一種用于生長緩慢菌株分離培養的方法與流程

本發明專利涉及微生物分離培養方法，尤其是一種用于生長緩慢菌株分離培養的方法。

背景技術：

1、微生物蘊含著豐富的發展潛力，覆蓋了疾病治療、生物能源轉化、生物肥料與農藥研制、食品添加劑改良、水土凈化與改良、垃圾分解等各領域；這些有益的資源菌株，對于促進醫藥、食品、農業、環境等眾多產業發展具有重要意義。

2、然而，自然界中90％以上微生物尚未實現人工培養，被稱為微生物界中的“暗物質”，這極大阻礙了人類對微生物生態的認知以及微生物資源的開發利用。

3、在環境中，那些生長緩慢的菌株在群體中的豐度經常很低，有些卻具有重要的生態功能，使得篩選培養面臨著更大的挑戰。

4、現有技術中，常采用劃線培養法的方式進行篩選等操作，由于劃線培養法的隨機性強，生長緩慢的低豐度微生物常常會被生長速度更快的高豐度微生物掩蓋，使得高精度的篩選操作無法實現。

5、現有技術中，還有一種采用微生物富集方法(即過濾法等)，這種方式只能針對低生物量樣品中微生物的整體富集，難以針對生長緩慢的微生物類群進行富集和篩選；而針對功能性微生物進行篩選的選擇性培養法，同樣很可能由于生長速度問題而使低豐度的生長緩慢菌在篩選過程中丟失。

技術實現思路

1、為了克服現有技術的不足，本發明提供了一種用于生長緩慢菌株分離培養的方法，通過結合磁性顆粒及微生物單細胞彈射分選技術，實現對群體中生長緩慢的低豐度菌株的富集、篩選及培養，有效提高了生長緩慢微生物的分離培養效率，方法設計科學獨到，適合推廣。

2、為解決上述技術問題，本發明提供一種用于生長緩慢菌株分離培養的方法，包括：

3、步驟一：獲取所需微生物樣品；

4、作為一種舉例說明，所述微生物樣品包括：土壤樣品、水體樣品、沉積物樣品、氣體樣品、糞便樣品、尿液樣品、痰液樣品、血液樣品以及動植物組織樣品。

5、步驟二：制備磁性顆粒；

6、將fecl2溶液與fecl3溶液混合，將naoh溶液緩慢逐滴加入上述溶液中，渦旋攪拌，用磁場收集上述磁性顆粒，使用ddh2o清洗，取出磁性顆粒與丙烯胺鹽酸鹽混合，并經超聲、離心操作，沉淀重懸于ddh2o中，渦旋混勻，使用濾器過濾待用；

7、步驟三：將所述微生物樣品與所述磁性顆粒震蕩混合，棄去上清，向沉淀中加入適量培養基，在適宜的條件下對樣品中的微生物進行培養；在培養過程中，生長速度快的菌株隨著分裂增殖逐漸失去磁性，而生長速度緩慢的菌株依然保持磁性；

8、步驟四：使用磁場對微生物樣品中的微生物進行分離，收集沉淀中的微生物；

9、作為一種舉例說明，所述磁場為：磁力架、磁鐵或電磁場中的一種或者組合。

10、步驟五：將沉淀中的微生物用緩沖液重懸，并與用于保持細胞活性的保水物質共同平鋪于分選芯片表面；即，先將半固體保水物質或固體保水物質平鋪于分選芯片的表面形成保水薄層，再將微生物涂于所述保水薄層表面。

11、作為一種舉例說明，所述保水物質為水凝膠保水物質。

12、作為一種舉例說明，所述水凝膠保水物質，其組成成分為：0.5％-10％膠原、1％-10％聚乙二醇、0.1％-10％海藻酸鹽試劑。

13、作為一種舉例說明，所述保水薄層的厚度為：1-100μm。

14、步驟六：使用彈射分選方法將微生物個體逐一分選至裝有適宜的培養基的接收器中，進行培養；收集到的生長緩慢微生物個體，通過后續培養長成菌株。

15、作為一種舉例說明，所述彈射分選方法為：基于激光誘導向前轉移技術的彈射分選。

16、作為一種舉例說明，所述接收器為ep管蓋、培養皿或孔板。

17、本發明的有益效果：

18、本發明使用磁性顆粒對群體中生長速度不同的菌株進行分離，獲得生長速度緩慢的微生物類群，再通過彈射分選技術，將生長緩慢的微生物個體逐一分離后進行培養，從而有效提高生長緩慢微生物篩分培養的成功率及效率。

19、本發明設計方法科學巧妙，很好的解決了現有技術無法克服的技術難題，操作簡便、安全，穩定。

技術特征：

1.一種用于生長緩慢菌株分離培養的方法，其特征在于，包括：

2.根據權利要求1所述的一種用于生長緩慢菌株分離培養的方法，其特征在于，所述微生物樣品包括：土壤樣品、水體樣品、沉積物樣品、氣體樣品、糞便樣品、尿液樣品、痰液樣品、血液樣品以及動植物組織樣品。

3.根據權利要求1所述的一種用于生長緩慢菌株分離培養的方法，其特征在于，所述磁場為：磁力架、磁鐵或電磁場中的一種或者組合。

4.根據權利要求1所述的一種用于生長緩慢菌株分離培養的方法，其特征在于，所述保水物質為水凝膠保水物質。

5.根據權利要求4所述的一種用于生長緩慢菌株分離培養的方法，其特征在于，所述水凝膠保水物質，其組成成分為：0.5％-10％膠原、1％-10％聚乙二醇、0.1％-10％海藻酸鹽試劑。

6.根據權利要求1所述的一種用于生長緩慢菌株分離培養的方法，其特征在于，所述保水薄層的厚度為：1-100μm。

7.根據權利要求1所述的一種用于生長緩慢菌株分離培養的方法，其特征在于，所述彈射分選方法為：基于激光誘導向前轉移技術的彈射分選。

8.根據權利要求1所述的一種用于生長緩慢菌株分離培養的方法，其特征在于，所述接收器為ep管蓋、培養皿或孔板。

9.根據權利要求1所述的一種用于生長緩慢菌株分離培養的方法，其特征在于，所述制備磁性顆粒，具體操作為：1ml?1mol/l?fecl2溶液與2ml?2mol/l?fecl3溶液混合，將25ml2mol/l?naoh溶液緩慢逐滴加入上述溶液中，渦旋攪拌30min，用磁場收集上述磁性顆粒，使用ddh2o清洗5-7次，取5ml磁性顆粒與45ml?10mg/ml丙烯胺鹽酸鹽混合，75w，40khz超聲60min，10000g離心10min，沉淀重懸于50ml?ddh2o中，渦旋混勻，使用0.2mm濾器過濾待用。

技術總結
本發明提供一種用于生長緩慢菌株分離培養的方法，包括：獲取所需微生物樣品；制備磁性顆粒；將所述微生物樣品與所述磁性顆粒震蕩混合，使用磁場對微生物樣品中的微生物進行分離，收集沉淀中的微生物；將沉淀中的微生物用緩沖液重懸，并與用于保持細胞活性的保水物質共同平鋪于分選芯片表面，使用彈射分選方法將微生物個體逐一分選至裝有適宜的培養基的接收器中，進行培養；本發明使用磁性顆粒對群體中生長速度不同的菌株進行分離，獲得生長速度緩慢的微生物類群，再通過彈射分選技術，將生長緩慢的微生物個體逐一分離后進行培養，從而有效提高生長緩慢微生物篩分培養的成功率及效率。

技術研發人員：李航,洪喜,李天宇,薛瑩,梁鵬,李碩
受保護的技術使用者：海寧市高新技術研究院
技術研發日：
技術公布日：2024/3/27