71(1h,t,j＝74hz),7.18-7.21(1h,m),7.44-7.79(4h,m),7.78-7.79(1h,m),8.11(1h,d,j＝7.6hz),8.76-8.77(1h,m),9.05-9.06(1h,m).
[0281]
[實施例5]
[0282]
n-(4-((二氟甲氧基)甲基)-3-氟芐基)-2-氟-5-(3-(1-羥基乙基)吡啶-2-基)苯甲酰胺
[0283]
[化學式29]
[0284][0285]
于0℃，向制造例5-4中得到的5-(3-乙酰基吡啶-2-基)-n-(4-((二氟甲氧基)甲基)-3-氟芐基)-2-氟苯甲酰胺(0.15g，0.34mmol)與甲醇(3ml)的混合物中緩慢地加入硼氫化鈉(26mg，0.69mmol)，于室溫攪拌6小時。向反應混合物中加入水，用乙酸乙酯(30ml，2次)萃取。將2個有機層合并，用飽和食鹽水對有機層進行清洗，接著用硫酸鈉干燥。在減壓下將溶劑蒸餾除去。利用硅膠柱色譜法(55％乙酸乙酯-正己烷溶液)對殘余物進行純化，得到標題化合物(30mg)。
[0286]1h-nmr波譜(dmso-d6)δ(ppm):1.27(3h,d,j＝6.4hz),4.49(2h,d,j＝5.6hz),4.77-4.81(1h,m),4.93(2h,s),5.30(1h,j＝4hz),6.78(1h,t,j＝75hz),7.18-7.21(2h,m),7.39-7.47(3h,m),7.64-7.68(1h,m),7.73-7.75(1h,m),8.03(1h,d,j＝8hz),8.53(1h,d,j＝4.8hz),9.05(1h,t,j＝5.6hz).
[0287]
[制造例6-1]
[0288]
2-溴-3-(甲氧基甲基)吡啶
[0289]
[化學式30]
[0290][0291]
于0℃向60％氫化鈉(0.057g，2.4mmol)與thf(3ml)的混合物中加入(2-溴吡啶-3-基)甲醇(0.30g，1.6mmol)與thf(3ml)的混合物。于室溫向反應混合物中加入碘甲烷(0.15ml，2.4mm ol)，于相同溫度攪拌16小時。將反應混合物冷卻至0℃，加入冰冷卻水，用乙酸乙酯(15ml，接著5ml)萃取。將2個有機層合并，用硫酸鈉使有機層干燥，在減壓下將溶劑蒸餾除去，作為粗體而得到標題化合物(0.15g)。不進行進一步純化地用于后面的反應。
[0292]
[實施例6]
[0293]
2-氟-n-(3-氟-4-(甲氧基甲基)芐基)-5-(3-(甲氧基甲基)吡啶-2-基)苯甲酰胺
[0294]
[化學式31]
[0295][0296]
使用氬氣，對制造例6-1中得到的2-溴-3-(甲氧基甲基)吡啶(49mg)、制造例1-7中得到的2-氟-n-(3-氟-4-(甲氧基甲基)芐基)-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜環戊硼烷-2-基)苯甲酰胺(0.10g)、碳酸鈉(0.050g，0.47mmol)、1,4-二氧雜環己烷(3ml)、及水(0.5ml)的混合物進行脫氣置換。于相同溫度向反應混合物中加入(1,1
’?
雙(二苯基膦基)二茂鐵)二氯化鈀二氯甲烷復合物(8.0mg，0.0098mmol)，再次使用氬氣進行脫氣置換，于80℃將反應混合物攪拌16小時。使反應混合物成為室溫，加入水(5ml)，用乙酸乙酯(10ml，接著5ml)萃取。將2個有機層合并，用硫酸鈉使有機層干燥，在減壓下將溶劑蒸餾除去。利用硅膠柱色譜法(20％乙酸乙酯-正己烷溶液)對殘余物進行純化，得到標題化合物(0.080g)。
[0297]1h-nmr波譜(dmso-d6)δ(ppm):3.28(3h,s),3.29(3h,s),4.36(2h,s),4.42(2h,s),4.48(2h,d,j＝6hz),7.13-7.18(2h,m),7.36-7.45(3h,m),7.75-7.79(1h,m),7.87-7.89(1h,m),7.91-7.93(1h,m),8.61-8.63(1h,m),9.01(1h,t,j＝11hz).
[0298]
[制造例7-1]
[0299]
(5-碘-1h-吡唑-4-基)甲醇
[0300]
[化學式32]
[0301][0302]
于0℃向5-碘-1h-吡唑-4-甲酸乙酯(4.0g，15mmol)與thf(4ml)的混合物中滴加硼烷-thf溶液(1m thf溶液，30ml)。于室溫將反應混合物攪拌1小時。于相同溫度向反應混合
物中滴加甲醇(20ml)，攪拌30分鐘。對于反應混合物，在減壓下將溶劑蒸餾除去。利用高效液相色譜法對殘余物進行純化，得到標題化合物(1.5g)。
[0303]
esi-ms:m/z 224.9[m+1]
+
[0304]
[制造例7-2]
[0305]
(3-氟-4-(甲氧基甲基)苯基)甲胺
[0306]
[化學式33]
[0307][0308]
向制造例1-4中記載的3-氟-4-(甲氧基甲基)苯甲腈(8.0g，48mmol)與甲醇(50ml)的混合物中加入雷尼鎳(20g)，在氫氣氛下，于室溫攪拌一整夜。利用氮對反應混合物進行脫氣置換，使用硅藻土進行過濾。對于濾液，在減壓下將溶劑蒸餾除去，作為粗體而得到標題化合物(7.5g)。作為粗體而直接用于后面的反應。
[0309]
[制造例7-3]
[0310]
5-溴-2-氯-n-(3-氟-4-(甲氧基甲基)芐基)苯甲酰胺
[0311]
[化學式34]
[0312][0313]
將5-溴-2-氯苯甲酸(1.9g，8.1mmol)與亞硫酰氯(15ml)的混合物加熱回流1.5小時。使反應混合物成為室溫，在減壓下將溶劑蒸餾除去。于0℃向殘余物與二氯甲烷(30ml)的混合物中滴加制造例7-2中得到的粗體(3-氟-4-(甲氧基甲基)苯基)甲胺(1.4g)、三乙胺(1.2g，12mmol)及二氯甲烷(15ml)的混合物。于室溫將反應混合物攪拌一整夜。于室溫向反應混合物中加入水，用二氯甲烷萃取(50ml，3次)。用飽和食鹽水對有機層進行清洗后，用硫酸鈉干燥，在減壓下將溶劑蒸餾除去。利用硅膠柱色譜法(石油醚/乙酸乙酯＝2/1)對殘余物進行純化，得到標題化合物(1.1g)。
[0314]
esi-ms:m/z 386.0[m+1]
+
[0315]
[制造例7-4]
[0316]
2-氯-n-(3-氟-4-(甲氧基甲基)芐基)-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜環戊硼烷-2-基)苯甲酰胺
[0317]
[化學式35]
[0318][0319]
于室溫，向制造例7-3中得到的5-溴-2-氯-n-(3-氟-4-(甲氧基甲基)芐基)苯甲酰胺(1.1g，2.8mmol)、雙(頻哪醇合)二硼(0.87g，3.4mmol)、1,4-二氧雜環己烷(20ml)的混合物中加入乙酸鉀(0.84g，8.5mmol)和(1,1
’?
雙(二苯基膦基)二茂鐵)二氯化鈀(0.21g，0.28mmol)。于95℃將反應混合物攪拌3小時。使反應混合物成為室溫，向反應混合物中加入水，用乙酸乙酯萃取(50ml，3次)。用飽和食鹽水對有機層進行清洗，用硫酸鈉干燥。在減壓下將溶劑蒸餾除去，得到標題化合物(0.80g)。
[0320]
esi-ms:m/z 434.1[m+1]
+
[0321]
[實施例7]
[0322]
2-氯-n-(3-氟-4-(甲氧基甲基)芐基)-5-(4-(羥基甲基)-1h-吡唑-3-基)苯甲酰胺
[0323]
[化學式36]
[0324][0325]
于室溫，向制造例7-4中得到的2-氯-n-(3-氟-4-(甲氧基甲基)芐基)-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜環戊硼烷-2-基)苯甲酰胺(0.40g，0.92mmol)、制造例7-1中得到的(5-碘-1h-吡唑-4-基)甲醇(310mg，1.4mmol)、正丙醇(9ml)、及水(6ml)的混合物中加入碳酸鈉(750mg，2.3mmol)和[1,1
’?
雙(二苯基膦基)二茂鐵]二氯化鈀(ii)(70mg，0.090mmol)，于95℃攪拌一整夜。使反應混合物成為室溫，在減壓下將溶劑蒸餾除去。利用高效液相色譜法對殘余物進行純化，得到標題化合物(57mg)。
[0326]1h-nmr波譜(cd3od)δ(ppm):3.40(3h,s),4.53(2h,s),4.61(4h,d,j＝9.0hz),7.20(1h,d,j＝10.9hz),7.26(1h,d,j＝7.9hz),7.43(1h,t,j＝7.6hz),7.58(1h,s),7.70-7.99(3h,m).
[0327]
[比較例1]
[0328]
將作為市售品的下述化合物用作比較例1。需要說明的是，下述化合物為國際公開第2008/112164號公報中記載的化合物。
[0329]
[化學式37]
[0330][0331]
[比較例2]
[0332]
按照國際公開第2015/127137號公報中記載的方法合成下述化合物，用作比較例2。
[0333]
[化學式38]
[0334][0335]
[比較例3]
[0336]
按照國際公開第2019/151241號公報中記載的方法合成下述化合物，用作比較例3。
[0337]
[化學式39]
[0338][0339]
[比較例4]
[0340]
按照國際公開第2019/151241號公報中記載的方法合成下述化合物，用作比較例4。
[0341]
[化學式40]
[0342][0343]
[比較例5]
[0344]
按照國際公開第2019/151241號公報中記載的方法合成下述化合物，用作比較例5。
[0345]
[化學式41]
[0346][0347]
[比較例6]
[0348]
按照國際公開第2019/151241號公報中記載的方法合成下述化合物，用作比較例6。
[0349]
[化學式42]
[0350][0351]
[試驗例1：aldh2激活作用]
[0352]
利用以下的方法測定試驗化合物針對由aldh2引起的乙醛的氧化速度的激活作用。使用市售的picoprobe
tm
乙醛脫氫酶活性檢測試劑盒(aldehyde dehydrogenase activity assay kit)(biovision inc.制)，參考商品的操作說明書，在以下的條件下實施試驗。利用移液管，向384孔板的各孔中依次添加以下(1)至(3)。
[0353]
(1)將人重組aldh2酶(biovision inc.制)以成為3μg/ml的方式溶解于aldh檢測緩沖液(assay buffer)中進行稀釋而得到的溶液10μl。
[0354]
(2)使用aldh檢測緩沖液制備的30μm或90μm的試驗化合物溶液10μl(包含3％dmso)。
[0355]
(3)按aldh檢測緩沖液8.6μl、picoprobe 0.6μl、底物混合物(substrate mix)0.3μl、及乙醛1.5μl的比率構成的反應混合物(reaction mix)10μl。
[0356]
在添加上述(3)之前，于室溫孵育(incubation)5分鐘。另外，在添加(3)之后，使用ensight(perkinelmer inc.制)，于室溫，在180分鐘內，每2.5分鐘測定一次熒光強度。熒光強度使用了激發波長(excitation)為535nm、發射波長(emission)為587nm的波長。
[0357]
將不添加試驗化合物的情況下的乙醛的氧化速度設為100％時的、添加了試驗化合物的情況下的氧化速度示于表1中。由表1的結果確認到，實施例1～7的化合物具有aldh2激活作用。
[0358]
[表1]
[0359]
表1
[0360][0361]
[試驗例2：使用了小鼠肝微粒體的代謝穩定性]
[0362]
利用以下的方法對小鼠肝微粒體中的代謝穩定性進行評價。
[0363]
1.材料
[0364]
(1)小鼠肝微粒體：20mg/ml
[0365]
(2)試驗化合物：1.1mm dmso溶液
[0366]
(3)磷酸鉀緩沖液：66.7mm(ph7.4)
[0367]
(4)nadph溶液：10mm磷酸鉀緩沖液
[0368]
(5)淬滅溶液：添加有華法林作為內標物質的0.5％甲酸-乙腈溶液
[0369]
2.方法
[0370]
向丙烯管中裝入971.5μl的磷酸鉀緩沖液和27.5μl的小鼠肝微粒體，使其懸浮。向其中加入1μl的試驗化合物，將該混合物中的180μl移至另一個管中。于37℃對混合物進行5分鐘預孵育，然后，加入20μl的nadph溶液(孵育時間為30分鐘的情況)或20μl的磷酸鉀緩沖液(孵育時間為0分鐘的情況)。在孵育后，加入200μl的淬滅溶液，使反應停止。接著，以3220
×
g離心分離20分鐘，利用lc-ms/ms對200μl的上清液中的試驗化合物的未變化體濃度進行測定。基于所得到的未變化體的峰面積，將孵育時間0分鐘時設為100％，算出未變化體的殘存率(％)。
[0371]
3.結果
[0372]
將30分鐘后的未變化體的殘存率(％)示于表2中。確認到：與以往的aldh2激活劑相比，實施例1～7的化合物在小鼠肝微粒體中的代謝穩定性優異。
[0373]
[表2]
[0374]
表2
[0375] 殘存率(％)實施例190實施例268實施例364實施例460實施例552實施例624
實施例774比較例1＜1比較例26比較例31比較例4＜1比較例5＜1比較例61
[0376]
[試驗例3：使用了人肝微粒體的代謝穩定性]
[0377]
針對在小鼠肝微粒體試驗中確認了穩定性的實施例1、2、5及6的化合物，測定使用了人肝微粒體的代謝穩定性。具體方法如下所述。
[0378]
2.方法
[0379]
(1)各分取50μl用β-nadph溶液稀釋而得的0.2μmol/l試驗化合物。
[0380]
(2)各添加50μl 0.2mg蛋白質/ml人肝微粒體溶液(反應時間為0分鐘的試樣除外)。
[0381]
(3)于37℃，一邊振蕩一邊孵育30分鐘。(反應試樣中的濃度：0.1μmol/l試驗化合物，0.1mg蛋白質/ml人肝微粒體)
[0382]
(4)孵育后，添加甲醇400μl，使反應停止。
[0383]
(5)向反應時間為0分鐘的試樣中添加0.2mg蛋白質/ml肝微粒體溶液50μl。
[0384]
(6)將上述(4)及(5)的試樣于-20℃靜置30分鐘以上后，以4℃、3,000rpm的條件離心分離約10分鐘。
[0385]
(7)利用lc/ms/ms對上清液進行測定，基于所得到的未變化體的峰面積，將孵育時間o分鐘時設為100％，算出未變化體的殘存率(％)。
[0386]
將30分鐘后的未變化體的殘存率(％)示于表3中。
[0387]
[表3]
[0388]
表3
[0389] 殘存率(％)實施例190實施例287實施例572實施例675
[0390]
[試驗例4：反應性代謝物]
[0391]
在人肝微粒體的存在下，利用lc-ms/ms對谷胱甘肽結合體的產生進行測定，由此研究了試驗化合物的反應性代謝物產生風險。具體方法如下所述。
[0392]
1.方法
[0393]
(1)向聚丙烯管中添加20mg/ml的人肝微粒體55ul、66.7mm的磷酸鉀緩沖液(ph7.4)395ul、10mm的谷胱甘肽水溶液550ul。
[0394]
(2)添加20mm的試驗化合物或陽性對照(氯氮平(clozapine)、雷洛昔芬(reloxifen)、雙氯芬酸(dicrofenac))0.55ul。
[0395]
(3)以各180ul的量細分到4個管中，2個標記為t0，2個標記為t60，于37
±
1℃進行5
分鐘預孵育。
[0396]
(4)將10mm的nadph溶液20ul加入t60管中，將磷酸鉀緩沖液20ul加入t0管中。
[0397]
(5)60分鐘后，各加入10％三氯乙酸乙腈溶液200ul，使反應停止。
[0398]
(6)利用離心分離裝置(5810-r，eppendorf)以3220
×
g、20分鐘的條件進行離心分離，針對上清液200ul，利用lc-ms/ms(lc：sil-htc，shimazu，mass：api-4000qtrap，mds sciex)對gsh結合體進行測定。
[0399]
(7)算出在試驗化合物中確認到的gsh結合體的面積/在氯氮平中確認到的gsh結合體的面積之比(％)。
[0400]
2.結果
[0401]
將結果示于表4中。由這些結果確認到，與氯氮平相比，實施例的化合物的反應性代謝物的生成量小。
[0402]
[表4]
[0403]
表4
[0404][0405]
[試驗例5：herg通道抑制作用]
[0406]
利用以下的膜片鉗法研究了試驗化合物的herg(human ether-a-go-go related gene，人類ether-a-go-go相關基因)通道抑制作用。
[0407]
1.方法
[0408]
利用全細胞膜片鉗法記錄了在電位固定的條件下從整個細胞膜通過的herg電流。
[0409]
為了對herg電流進行確認，將保持電位設定為-80mv，-50mv、110msec及20mv、4sec的去極化脈沖之后的-50mv、2sec的復極化脈沖按照每15秒1次的頻率賦予。確認所得到的herg尾電流穩定后，開始應用。在應用過程中也繼續賦予脈沖。
[0410]
采樣頻率設定為5khz，低通濾波器(lowpass filter)設定為2khz。
[0411]
測定中的腔室內的細胞外液的溫度設定為22～25℃。
[0412]
《細胞外液的組成》
[0413]
nacl:137mmol/l，kcl:4mmol/l，cacl2:1.8mmol/l，mg cl2:1mmol/l，d(+)-葡萄糖:10mmol/l，hepes:10mmol/l(用1mol/l naoh將ph調節為7.4)。
[0414]
《電極內液的組成》
[0415]
kcl:130mmol/l，mgcl2:1mmol/l，egta:5mmol/l，mg atp:5mmol/l，hepes:10mmol/l(用1mol/l koh將ph調節為7.2)。
[0416]
《玻璃電極的制作》
[0417]
使用拉制儀(p-97，sutter instrument company)對玻璃細管(g-1.5，株式會社成茂科學器械研究所)進行加工，將充滿電極內液時的電阻值在2～5mω的范圍內的管用于測
定。
[0418]
《測定及分析》
[0419]
對于herg電流而言，使用膜片鉗用放大器(axopatch 200b，molecular devices，llc)進行測定，經由膜片鉗用記錄分析軟件(pclamp 10，molecular devices，llc)將所得到的電信號記錄至計算機上。
[0420]
以-50mv、110msec的去極化脈沖時的電流值為基準求出最大尾電流值，算出相對于試驗化合物應用前的最大尾電流值而言的應用開始5分鐘后的變化率(抑制率)。
[0421]
2.結果
[0422]
將結果示于表5中。由這些結果確認到，實施例的化合物不顯示herg通道抑制作用。
[0423]
[表5]
[0424]
表5
[0425][0426]
[試驗例6：由角叉菜膠誘發的疼痛的抑制效果]
[0427]
本實驗參考science translational medicine 6,2 51ra118(2014).來實施。動物使用了雄性c57bl/6j小鼠(charles river labora tories japan，inc.)，7周齡。為了在足底部誘發機械刺激痛覺超敏(allodynia)，將角叉菜膠皮下施予至小鼠的左后肢足底。使用向左后肢的足底面施加上行彎曲力(0.16克)的馮弗雷細絲(von frey filament)，對誘發180分鐘后的針對機械刺激的逃避反應進行測定。垂直地刺激小鼠6秒鐘直至細絲彎曲，將小鼠的逃避反應按3個等級進行評分(0：無反應或驚愕反應(挪動但未抬足)，1：抬足，2：舔足或晃動)。進行10次刺激，算出10次的評分的合計值(逃避評分)。
[0428]
將化合物(實施例1)溶解于dmso/peg400(1∶1的體積比)中，將2、6或20mg/kg的化合物(背景介質(vehicle)組不包含化合物)以5ml/kg的施予液量在注入角叉菜膠的15分鐘前、注入角叉菜膠之后30分鐘及150分鐘后、共計3次等量地施予至頸背部皮下。角叉菜膠使用生理食鹽液制備成1.5％溶液，以7μl/body的量皮下施予至左后肢足底。
[0429]
關于顯著性檢驗，針對背景介質組與實施例1組的比較，進行steel的多重比較檢驗，算出顯著性水平為5％。在顯著性檢驗中，使用了市售的統計程序sas system(sas software release 9.1.3；sas institute japan ltd)。
[0430]
如表6所示，表明了實施例的化合物抑制由角叉菜膠誘發的疼痛。
[0431]
[表6]
[0432]
表6
[0433][0434]
各值表示平均值
±
se。
[0435]
pre：角叉菜膠施予前
[0436]
*：p＜0.05