一種2’-脫氧-2-氟腺苷的雙酶催化制備方法與流程

本發明涉及2’-脫氧-2-氟腺苷的酶催化，具體涉及到一種2’-脫氧-2-氟腺苷的雙酶催化制備方法。

背景技術：

1、2'-脫氧-2-氟腺苷（2'-deoxy-2'-fluoro-d-adenosine，2'-f-dar）是一種修飾的核苷酸，其結構特征在于腺嘌呤核苷的2'-碳上取代了氫原子，而且這里是氟原子。這種修飾使得該核苷酸在rna分子中的應用具有一些獨特的性質和優勢。

2、2'-脫氧-2-氟腺苷及其衍生物在抗病毒藥物的研發中也有應用。由于rna在一些病毒的復制中起著關鍵作用，通過設計能夠特異性與目標rna結合的分子，可以干擾病毒的復制過程，從而具有抗病毒的潛力。比如說，2'-氟-2'-脫氧腺苷可作為有機合成中間體和醫藥中間體，主要用作實驗室研發過程和化工生產過程中。生物活性2′-deoxy-2′-fluoroadenosine可用于合成可與rna雜交的2'-脫氧-2'chemicalbook-氟修飾的寡核苷酸。

3、經研究得到，2′-deoxy-2′-fluoroadenosine能被大腸桿菌嘌呤核苷磷酸化酶(pnp)有效地裂解成毒性物2-氟腺嘌呤(fade)，對表達大腸桿菌pnp的腫瘤表現出良好的體內活性。

4、上述研究表明2'-f-dar（2'-脫氧-2'-氟腺苷）在存在大腸桿菌嘌呤核苷磷酸化酶（pnp）時，可以被有效地磷酸化并裂解成毒性物質2-氟腺嘌呤（fade）。這個過程對表達大腸桿菌pnp的腫瘤顯示出良好的體內活性，具體原因如下：

5、選擇性殺傷腫瘤細胞：?pnp是一種嘌呤代謝酶，在大腸桿菌中催化嘌呤核苷的磷酸化反應。通過引入2'-f-dar并表達pnp，可以實現對腫瘤細胞的選擇性殺傷。正常細胞可能沒有足夠的pnp表達，因此對它們的影響相對較小，而pnp表達豐富的腫瘤細胞則能夠有效地將2'-f-dar轉化為毒性的fade。

6、活性物質釋放：?2'-f-dar在被磷酸化后被裂解成2-氟腺嘌呤（fade），這是一種具有毒性的嘌呤類化合物。fade可能會導致細胞死亡，從而對腫瘤細胞產生毒性效應。這種方式的活性物質釋放可以提高藥物的局部濃度，增強治療效果。

7、生物安全性：?大腸桿菌是一種廣泛用于生物學研究的微生物，而pnp是其天然的嘌呤代謝酶之一。因此，通過利用大腸桿菌的代謝途徑來處理2'-f-dar，可以提高治療的生物安全性。這樣的方法可能會減少對宿主細胞的不良影響，從而提高治療的安全性。

8、傳統的2'-f-dar的生產采用化學合成的方式。通常涉及多個步驟的有機化學合成過程。雖然合成路線可能因研究者、公司或生產者的具體選擇而有所不同，但通常會包含以下一般步驟：

9、腺苷保護基的引入：?合成通常從腺苷出發，因此首先需要引入適當的保護基，以防止在合成過程中受到不必要的干擾。這可能涉及在特定官能團上引入臨時的化學保護基。

10、2'-脫氧化反應：?下一步通常是通過去氧核糖骨架上的2'-碳，生成2'-脫氧核苷。

11、2'-氟化反應：?在已經得到的2'-脫氧核苷上引入氟原子，從而生成2'-脫氧-2'-氟核苷。

12、去保護基：?在氟原子引入后，需要去除腺苷中的保護基，以還原成活性形式。

13、其他功能基團修飾：?根據具體的設計需求，可能還需要在分子中引入其他功能基團，以滿足所需的性質。

14、這種化學合成方式在一定程度上解決了量產的問題，然而，這種化學合成方式中有些方法會涉及多個中間體的合成和純化步驟，這可能使合成過程相對繁瑣和時間耗費較多，存在收率低、環境污染嚴重、成本高的問題。

15、值得注意的是，為了提高合成效率和產率，有時候會采用新型的有機合成方法或生物酶法，以簡化步驟或提高產物純度。盡管如此，合成2'-f-dar仍然通常是一個相對復雜的有機合成過程。

16、生物酶法具有如下特點：

17、催化劑：?使用生物酶作為催化劑，如酶（enzyme）。

18、選擇性：?酶通常對底物非常具有選擇性，可以催化特定的反應，而不產生不需要的副產物。

19、反應條件：?通常在相對溫和的條件下進行，通常在生物體溫范圍內。ph值和溫度條件相對溫和，有助于維持催化活性。

20、環境友好性：?生物酶法通常對環境友好，減少了對有毒溶劑和高溫高壓反應條件的依賴。

21、底物范圍：?生物酶對底物的適應性較強，但有時候可能會受到特定的酶底物范圍的限制。

22、對此，本發明提出一種2’-脫氧-2-氟腺苷的雙酶催化制備方法。

技術實現思路

1、針對現有技術所存在的不足，本發明目的在于提出一種2’-脫氧-2-氟腺苷的雙酶催化制備方法，具體方案如下：

2、一種2'-脫氧-2-氟腺苷的雙酶催化制備方法，所述制備方法為：

3、將?ectp粗酶液、pnp粗酶液、?2'-f-dur和腺嘌呤a混合成混合液，再將混合液進行催化反應，得產物，產物即?2'-脫氧-2-氟腺苷。

4、進一步的，?pnp粗酶液采用expnp粗酶液、bhpnp粗酶液或者ahdeod粗酶液。

5、進一步的，所述ectp粗酶液的制備過程包括如下步驟：

6、ectp基因片段重組到puc57載體上，得到重組載體ectp；

7、重組載體ectp經限制性內切酶xhoⅰ和speⅰ雙酶切后，得酶切片段ectp；

8、酶切片段ectp與表達載體pbad-hisb在t4?dna連接酶作用下連接過夜，得連接液ectp；

9、連接液ectp轉化top10感受態細胞，得到陽性重組質粒pbad-ectp；

10、將陽性重組質粒pbad-ectp轉化表達宿主菌大腸桿菌bw25113，得到原核表達菌株pbad-ectp-?bw25113；

11、原核表達菌株pbad-ectp-bw25113在加有終濃度為50μg/ml鏈霉素的5ml?2yt液體培養基中振蕩培養過夜后，按體積比1%比例接種于含有終濃度為50μg/ml鏈霉素的100ml2yt液體培養基中振蕩培養，得到培養液ectp；

12、待培養液ectp的od600為0.8-1.0之間時，加入終濃度為0.2?mm的誘導劑阿拉伯糖誘導過夜得誘導菌體ectp；

13、誘導菌體ectp離心后，收集菌體，懸浮于50mm?tris-hcl?ph7.0緩沖液中，超聲破碎，得到ectp粗酶液。

14、進一步的，所述ahdeod粗酶液的制備過程包括如下步驟：

15、ahdeod基因片段重組到puc57載體上，得到重組載體ahdeod；

16、重組載體ahdeod經限制性內切酶xhoⅰ和speⅰ雙酶切后，酶切片段ahdeod；

17、酶切片段ahdeod與表達載體pbad-hisb在t4?dna連接酶作用下連接過夜，得連接液ahdeod；

18、連接液ahdeod轉化top10感受態細胞，得到陽性重組質粒pbad-ahdeod；

19、將陽性重組質粒pbad-ahdeod轉化表達宿主菌大腸桿菌bw25113，得到原核表達菌株pbad-ahdeod-?bw25113；

20、原核表達菌株pbad-ahdeod-bw25113在加有終濃度為50μg/ml鏈霉素的5ml?2yt液體培養基中振蕩培養過夜后，按體積比1%比例接種于含有終濃度為50μg/ml鏈霉素的100ml2yt液體培養基中振蕩培養，得到培養液ahdeod；

21、待培養液ahdeod的od600為0.8-1.0之間時，加入終濃度為0.2?mm的誘導劑阿拉伯糖誘導過夜得誘導菌體ahdeod；

22、誘導菌體ahdeod離心后，收集菌體，懸浮于50mm?tris-hcl?ph7.0緩沖液中，超聲破碎，得到ahdeod粗酶液。

23、進一步的，所述expnp粗酶液和bhpnp粗酶液的制備過程與ahdeod粗酶液的制備過程一致。

24、進一步的，所述ectp基因片段的氨基酸序列如序列表seq?id?no.1所示。

25、進一步的，所述ahdeod基因片段的氨基酸序列如序列表seq?id?no.2所示，所述expnp基因片段的氨基酸序列如序列表seq?id?no.3所示，所述bhpnp基因片段的氨基酸序列如序列表seq?id?no.4所示。

26、進一步的，進行連接過夜時，溫度設為16℃。

27、進一步的，振蕩培養時，培養條件設為37℃、220rpm；

28、進行誘導過夜時，溫度設為30℃。

29、進一步的，進行催化反應時，反應條件設為50℃，220rpm，10小時。

30、與現有技術相比，本發明的有益效果如下：

31、（1）采用本發明的方法，不需要純化酶，直接用分別表達嘌呤核苷磷酸化酶和胸腺嘧啶核苷磷酸化酶的細胞破碎液，在一個反應器內一步反應即可制備2'-f-dar，不涉及中間步驟和反應，極大地簡化了工藝流程，降低了生產成本，且設備利用率高。