一種亞砜還原酶突變體及其在手性亞砜制備中的應用

本發明屬于生物，特別涉及一種亞砜還原酶突變體及其在手性亞砜制備中的應用。

背景技術：

1、手性亞砜是一種具有重要生物活性的化合物，在有機合成和藥物合成領域有廣泛的應用。它可以用作手性中間體和輔劑、手性配體、催化劑以及臨床藥物。目前，雙氧水和一些過渡金屬催化劑如鈦、釩、銠已被證實能夠有效催化硫醚底物的不對稱氧化或將消旋體亞砜動力學拆分生成手性亞砜。然而，大多數化學催化劑在催化反應中存在過度氧化、副產物多和反應條件苛刻等問題。此外，這些化學催化反應體系通常使用重金屬催化劑和過氧酸等強氧化劑，不符合環境保護和可持續性發展的要求。另一方面，生物催化的不對稱反應被認為是合成亞砜類化合物的一種新途徑。但由于天然生物催化劑常常受到催化速率，底物耐受性、熱穩定性等，往往達不到工業生物技術的要求，因此對酶的改造和進化顯得十分重要。

技術實現思路

1、本發明意在克服現有技術的不足，克服上述缺點，提供一種熱穩定性高、催化活性高、底物耐受性強的亞砜還原酶突變體；以及利用所述亞砜還原酶突變體生物催化制備光學純度高、成本低且安全環保的手性亞砜的方法。

2、本發明的技術方案之一是：一種亞砜還原酶(命名為msra)突變體，所述亞砜還原酶msra突變體在氨基酸序列如seq?id?no.1所示的親本酶msra的基礎上，將第53位的苯丙氨酸突變為纈氨酸得到的，命名為msra-f53v；其氨基酸序列如seq?id?no.2所示；

3、或，所述亞砜還原酶msra突變體在氨基酸序列如seq?id?no.1所示的親本酶msra的基礎上，將第182位的天冬氨酸突變為半胱氨酸得到的，命名為msra-d182c；其氨基酸序列如seq?id?no.3所示；

4、或，所述亞砜還原酶msra突變體在氨基酸序列如seq?id?no.1所示的親本酶msra的基礎上，將第182位的天冬氨酸突變為精氨酸得到的，命名為msra-d182r；其氨基酸序列如seq?id?no.4所示；

5、或，所述亞砜還原酶msra突變體在氨基酸序列如seq?id?no.1所示的親本酶msra的基礎上，將第53位的苯丙氨酸突變為纈氨酸同時第182位的天冬氨酸突變為半胱氨酸得到的，命名為msra-f53v/d182c；其氨基酸序列如seq?id?no.5所示；

6、或，所述亞砜還原酶msra突變體在氨基酸序列如seq?id?no.1所示的親本酶msra的基礎上，將第53位的苯丙氨酸突變為纈氨酸同時第182位的天冬氨酸突變為精氨酸得到的，命名為msra-f53v/d182r；其氨基酸序列如seq?id?no.6所示.

7、本發明的技術方案之二是：一種構建所述亞砜還原酶突變體的方法。

8、本發明所述的亞砜還原酶msra突變體是首先通過構建隨機突變文庫，對文庫進行熱穩定性的高通量篩選；其次是根據初篩的位點構建定點飽和突變文庫，對文庫進行熱穩定性的二次高通量篩選；最后是進行組合突變，將不同位點的熱穩定性提升明顯的突變體進行整合，系統驗證變體催化活性、熱穩定性及底物耐受性的提升。

9、本發明的技術方案之三是：一種包含所述亞砜還原酶突變體的基因重組載體的基因工程菌。

10、本發明所述基因工程菌由通過本領域常規方法將所述重組表達載體轉化至宿主微生物中制得；較佳地，將所述重組表達質粒pet-28a-msra突變體轉化至大腸桿菌bl21(de3)中即可。所述宿主微生物可為本領域常規的各種宿主微生物，只要能滿足所述重組表達載體可穩定地自行復制，且所攜帶的亞砜還原酶基因可被有效表達即可；較佳地為大腸桿菌bl21(de3)。

11、本發明的技術方案之四是：一種所述亞砜還原酶的制備方法，其包括如下步驟：培養所述基因工程菌，加入iptg誘導劑后，從細胞中獲得亞砜還原酶。

12、本發明所述亞砜還原酶通過將所述基因工程菌培養后得到。所述培養的方法和條件為本領域常規的方法和條件，可以根據宿主類型和培養方法等因素進行適當的選擇，只要使基因工程菌能夠生長并產生所述亞砜還原酶即可；較佳地，為下述方法：挑取單菌落于2ml?lb培養基，于37℃搖床180rpm的轉速下培養12h后，轉入含有50ml?lb培養基的250ml的大搖瓶，培養至od600＝0.6時加入終濃度為0.2μm的iptg，繼續培養14h后，于5000rpm的條件下離心去除上清液，獲得含所述亞砜還原酶的菌株細胞；所述培養所用的培養基為本領域任何可使所述基因工程菌生長并產生所述亞砜還原酶的培養基；較佳地為lb培養基：蛋白胨10g/l，酵母膏5g/l，nacl?5g/l，ph?7.0。

13、本發明的技術方案之五是：一系列r構型手性亞砜的生物催化制備方法包括以下步驟：將所培養基因工程菌，懸浮于緩沖液，加入消旋體亞砜底物，放入搖床反應后，萃取并收集有機相，用無水硫酸鈉干燥，離心除去硫酸鈉并過濾，加壓蒸去溶劑，柱層析分離，獲得r構型的手性亞砜。

14、本發明所述的基因工程菌既可以是含所述亞砜還原酶的休止細胞，生長中的細胞，也可以是固定化的細胞，裂解的粗酶液，或者純化后的pmmsra酶蛋白。較佳的為含所述亞砜還原酶的粗酶液。

15、本發明所制備的手性亞砜為r構型的芳香族亞砜、雜芳族亞砜、烷基亞砜和硫代烷基亞砜等，包括但不限于以下24種：(r)-苯基甲基亞砜、(r)-甲基對甲苯亞砜、(r)-4-氟-苯基甲基亞砜、(r)-3-氟-苯基甲基亞砜、(r)-2-氟-苯基甲基亞砜、(r)-4-氯-苯基甲基亞砜、(r)-3-氯-苯基甲基亞砜、(r)-2-氯-苯基甲基亞砜、(r)-2-溴-苯基甲基亞砜、(r)-3-溴-苯基甲基亞砜、(r)-4-溴-苯基甲基亞砜、(r)-2-羥-苯基甲基亞砜、(r)-4-甲基亞磺酰基-苯甲醛、(r)-2-氨基-苯基甲基亞砜、(r)-苯基乙基亞砜、(r)-芐基甲基亞砜、(r)-2-甲基亞磺酰基-吡啶、(r)-2-甲基亞磺酰基-環己烷、(r)-康基甲基亞砜、(r)-甲基丙基亞砜、(r)-甲基丁基亞砜、(r)-甲基庚基亞砜、(r)-十二烷基甲基亞砜、(r)-甲基硫代亞砜。所制備的手性亞砜，其對映體過量值(ee)均達到99％，制備產率均在40％以上。

16、本發明所述緩沖液為本領域常規的ph?6.0～10.0的磷酸鈉緩沖液，緩沖液的濃度一般為10～200mm，較佳的為濃度50mm、ph?7.0～9.0的na2hpo4-nah2po4，優選ph?8.0；所述的細胞濃度為不低于10g/l，一般為10～50g/l，較佳的為30g/l；所述的msra酶濃度為不低于1g/l，一般為1～5g/l，較佳的為3g/l；所述的搖床轉速為250rpm/min；所述的反應溫度為25～5℃，較佳的為30℃；所述的反應時間為2～8小時；所述的消旋體亞砜底物濃度為100～400mm。所述的反應的進程可以采用本領域中的常規測試方法，如氣相色譜(毛細管柱hp-5ms)、hplc或nmr進行監控。

17、較佳地，所述的反應結束后還包括將所述的r構型手性亞砜進行提取的步驟；所述的提取步驟為本領域常規的提取步驟。更佳地為使用有機溶劑對反應液進行萃取，合并萃取液，加無水硫酸鈉干燥過夜，旋轉蒸發除去溶劑即可。所述有機溶劑為本領域常規的有機溶劑；較佳地為選自乙酸乙酯、乙酸丁酯和二氯甲烷的一種或多種。

18、本發明的積極進步效果在于：含所述亞砜還原酶的基因工程菌能有效催化消旋體亞砜的不對稱拆分，獲得高光學純度的(r)構型亞砜。反應體系的底物濃度可高達100～400mm，最高可實現>90g/l底物濃度下手性亞砜的高效制備，底物濃度高于目前所有的其他生物催化體系。同時，相對于其它現有的制備方法，使用所述制備方法反應時間短，反應條件溫和，對環境友好，操作簡便。