本發明屬于基因工程和酶工程領域，具體涉及來源于青春雙歧桿菌的磷酸轉酮酶突變體及其在代謝產物生產中的應用，涉及的代謝產物包括但不限于抗生素(如桿菌肽)和源自乙酰輔酶a的氨基酸衍生物(如四氫嘧啶和γ-氨基丁酸等)。
背景技術：
1、桿菌肽是一種非核糖體肽類抗生素，其具有抑菌性強、抗菌譜廣、不易產生抗藥性等優點，被廣泛應用于飼料添加劑和獸藥領域。四氫嘧啶和γ-氨基丁酸分別是兩種典型的源自乙酰輔酶a的天冬氨酸和谷氨酸衍生物，在食品、醫藥和化工等行業中扮演著重要的角色。目前，桿菌肽、四氫嘧啶和γ-氨基丁酸主要采用微生物發酵法生產。近年來，隨著基因工程技術的快速發展，研究人員采用基因工程手段對宿主菌株進行遺傳修飾，成功提高了代謝產物的生產水平。
2、在微生物糖酵解途徑中，1摩爾葡萄糖降解生成2摩爾丙酮酸，隨后在丙酮酸脫氫酶系的催化下生成2摩爾乙酰輔酶a，并釋放2摩爾co2。這種碳損失不僅不利于代謝產物的高效合成，還將進一步加劇溫室效應，降低了微生物制造的經濟性和可持續性。青春雙歧桿菌(bifidobacterium?adolescentis)來源的磷酸轉酮酶(phosphoketolase，基因fxpk編碼)具有雙功能酶活性，其既可以催化6-磷酸果糖(f6p)轉化為4-磷酸赤蘚糖(e4p)和乙酰磷酸(acp)，又可以催化5-磷酸木酮糖(x5p)轉化為3-磷酸甘油醛(g3p)和acp；隨后，acp在磷酸轉乙酰酶的催化下生成乙酰輔酶a。與丙酮酸脫氫酶系催化的反應相比，磷酸轉酮酶催化的代謝反應沒有碳原子損失，但微生物發酵通常使用宿主菌株(包括大腸桿菌、谷氨酸棒桿菌和地衣芽胞桿菌等)中不存在天然的磷酸轉酮酶，在這些菌株中引入磷酸轉酮酶可以提高代謝產物(特別是源自乙酰輔酶a的代謝產物)的產量和轉化率。然而，天然的磷酸轉酮酶活性較低，需要大幅度提高其在宿主菌株的表達量才能體現出對代謝產物合成的促進效果，限制了其應用潛力。因此，急需開發催化性能更佳的磷酸轉酮酶。
技術實現思路
1、本發明的目的在于提供來源于青春雙歧桿菌的磷酸轉酮酶突變體，所述磷酸轉酮酶突變體h480k的氨基酸序列如seq?id?no.4所示。
2、本發明的另一個目的在于提供了磷酸轉酮酶突變體h480k在發酵生產代謝產物中的應用。
3、為了達到上述目的，本發明采取以下技術措施：
4、申請人將青春雙歧桿菌(bifidobacterium?adolescentis)來源的野生型磷酸轉酮酶(seq?id?no.2所示)第480位組氨酸h突變為賴氨酸k，得到了本發明的磷酸轉酮酶突變體h480k，如seq?id?no.4所示。
5、本發明的保護范圍還包括：
6、seq?id?no.4所述突變體蛋白與蛋白標簽融合得到的融合蛋白。
7、seq?id?no.4所述突變體或融合蛋白編碼基因。
8、具有上述編碼基因的表達盒、重組載體、重組微生物或離體的重組細胞。
9、上述突變體，融合蛋白，seq?id?no.4所述突變體或融合蛋白編碼基因，具有上述編碼基因的表達盒、重組載體、重組微生物或離體的重組細胞在制備代謝物中的應用。
10、一種提高磷酸轉酮酶酶活的方法，包括如下步驟：將磷酸轉酮酶進行如下突變：將seq?id?no.4的第480位組氨酸h突變為賴氨酸k。
11、一種制備代謝物的方法，包括如下步驟：通過培養上述的重組微生物制備代謝物。
12、以上所述的應用或方法，優選的，所述的代謝物為：桿菌肽、源自乙酰輔酶a的氨基酸衍生物；
13、以上所述的應用或方法，優選的，所述的源自乙酰輔酶a的氨基酸衍生物為四氫嘧啶、和/或γ-氨基丁酸。
14、seq?id?no.4所述突變體的編碼基因，優選的為seq?id?no.3所示。
15、以上所述應用或方法中，優選的，所述的重組微生物為重組地衣芽胞桿菌。
16、以上所述應用或方法中，優選的，所述的地衣芽胞桿菌為地衣芽胞桿菌dw2。
17、與現有技術相比，本發明具有以下優點：
18、本發明通過定點突變的方式，將磷酸轉酮酶分子的第480位組氨酸突變為賴氨酸(本發明命名為突變體h480k)，大幅度提高了磷酸轉酮酶的酶活力，解決了目前磷酸轉酮酶對6-磷酸果糖催化效率不高的問題。將磷酸轉酮酶突變體h480k整合表達至地衣芽胞桿菌dw2的基因組上，改造后的重組菌株發酵生產桿菌肽和源自乙酰輔酶a的代謝產物的能力明顯增強，測定結果表明，與整合表達野生型磷酸轉酮酶的重組菌株相比，h480k突變株的桿菌肽、四氫嘧啶和γ-氨基丁酸的產量分別提高了7.18％、21.01％和23.48％，表現出了良好的工業化應用前景。
1.?磷酸轉酮酶突變體蛋白h480k，所述突變體蛋白的氨基酸序列如seq?id?no.4所示。
2.權利要求1所述的突變體蛋白與蛋白標簽融合得到的融合蛋白。
3.權利要求1所述的突變體蛋白或權利要求2所述的融合蛋白的編碼基因。
4.具有權利要求3所述編碼基因的表達盒、重組載體、重組微生物或離體的重組細胞。
5.權利要求1所述突變體蛋白、權利要求2所述的融合蛋白，權利要求3所述的編碼基因、權利要求4所述的表達盒、重組載體、重組微生物或離體的重組細胞在制備代謝物中的應用。
6.?一種提高磷酸轉酮酶酶活的方法，包括如下步驟：?將磷酸轉酮酶進行如下突變：將seq?id?no.4的第480位組氨酸h突變為賴氨酸k。
7.一種制備代謝物的方法，包括如下步驟：通過培養權利要求5所述的重組微生物制備代謝物。
8.根據權利要求5所述的應用、權利要求6或7所述的方法，所述的代謝物為：桿菌肽和/或源自乙酰輔酶a的氨基酸衍生物。
9.根據權利要求8所述的應用，所述的源自乙酰輔酶a的氨基酸衍生物為四氫嘧啶、和/或或γ-氨基丁酸。
10.根據權利要求5所述的應用，所述的重組微生物為重組地衣芽胞桿菌。