一種來源于綠色巴夫藻的delta9延伸酶新基因的制作方法
【技術領域】
[0001] 本申請屬于基因克隆分離的技術領域，尤其設及于一種來源于微藻的有關多不飽 和脂肪酸合成的延伸酶基因及其分離方法。
【背景技術】
[0002] 多不飽和脂肪酸是人體必需的重要的營養物質，微藻因富含多不飽和脂肪酸而成 為重要的生物資源。綠色己夫藻（Pavlovaviridis)含有豐富的多不飽和脂肪酸，是進行 多不飽和脂肪酸相關合成基因識別與克隆的良好實驗材料。
[0003]RACE全稱rapid-amplificationofcDNAends,是一種常用的通過PCR進行cDNA 末端快速克隆的技術。本實驗采用RACE技術來獲得目的mRNA片段的全長序列。
[0004] 在微藻的多不飽和脂肪酸的體內合成途徑中，起到最關鍵作用的是多不飽和脂肪 酸去飽和酶和多不飽和脂肪酸延伸酶兩大酶類。但由于其為與內質網結合的膜蛋白，上述 酶類在分子水平上的研究受到很大限制。其中，delta9延伸酶是催化亞麻酸（C18 :3n-3)生 成化rA(C20: 3n-3)的關鍵酶，后者可進一步被deltas去飽和酶催化生成二十碳四締酸， 該途徑區別于常見的deltas途徑，存在于某些微藻中，是EPA和DHA生物合成途徑的重要 補充。其中，delta9延伸是該途徑的限速步驟。目前在微藻中已經有數個來自于不同物種 的delta9延伸酶獲得了分離和識別，但不同物種的同源酶顯然都存在序列上和結構上的 差異，進而導致其酶活性和功能的不同。因此，從綠色己夫藻中分離得到其delta9延伸酶 的同源酶是對該部分研究資源的很好補充，本申請就試圖從運個角度展開相關的工作。
【發明內容】
陽0化]綠色己夫藻（化Woks.Kiri扣6·)為常用微藻，購自中國科學院青島海洋研究 所。
[0006] 綠色己夫藻delta9延伸酶基因的分離過程為： (1) 利用本領域常規的mRNA提取分離手段獲得綠色己夫藻的總mRNA,并使用引物 OligodTW本領域常規手段將之反轉錄為cDNA; (2) 使用cDNA作為模板，根據delta9延伸酶同源基因的保守性設計引物P9F、P9R來 進行保守區基因的擴增，其引物序列為：P9F: 5' -GCCACCTACAGTTTGTCCGCGA-3' ;P9R: 5，-GGTGATGTCCGCTTCATCGAGA-3' ；PCR反應條件為：94乂 3min;94°C30S,60乂 30S, 72乂 1min, 30個循環；72°C10min;所獲PCR產物大小約為360bp; (3) 3'末端的擴增反應WcDNA為模板、使用SMARTRACEcDNA擴增試劑 盒來進行，使用的擴增引物分別是：UPM(10Xuniversalprimermix) ;elo9-3 CTAACTACGGCGCGACGGCA。梯度PCR反應程序為：94乂 3min; 94°C30s, 72°C3min, 5 個循環；94°C30s, 70T30s, 72T3min, 5個循環；94°C30s，68°C30s，72°C3min， 30個循環；72°C10min。所獲PCR產物大小約為420bp. (4) 5'末端的擴增反應使用總mRNA為模板并使用SMARTRACEcDNA擴增試劑盒來進 行，使用的引物分別為：UPM5,（lOXuniversalprimermix);GSPlCAAGTTCTAGGCGTCCT;GSP2 GTAACCCGTGAGCTCGC。反應程序為：加入GSPl于mRNA中后W94乂 3min; 94°C30s, 6(TC30s，72°C1min反應1個循環；隨后加入TdT于37oC反應30min獲得特定末端產物； 然后向體系中加入UPM5'和GSP2，W如下程序完成反應：94°C3min; 94乂 30S，72°C3 min, 5 個循環；94。0 30s, 70T30s, 72。0 3min, 5 個循環；94。0 30s，68乂 30s，72°C 3min，30個循環；72°C10min。所獲目的片段約為59化P。
[0007] W上所有的片段均連入PMD18T載體后進行測序后拼接。
[0008] (5)開放閱讀框的擴增：在經過拼接獲得了表達基因的全長之后，分別設計上下 游引物ATGGCGACCGAAGGGATGC和CTACTCGGTTTTCATTAAAG，經PCR擴增獲得完整的delta9 延 伸酶開放閱讀框片段。PCR反應條件為：94°C3min;94°C30S，58乂 30S，72°C1min, 30個循環；72°C10min;片段大小為81化p。
[0009] 最終所得來自綠色己夫藻的推定的多不飽和脂肪酸delta9延伸酶的全長多核巧 酸序列如SEQIDNO. 1所示。該基因所編碼的氨基酸序列與來自于化vlovasalina的 delta9延伸酶的活性區域具有較高的序列相似性巧日圖1所示)，并經過在畢赤酵母中的 異源表達功能驗證，證實其為一種多不飽和脂肪酸delta9延伸酶。
[0010] 本申請首次從綠色己夫藻的基因組中分離獲得了多不飽和脂肪酸delta9延伸酶 基因，豐富了該類酶的重要的基因資源，為進一步研究該酶的體內和體外的作用機制奠定 了基礎。
【附圖說明】
[0011] 圖 1 沈QIDNo. 1與來自化vlovasalina的delta9延伸酶基因的比對結果【具體實施方式】
[0012] 綠色己夫藻delta9延伸酶基因的分離過程為： (1) 利用本領域常規的mRNA提取分離手段獲得綠色己夫藻的總mRNA，并使用引物 OligodTW本領域常規手段將之反轉錄為cDNA; (2) 使用cDNA作為模板，根據delta9延伸酶同源基因的保守性設計引物P9F、P9R來 進行保守區基因的擴增，其引物序列為：P9F: 5' -GCCACCTACAGTTTGTCCGCGA-3' ;P9R: 5，-GGTGATGTCCGCTTCATCGAGA-3' ；PCR反應條件為：94乂 3min;94°C30S,60乂 30S, 72乂 1min, 30個循環；72°C10min;所獲PCR產物大小約為360bp; (3) 3'末端的擴增反應WcDNA為模板、使用SMARTRACEcDNA擴增試劑 盒來進行，使用的擴增引物分別是：UPM(10Xuniversalprimermix) ;elo9-3 CTAACTACGGCGCGACGGCA。梯度PCR反應程序為：94乂 3min; 94°C30s, 72°C3min, 5 個循環；94°C30s, 70T30s, 72T3min, 5個循環；94°C30s，68°C30s，72°C3min， 30個循環；72°C10min。所獲PCR產物大小約為420bp. (4) 5'末端的擴增反應使用總mRNA為模板并使用SMARTRACEcDNA擴增試劑盒來進 行，使用的引物分別為：UPM5,（lOXuniversalprimermix);GSP1CAAGTTCTAGGCGTCCT; GSP2 GTAACCCGTGAGCTCGC。反應程序為：加入GSPl于mRNA中后W94乂 3min; 94°C30s, 60乂 30s，72°C1min反應1個循環；隨后加入TdT于37oC反應30min獲得特定末端產物； 然后向體系中加入UPM5'和GSP2，W如下程序完成反應：94°C3min; 94乂 30S，72°C3 min, 5 個循環；94。0 30s, 70T30s, 72。0 3min, 5 個循環；94。0 30s，68乂 30s，72°C 3min，30個循環；72°C10min。所獲目的片段約為59化P。
[001引 W上所有的片段均連入PMD18T載體后進行測序后拼接。
[0014] (5)開放閱讀框的擴增：在經過拼接獲得了表達基因的全長之后，分別設計上下 游引物ATGGCGACCGAAGGGATGC和CTACTCGGTTTTCATTAAAG，經PCR擴增獲得完整的delta9 延 伸酶開放閱讀框片段。PCR反應條件為：94°C3min;94°C30S，58乂 30S，72°C1min, 30個循環；72°C10min;片段大小為81化p。
[0015] (6)delta9延伸酶功能的驗證 獲得表達基因片段之后，隨后通過本領域常用的亞克隆手段將該片段連接到載體PPIC3. 5k，得到畢赤酵母表達質粒PPIC3.化-delta-9,隨后將該質粒與空載體分別電轉 化入畢赤酵母中得到GS115-9和GS115-PPIC3. 5K。挑取陽性轉化子接種到裝有5mlBMGY液 體培養基的試管中，29oC，ISOrpm搖床培養過夜。然后吸取500μ1過夜培養的菌液接種 至50mlBMGY液體培養基的Ξ角瓶中，正常條件培養至0D600達到4-6。離屯、收集菌體，稀 釋4-6倍將菌體轉移至BMMY液體培養基中，使初始的菌密度值達到1.0。向培養基中加入 終濃度為0. 5%的甲醇100μΜ的底物亞麻酸開始誘導。要每隔半天添加甲醇維持0. 5%的 誘導濃度。培養9化后離屯、收集菌體，超聲法提取脂肪酸并進行甲醋化，氣相色譜分析脂肪 酸組成變化。脂肪酸變化的結果如表1所示。通過表1的結果可W看出，重組菌具備了將 亞麻酸合成二十碳Ξ締酸（η3族）的能力，表明我們所克隆得到的基因為一種新的脂肪酸 delta9延伸酶的編碼基因。
[0016] 表1重組畢赤酵母的長鏈脂肪酸組成（數值為含量百分比）
ND表示測量不到 W上所述BMGY培養基的組成為1%酵母粉，2%蛋白腺，1%甘油，外加十分之一體積的 13. 4%YNB，4*10 5%生物素W及1/10體積的抑6. 0的憐酸鹽緩沖液。 陽017] W上所述BMMY培養基的組成為1%酵母粉，2%蛋白腺，外加十分之一體積的 13. 4%YNB，4*10 5%生物素W及1/10體積的抑6. 0的憐酸鹽緩沖液。
[0018] 說明書氨基酸和核巧酸序列表 沈QIDNO. 1: CKirii/is的多不飽和脂肪酸delta9延伸酶的基因序列
【主權項】
1. 一種從微藻中克隆得到脂肪酸延伸酶基因的方法，其特征在于，首先分離得到微藻 的mRNA并反轉錄為CDNA，隨后以之為模板，根據延伸酶基因保守序列設計簡并引物從而擴 增得到保守區基因；接下來分別對其5'末端和3'末端進行末端擴增獲得全基因序列后，通 過普通PCR的方法獲得表達基因。2. -種來自于綠色巴夫藻的delta9延伸酶基因的開放閱讀框序列，其特征在于，其序 列如SEQID.No. 1所示。
【專利摘要】多不飽和脂肪酸，如二十碳五烯酸（EPA）、二十二碳六烯酸（DHA）等，是人體必需的重要營養物質。針對于能夠自然合成大量多不飽和脂肪酸的一種微藻-綠色巴夫藻(<i>Pavlova？viridis</i>)，本申請使用了保守區序列擴增和RACE相結合的方法克隆獲得了一種新的delta9延伸酶的基因。該基因的獲得為進一步認識和利用極有現實意義的EPA和DHA的生物合成過程提供了依據。
【IPC分類】C12N15/10, C12N15/54
【公開號】CN105255913
【申請號】CN201510797614
【發明人】徐毅
【申請人】徐毅
【公開日】2016年1月20日
【申請日】2015年11月18日