一種鑒別鯉魚品種的分子標記及利用其進行鑒別的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種鑒別鯉魚品種的分子標記及利用其進行鑒別的方法，屬于分子標 記技術領域。
【背景技術】
[0002] 鯉魚是我國最主要的淡水養殖品種之一，養殖品種眾多，目前已獲得水產新品種 證書的鯉魚品種就多達20多種。在區分不同鯉魚品種的時候，往往是根據形態學特征，如 體色或是體長、體高、側線鱗、鰭條等可數性狀和可量性狀進行鑒別，但這些表型性狀的數 值，在不同的鯉魚品種中都有部分重疊，以至于無法準確地判別不同品種。
[0003] 分子標記是以個體間遺傳物質內核苷酸序列變異為基礎的遺傳標記，是DNA水 平遺傳多態性的直接的反映。其中，目標區域擴增多態性（target region amplified polymorphism, TRAP)也叫革E位區域擴增多態性，是一種基于PCR的新型分子標記技術。 TRAP技術是利用生物信息學工具和表達序列標簽數據庫信息，通過對目標候選基因區域的 PCR擴增，產生圍繞目標候選基因序列的多態性標記。是一種與性狀相關聯的分子標記。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的是克服形態學特征無法準確鑒別鯉魚品種的不足，提供一種TRAP 分子標記及其獲得方法，有助于快速、準確鑒別福瑞鯉與其原始親本一一建鯉和黃河鯉，在 鯉魚選育、種質資源鑒定、保護和利用中有極大的應用價值。
[0005] 按照本發明提供的技術方案，一種鑒別鯉魚品種的分子標記，采用的引物對為： 核苷酸序列為5' -3' ；固定引物序列為：5' -GCCGACTTGAAAATGG-3'，隨機引物序列為： 5' -GGAACCAAACACATGAAGA-3'。
[0006] 采用所述分子標記進行鯉魚品種鑒別的方法，步驟為：
[0007] (1)設計TRAP分子標記引物：設計固定引物序列和隨機引物序列；
[0008] (2)?0?反應：總體積為15以1^，其中]\%2+1.5臟〇1/1、(1階1^0.35臟〇1/1、隨機引物 6pmol/L、固定引物10pm 〇l/L、含DNA模板60ng、Taq DNA聚合酶1.0U，用滅菌雙蒸餾水補足 體積；
[0009] PCR 反應條件為：94°C 4min ;94°C 45s，35°C 45s，72°C lmin，5 個循環；94°C 45s， 53°C 45s，72°C lmin，35 個循環；72°C IOmin ;
[0010] (3)電泳：對步驟（3)的所得PCR產物用質量濃度為8. 0%的聚丙烯酰胺凝膠進行 電泳分離，銀染法染色后，拍照記錄電泳結果；
[0011] ⑷結果觀察：針對特定鯉魚品種電泳后樣品出現電泳條帶，用于鯉品種鑒另I」、保 種和分子輔助選擇育種。
[0012] 本發明的有益效果：本發明提供的引物對在針對福瑞鯉樣本中，擴增出一條 200bp左右的明顯特異條帶，而原始親本建鯉和黃河鯉中并無此條帶，通過該分子標記可廣 泛用于鯉魚品種鑒別、保種和分子輔助選擇育種。
【附圖說明】
[0013] 圖1是實施例1福瑞鯉的特異TRAP標記示意圖（箭頭所示）。
[0014] 圖2是實施例2福瑞鯉的特異TRAP標記示意圖（箭頭所示）。
[0015] 圖3是實施例3福瑞鯉的特異TRAP標記示意圖（箭頭所示）。
【具體實施方式】
[0016] 下面結合具體實施例對本發明作進一步說明。
[0017] 實施例1
[0018] 福瑞鯉及其原始親本一一建鯉和黃河鯉均取自中國水產科學研宄院淡水漁業研 宄中心宜興實驗基地，每種魚隨機各取10尾。剪取每尾魚的鰭條抽提基因組DNA。
[0019] 選擇可能與鯉魚生長性狀相關的GH(GenBank accession no. M27000. 1)， GHR(AY741100. 1)，IGF(D83272. 1)，TRH(AB179818. l)and GTH(X56497. 1)基因作為目標候 選基因，設計18個固定引物。針對外顯子或內含子的特點，設計了 4個富含GC或AT核心 區的隨機引物，依據Hu(2006)文獻設計合成。具體如表1所示。
[0020] 以所取基因組DNA為模板，用18個固定引物分別與4個隨機引物組合進行PCR擴 增，引物具體如表1所示。
[0021] PCR 反應總體積為 15 yL，其中 Mg2+L 5mmol/L、dNTPsO. 35mmol/L、隨機引物 6pmol/ U固定引物10pm〇l/L、含DNA模板60ng、Taq DNA聚合酶I. 0U，用滅菌雙蒸餾水補足體積。 PCR 反應條件為：94°C 4min ;94°C 45s，35°C 45s，72°C lmin，5 個循環；94°C 45s，53°C 45s， 72°C lmin，35 個循環；72°C lOmin。
[0022] PCR反應結束后，產物用8. 0%的非變性聚丙烯酰胺凝膠進行電泳分離，銀染法染 色后，拍照記錄電泳結果。
[0023] 當用固定引物Me 7 (gccgacttgaaaatgg)和隨機引物Em l(ggaaccaaacacatgaaga)進行擴增時，在福瑞鯉中均出現一個約200bp的擴增條帶，而建 鯉和黃河鯉中沒有這一條帶。根據這一特異性的TRAP條帶標記，將福瑞鯉與原始親本建 鯉、黃河鯉區分出來，具體如圖1所示。
[0024] 實施例2
[0025] 福瑞鯉及其原始親本之一--建鯉取自中國水產科學研宄院淡水漁業研宄中心 南泉實驗基地，另一原始親本一一黃河鯉均取自河南鄭州黃河鯉魚良種場，每種魚隨機各 取10尾。剪取每尾魚的鰭條抽提基因組DNA。
[0026] 以所取基因組DNA為模板，用18個固定引物分別與4個隨機引物組合進行PCR擴 增，引物具體如表1所示。
[0027] PCR 反應總體積為 15 yL，其中 Mg2+L 5mmol/L、dNTPsO. 35mmol/L、隨機引物 6pmol/ U固定引物10pm〇l/L、含DNA模板60ng、Taq DNA聚合酶I. 0U，用滅菌雙蒸餾水補足體積。 PCR 反應條件為：94°C 4min ;94°C 45s，35°C 45s，72°C lmin，5 個循環；94°C 45s，53°C 45s， 72°C lmin，35 個循環；72°C 10min。
[0028] PCR反應結束后，產物用8. 0%的非變性聚丙烯酰胺凝膠進行電泳分離，銀染法染 色后，拍照記錄電泳結果。
[0029] 當用固定引物Me 7 (gccgacttgaaaatgg)和隨機引物Em l(ggaaccaaacacatgaaga)進行擴增時，在福瑞鯉中均出現一個約200bp的擴增條帶，而建 鯉和黃河鯉中沒有這一條帶。根據這一特異性的TRAP條帶標記，將福瑞鯉與原始親本建 鯉、黃河鯉區分出來，如圖2所示。
[0030] 實施例3
[0031] 福瑞鯉10尾及其原始親本--建鯉和黃河鯉各7尾均取自中國水產科學研宄院 長江水產研宄所。剪取每尾魚的鰭條抽提基因組DNA。
[0032] 以所取基因組DNA為模板，用18個固定引物分別與4個隨機引物組合進行PCR擴 增，引物具體如表1所示。
[0033] PCR反應總體積為 15 μ 1，其中 Mg2+L 5mmol/L、dNTPsO. 35mmol/L、隨機引物 6pmol/ U固定引物10pm〇l/L、含DNA模板60ng、Taq DNA聚合酶I. 0U，用滅菌雙蒸餾水補足體積。 PCR 反應條件為：94°C 4min ;94°C 45s，35°C 45s，72°C lmin，5 個循環；94°C 45s，53°C 45s， 72°C lmin，35 個循環；72°C lOmin。
[0034] PCR反應結束后，產物用8. 0%的非變性聚丙烯酰胺凝膠進行電泳分離，銀染法染 色后，拍照記錄電泳結果。
[0035] 當用固定引物Me 7 (gccgacttgaaaatgg)和隨機引物Em l(ggaaccaaacacatgaaga)進行擴增時，在福瑞鯉中均出現一個約200bp的擴增條帶，而建 鯉和黃河鯉中沒有這一條帶。根據這一特異性的TRAP條帶標記，將福瑞鯉與原始親本建 鯉、黃河鯉區分出來，如圖3所示。
[0036] 表1固定引物及隨機引物序列
[0037]
[0038]
【主權項】
1. 一種鑒別鯉魚品種的分子標記，其特征是采用的引物對為：核苷酸序列為5' -3'；固 定引物序列為：5 ' -GCCGACTTGAAAATGG-3 '，隨機引物序列為：5 ' -GGAACCAAACACATGAAGA-3 '。2. 采用權利要求1所述分子標記進行鯉魚品種鑒別的方法，其特征是步驟為： (1) 設計TRAP分子標記引物：設計固定引物序列和隨機引物序列； (2) PCR 反應：總體積為 15 y L，其中 Mg2+L 5mmol/L、dNTPs 0. 35mmol/L、隨機引物 6pmol/L、固定引物10pm〇l/L、含DNA模板60ng、Taq DNA聚合酶1.0U，用滅菌雙蒸餾水補足 體積； PCR 反應條件為：94 °C 4min ;94 °C 45s，35 °C 45s，72 °C lmin，5 個循環；94 °C 45s， 53°C 45s，72°C lmin，35 個循環；72°C IOmin ; (3) 電泳：對步驟（3)的所得PCR產物用質量濃度為8.0%的聚丙烯酰胺凝膠進行電泳 分離，銀染法染色后，拍照記錄電泳結果； (4) 結果觀察：針對特定鯉魚品種電泳后樣品出現電泳條帶，用于鯉品種鑒別、保種和 分子輔助選擇育種。
【專利摘要】本發明涉及一種鑒別鯉魚品種的分子標記及利用其進行鑒別的方法，屬于分子標記技術領域。其提供一固定引物序列和一隨機引物序列，并通過這對引物進行PCR反應，電泳后得到結果。本發明提供的引物對只在福瑞鯉樣本中，擴增出一條200bp左右的明顯特異條帶，而原始親本建鯉和黃河鯉中并無此條帶。可通過分子標記用于鯉魚品種鑒別、保種和分子輔助選擇育種。
【IPC分類】C12Q1/68, C12N15/11
【公開號】CN104946787
【申請號】CN201510436129
【發明人】董在杰, 曲疆奇, 朱文彬, 王蘭梅
【申請人】中國水產科學研究院淡水漁業研究中心
【公開日】2015年9月30日
【申請日】2015年7月22日