肺炎支原體蛋白抗原表位的融合蛋白及其制備、應用

肺炎支原體蛋白抗原表位的融合蛋白及其制備、應用
【專利摘要】本發明肺炎支原體蛋白抗原表位的融合蛋白及其制備、應用涉及基因工程技術、疫苗和診斷試劑領域。通過計算機分析肺炎支原體P116蛋白、P1蛋白和P30蛋白的氨基酸序列，篩選出含強抗原表位的肺炎支原體P116蛋白片段，即第261個氨基酸至第466個氨基酸，含強抗原表位的肺炎支原體P1蛋白片段，即第1125個氨基酸至第1395個氨基酸，和含強抗原表位的肺炎支原體的P30蛋白片段，即第107個氨基酸至第161氨基酸。化學合成全新的肺炎支原體P116蛋白片段、P1蛋白片段與P30蛋白片段的串聯基因序列，將三個基因片段串聯，利用基因工程技術表達P116蛋白片段、P1蛋白片段與P30蛋白片段的融合蛋白,三個蛋白片段之間用甘氨酸-甘氨酸-絲氨酸連接，融合蛋白全長538個氨基酸。
【專利說明】
肺炎支原體蛋白抗原表位的融合蛋白及其制備、應用
技術領域
[0001] 本發明肺炎支原體蛋白抗原表位的融合蛋白及其制備、應用涉及的是基因工程技 術、疫苗和診斷試劑領域，是通過計算機分析肺炎支原體P116蛋白、P1蛋白和P30蛋白的 氨基酸序列，篩選出含強抗原表位的肺炎支原體的P116蛋白片段，含強抗原表位的肺炎支 原體的P1蛋白片段，和含強抗原表位的肺炎支原體的P30蛋白片段。選擇真核和原核生物 均偏愛的密碼子，化學合成全新的肺炎支原體P116蛋白片段、P1蛋白片段和P30蛋白片段 的串聯基因序列，利用基因工程技術表達P116蛋白片段、P1蛋白片段和P30蛋白片段的融 合蛋白，三個蛋白片段之間用甘氨酸-甘氨酸-絲氨酸連接，融合蛋白全長538個氨基酸。 表達的融合蛋白可用于疫苗及肺炎支原體抗體或抗原的檢測，及用于肺炎支原體單抗和多 抗制備等，本發明涉及基因工程技術、疫苗和診斷試劑領域。
【背景技術】
[0002] 肺炎支原體Mp)是一種能在無生命培養基中生長的原 核細胞型微生物，是引起原發性非典型肺炎的主要病原體，還可引起咽炎、鼻炎、中耳炎、支 氣管炎、氣管炎等，與小兒哮喘的發病也有密切關系。此外，Mp在機體內可逃避宿主免疫系 統的清除，引起持續性感染，導致機體器官發生慢性病理損害，并與動脈粥樣硬化、冠心病 等心血管疾病的發生發展密切相關。所以對Mp的研究越來越受到人們的關注。
[0003] Mp沒有細胞壁，主要通過細胞膜表面的結構與宿主勒細胞膜上的受體結合，以攝 取氨基酸、核酸前體物質、游離脂肪酸等，合成自身結構及營養物質。因此，對宿主細胞和組 織的粘附，是其致病的關鍵。但支原體也會因基因突變而喪失其粘附能力，其毒力也隨之喪 失。
[0004] Mp感染多見于學齡兒童及青少年，是兒童社區獲得性肺炎最主要的病原體，其發 病率逐年上升，占10%~30%，流行期間為30%~50%，且可引起地區性和世界性流行。雖然 大環內酯類等抗生素可控制感染，但耐藥菌株的不斷增多給臨床治療帶來了困難。因此，利 用免疫優勢抗原基因研制疫苗，是預防和控制感染的關鍵。目前對其主要表面膜蛋白的全 基因序列已經測定并已公布，為利用基因工程技術研究診斷試劑、疫苗及篩選抗病毒藥物 奠定了基礎。
[0005] 肺炎支原體用PPL0培養基可以體外培養，所以利用培養的肺炎支原體建立了檢 測肺炎支原體抗體的免疫熒光方法和酶聯免疫檢測法，但是用培養的肺炎支原體作抗原檢 測抗體，難以大量生產，亦會產生假陽性，研制特異的基因重組抗原是建立肺炎支原體特異 抗體檢測試劑的發展方向。預防Mp感染的最理想途徑是注射疫苗，但目前沒有預防Mp的 疫苗，國內外均在積極開展疫苗的研制，尤其對滅活疫苗的研究進展較快，基因工程疫苗是 最終的發展方向。

【發明內容】

[0006] 本發明目的是針對上述不足之處提供一種肺炎支原體蛋白抗原表位的融合蛋白 及其制備、應用。
[0007] 肺炎支原體感染人體后會刺激機體產生多種抗體，但有時血清內只有針對部分肺 炎支原體蛋白的抗體，可能與各種抗體產生的時間或機體的免疫狀態有關，所以在檢測血 清內的肺炎支原體抗體時要用多種抗原，以提高抗體檢出率。
[0008] P1粘附素是最主要的粘附蛋白和免疫優勢抗原，其中和抗體能阻止80%以上的Mp 粘附到宿主細胞。由此，P1蛋白是最具潛力的候選疫苗。P1蛋白和P30蛋白主要集聚在粘 附小體的頂端結構，能與呼吸道黏膜上皮細胞膜上的神經氨酸受體直接結合，從而使Mp粘 附到細胞表面。P116蛋白等主要參與或維持頂端結構的完整性和穩定性，構成Pl、P30等 粘附蛋白聚集頂端結構的支架，在Mp吸附于宿主細胞的過程中起輔助作用。通過計算機分 析肺炎支原體P116蛋白、P1蛋白和P30蛋白的氨基酸序列，我們篩選出含強抗原表位的肺 炎支原體的P116蛋白片段、P1蛋白片段和P30蛋白片段，選擇真核和原核生物均偏愛的密 碼子，化學合成全新的P116蛋白片段、P1蛋白片段和P30蛋白片段的基因序列，將三個基 因片段串聯，利用基因工程技術表達P116蛋白片段、P1蛋白片段和P30蛋白片段的融合蛋 白，表達的融合蛋白可用于疫苗及肺炎支原體抗體或抗原的檢測等。
[0009] 本發明是通過計算機分析肺炎支原體P116蛋白、P1蛋白和P30蛋白的氨基酸序 列，篩選出含強抗原表位的肺炎支原體的P116蛋白片段，即第261個氨基酸至第466個氨 基酸，共206個氨基酸，含強抗原表位的肺炎支原體的P1蛋白片段，即第1125個氨基酸至 第1395個氨基酸，共271個氨基酸，和含強抗原表位的肺炎支原體的P30蛋白片段，即第 107個氨基酸至第161氨基酸，共55個氨基酸。選擇真核和原核生物均偏愛的密碼子，化學 合成全新的肺炎支原體P116蛋白片段、P1蛋白片段和P30蛋白片段的串聯基因序列，利用 基因工程技術表達P116蛋白片段、P1蛋白片段和P30蛋白片段的融合蛋白，三個蛋白片 段之間用甘氨酸-甘氨酸-絲氨酸連接，融合蛋白全長538個氨基酸。表達的融合蛋白可 用于疫苗及肺炎支原體抗體或抗原的檢測，及用于肺炎支原體單抗和多抗制備等。
[0010] 肺炎支原體蛋白抗原表位的融合蛋白及其制備、應用是采取以下技術方案實現： 一種肺炎支原體P116蛋白片段、P1蛋白片段和P30蛋白片段的融合蛋白，即肺炎支原 體的肺炎支原體的P116蛋白的第261個氨基酸至第466個氨基酸片段、P1蛋白的第1125 個氨基酸至第1395個氨基酸片段、肺炎支原體的P30蛋白的第107個氨基酸至第161個氨 基酸片段的融合蛋白，P116蛋白片段在融合蛋白的N端，P1C蛋白片段在融合蛋白的中間， P30蛋白片段在融合蛋白的C端，三個蛋白片段之間用甘氨酸-甘氨酸-絲氨酸連接，融合 蛋白全長538個氨基酸，氨基酸序列如下：


[0011] 所述的肺炎支原體P116蛋白片段、P1蛋白片段和P30蛋白片段的融合蛋白，通過 基因重組技術，利用細菌、酵母細胞、昆蟲細胞、哺乳動物細胞及轉基因動植物進行重組表 達、制備。
[0012] 所述的肺炎支原體P116蛋白片段、P1蛋白片段和P30蛋白片段的融合蛋白，融合 蛋白中肺炎支原體P116蛋白片段、P1蛋白片段和P30蛋白片段的任意組合連接，以融合蛋 白的形式進彳丁表達、制備。
[0013] 所述的肺炎支原體P116蛋白片段、P1蛋白片段和P30蛋白片段的融合蛋白，用于 疫苗、抗體或抗原檢測試劑的研制，及用于肺炎支原體單抗和多抗制備。
[0014] 肺炎支原體P116蛋白片段、P1蛋白片段和P30蛋白片段的融合蛋白，利用基因工 程技術表達、制備該蛋白，具體方法如下： 1.肺炎支原體P116蛋白、P1蛋白和P30蛋白抗原表位的篩選及其基因片段的化學合 成： 利用ANTHEWIN等軟件，通過計算機分析肺炎支原體P116蛋白、P1蛋白和P30蛋白的 氨基酸序列，發現P116蛋白的N端第261個氨基酸至第466個氨基酸含有較強的抗原決定 簇，P1蛋白的N端第1125個氨基酸至第1395個氨基酸含有較強的抗原決定簇，P30蛋白 的N端第107個氨基酸至第161個氨基酸含有較強的抗原決定簇。選擇真核和原核生物均 偏愛的密碼子，化學合成全新的肺炎支原體P116蛋白片段、P1蛋白片段和P30蛋白片段的 串聯基因序列，將三個基因片段串聯，利用基因工程技術表達P116蛋白片段、P1蛋白片段 和P30蛋白片段的融合蛋白，融合蛋白從N端到C端依次為P116蛋白片段、P1蛋白片段 和P30蛋白片段，三個蛋白片段之間用甘氨酸-甘氨酸-絲氨酸連接，融合蛋白全長538個 氨基酸。在合成的融合蛋白基因片段的5'端增加了 AWel酶切位點，在3'端增加了終止密 碼子TAA和&〇RI酶切位點。使合成的融合蛋白基因片段易于克隆至質粒pET28a(+)內的 Uel和方coRI酶切位點內。
[0015] 篩選的肺炎支原體P116蛋白內的抗原表位氨基酸序列（第261個aa -第466個 aa)：
篩選的肺炎支原體P1蛋白內的抗原表位氨基酸序列(第1125個aa -第1395個aa):
篩選的肺炎支原體P30蛋白內的抗原表位氨基酸序列(第107個aa -第161個aa):
化學合成的肺炎支原體P116蛋白片段、P1蛋白片段和P30蛋白片段的串聯基因序列 (1629bp)：
2.表達肺炎支原體P116蛋白片段、P1蛋白片段和P30蛋白片段的融合蛋白重組質粒 的構建： 提取質粒pET28a (+)(美國Novagen公司產品)，用Λ% I和AcoR I雙酶切，電泳后 回收酶切的質粒大片段，溶于去離子水內。用I和及mHI雙酶切化學合成的肺炎支 原體融合蛋白基因片段，電泳回收后，溶于去離子水內。取等摩爾濃度的上述三種酶切后 DNA片段，在同一離心管內用T4 DNA連接酶連接，插入到載體pET28a (+)內的yWe I和 此〇R I位點之間，表達一個肺炎支原體P116蛋白片段、P1蛋白片段和P30蛋白片段的融合 蛋白。
[0016] 構建的重組質粒表達肺炎支原體P116蛋白片段、P1蛋白片段和P30蛋白片段的 融合蛋白，在其N端為P116蛋白片段，長206個氨基酸，中間部分為P1蛋白片段，長271個 氨基酸，C端為P30蛋白片段，長55個氨基酸，三者之間由氨酸-甘氨酸-絲氨酸三個氨基 酸連接，融合蛋白全長538aa，其氨基酸序列如下：

3.重組質粒的篩選與鑒定： 將重組質粒轉化大腸桿菌BL21 (DE3)，涂布含卡那霉素（60 μ g / ml) LB平板，置37°C 過夜。次日隨機挑取轉化菌落和對照菌（質粒pET28a轉化菌），分別提取質粒，將含有串聯 基因的質粒進行DNA序列分析，序列分析證實重組質粒含有連接在一起的肺炎支原體P116 蛋白基因片段、P1蛋白基因片段與P30蛋白基因片段，序列完全正確。
[0017] 4.表達融合蛋白工程菌的篩選鑒定： 將含有重組質粒的陽性轉化子，接種至含3ml LB培養基（含卡那毒素60 yg / ml)的 試管內，37°C振蕩培養3h，加 IPTG至終濃度0. 5mmol/L，繼續振蕩培養誘導6h，離心收集菌 體進行SDS-PAGE檢測，轉化子表達相對分子量約為60 kD的肺炎支原體P116蛋白片段、 P1蛋白片段和P30蛋白片段的融合蛋白，而對照菌BL21(DE3)無此蛋白帶。
[0018] 5.表達肺炎支原體P116蛋白片段、P1蛋白片段和P30蛋白片段的融合蛋白的純 化： 1)表達肺炎支原體P116蛋白片段、P1蛋白片段和P30蛋白片段的融合蛋白工程菌的 超聲裂解 將誘導表達融合蛋白的工程菌離心（8000 rpm、10 min、4°C)收菌，菌體重懸于原培養 液1 / 10 體積的細菌裂解液（20 mmol/L PB pH7.4、10 mmol/L EDTA、1 mmol/L DTT、5% 甘 油）內，冰浴超聲破菌，離心收集上清。
[0019] 2)表達肺炎支原體P116蛋白片段、P1蛋白片段和P30蛋白片段的融合蛋白的鎳 離子親和層析柱純化 用平衡液（20 mmol/L PB pH7. 4)沖洗平衡鎳離子親和層析柱，然后將上步超聲破碎離 心好的上清直接上柱，上樣結束后用平衡液液充分洗柱，再依次用含梯度濃度咪唑的平衡 液洗脫蛋白，收集各洗脫峰蛋白，用SDS - PAGE電泳檢測各峰蛋白，確定哪個洗脫峰含表 達的肺炎支原體P116蛋白片段、P1蛋白片段和P30蛋白片段的融合蛋白，200 mmol/L咪 唑洗脫蛋白峰即為肺炎支原體P116蛋白片段、P1蛋白片段和P30蛋白片段的融合蛋白； 6.純化的肺炎支原體P116蛋白片段、P1蛋白片段和P30蛋白片段的融合蛋白用作抗 原檢測肺炎支原體抗體： 將復性的肺炎支原體P116蛋白片段、P1蛋白片段和P30蛋白片段的融合蛋白用50 mmol/L的碳酸鹽（pH9. 6)倍比稀釋后包被酶聯板，間接酶聯免疫法檢測制備的抗肺炎支原 體、兔陽性血清及空白對照血清，肺炎支原體P116蛋白片段、P1蛋白片段和P30蛋白片段 的融合蛋白能與抗肺炎支原體陽性血清反應，不與空白對照血清反應，說明表達的肺炎支 原體P116蛋白片段、P1蛋白片段和P30蛋白片段的融合蛋白有較好抗原性和特異性。
[0020] 7.用辣根過氧化物酶（HRP)標記肺炎支原體P116蛋白片段、P1蛋白片段和P30 蛋白片段的融合蛋白，用撲獲法或夾心法檢測抗肺炎支原體IgM或IgG抗體。肺炎支原體 P116蛋白片段、P1蛋白片段和P30蛋白片段的融合蛋白用作抗原，用金標法檢測抗肺炎支 原體抗體。
[0021] 8.將表達的肺炎支原體P116蛋白片段、P1蛋白片段和P30蛋白片段的融合蛋白， 用于疫苗、肺炎支原體抗體或抗原的檢測及用于免疫制備抗肺炎支原體單抗和多抗等。
[0022] 9.將肺炎支原體P116蛋白基因片段、P1蛋白基因片段與P30蛋白基因片段連接， 以融合蛋白的形式進行表達、制備。
[0023] 10.通過基因重組技術，利用細菌、酵母細胞、昆蟲細胞、哺乳動物細胞及轉基因動 植物進行重組表達、制備肺炎支原體P116蛋白片段、P1蛋白片段和P30蛋白片段的融合蛋 白。
[0024] 英文縮寫說明：Mp (Mycoplasma pneumoniae):肺炎支原體；EDTA:乙二胺四乙 酸；IPTG:異丙基硫代半乳糖苷；DTT:二硫蘇糖醇；SDS:十二烷基磺酸納；PAGE:聚丙烯 酰胺凝膠電泳；SKL:肌苷酸納；PB:磷酸鹽緩沖液；DNA:脫氧核糖核酸；RNA:核糖核酸； kD:千道爾頓；Triton:曲拉通。
[0025] 本發明與現有技術相比具有的優點 我們表達的肺炎支原體的P116蛋白片段、P1蛋白片段與P30蛋白片段的融合蛋白，有 較多優點： 1. 現在應用的肺炎支原體抗體的酶聯免疫檢測試劑盒，其使用的抗原是全病毒抗原， 生產較危險、成本高、與其它呼吸道病原體有交叉反應等缺點。表達的肺炎支原體的P116 蛋白片段、P1蛋白片段與P30蛋白片段的融合蛋白用作抗原可克服上述缺點。
[0026] ① 2. 表達的肺炎支原體的P116蛋白片段、P1蛋白片段與P30蛋白片段的融合蛋白以可 溶性形式存在，易于純化，且不需要復性處理。
[0027] 3.將肺炎支原體的P116蛋白片段、P1蛋白片段與P30蛋白片段融合表達，比分 別使用三個單獨的蛋白片段更方便、經濟。用這兩個蛋白作抗原檢測抗肺炎支原體抗體時， 不再需要分別制備這三種蛋白，也不需要調整三個抗原的使用比例，因此應用方便且成本 較低。用捕獲法或夾心法檢測抗肺炎支原體抗體時，只需酶標記這一種融合蛋白，不再需要 分別標記三個蛋白。
[0028] 4.目前沒有肺炎支原體疫苗。滅活疫苗的研究取得了較大進展，但是生產成本高、 危險大。肺炎支原體最主要的P1蛋白，是介導病原體和宿主細胞結合的主要蛋白，封閉該 蛋白的結合位點可阻止病原體感染細胞，所以肺炎支原體的P1蛋白是研制疫苗的首選蛋 白。P116蛋白和P30蛋白可刺激機體產生較強的細胞免疫。我們利用基因工程技術表達制 備肺炎支原體的P116蛋白片段、P1蛋白片段和P30蛋白片段的融合蛋白，為研制基因工程 疫苗奠定基礎。基因工程疫苗具有安全、成本低的優點。
【附圖說明】
[0029] 以下將結合附圖對本發明作進一步說明： 圖1是分子生物學軟件對肺炎支原體P116蛋白的抗原表位進行分析結果。結果顯示， 在肺炎支原體的P116蛋白N端從第261個氨基酸到第466個氨基酸，含有強的親水性抗原 表位，即圖內箭頭標示的位置。
[0030] 圖2是分子生物學軟件對肺炎支原體P1蛋白的抗原表位進行分析結果。結果顯 示，在肺炎支原體的P1蛋白N端從第1125個氨基酸到第1395個氨基酸，含有強的親水性 抗原表位，即圖內箭頭標示的位置。
[0031] 圖3是分子生物學軟件對肺炎支原體P30蛋白的抗原表位進行分析結果。結果顯 示，在肺炎支原體的P30蛋白N端從第107個氨基酸到第161個氨基酸，含有強的親水性抗 原表位，即圖內箭頭標示的位置。
[0032] 圖4是表達肺炎支原體的P116蛋白片段、P1蛋白片段和P30蛋白片段的融合蛋 白的重組質粒構建流程圖。
[0033] 圖5是用1. 2 %的Agarose凝膠檢測轉化子。Ml:高分子量DNA標準 (TaKaRa，DL10000) ;M2:低分子量DNA標準（TaKaRa，DL5000) ;1 :化學合成的含有目的基因 的片段。
[0034] 圖6是表達肺炎支原體的P116蛋白片段、P1蛋白片段和P30蛋白片段融合蛋白的 工程菌的SDS-PAGE分析結果。4:低分子量蛋白標準（Pharmacia) ;1、2、3、5、6、7、8、12、13: 第1、2、3、4、5、6、7、11、12號9個重組子均表達相對分子量約為60000的目的融合蛋白，即 圖內箭頭標示的位置。9、10、11 :第8、9、10號3個轉化子未表達目的蛋白。14、15 :0. 5%BSA、 1%BSA 圖7是表達肺炎支原體的P116蛋白片段、P1蛋白片段和P30蛋白片段的融合蛋白純 化前后的SDS-PAGE分析結果。8:低分子量蛋白標準（Pharmacia) ;1 :穿流峰；2 :20mM咪 唑洗脫；3 :50mM咪唑洗脫；4 :100mM咪唑洗脫；5 :200mM咪唑洗脫；6 :500mM咪唑洗脫后 的融合蛋白；7 :1%BSA。 圖8是ELISA檢測兔免疫抗血清的結果示意圖。
【具體實施方式】
[0035] 本發明實施方式的詳細說明： 肺炎支原體的P116蛋白、P1蛋白和P30蛋白抗原表位的分析、基因合成及表達 通過計算機分析肺炎支原體P116蛋白、P1蛋白和P30蛋白的氨基酸序列，篩選出含強 抗原表位的肺炎支原體的P116蛋白片段，即第261個氨基酸至第466氨基酸，含強抗原表 位的肺炎支原體的P1蛋白片段，即第1125個氨基酸至第1395氨基酸，和含強抗原表位的 肺炎支原體的P30蛋白片段，即第107個氨基酸至第161個氨基酸。
[0036] 選擇真核和原核生物均偏愛的密碼子，化學合成全新的肺炎支原體P116蛋白片 段、P1蛋白片段和P30蛋白片段的串聯基因序列，利用基因工程技術將串聯基因片段，克隆 至質粒pET28a(+)內的Λ%1 /此oRI位點，表達P116蛋白片段、P1蛋白片段和P30蛋白 片段的融合蛋白，融合蛋白從N端到C端依次為P116蛋白片段、P1蛋白片段和P30蛋白 片段，長538個氨基酸。
[0037] 將重組質粒轉化大腸桿菌BL21 (DE3)，篩選獲得了高效表達肺炎支原體P116蛋白 片段、P1蛋白片段和P30蛋白片段融合蛋白的工程菌，表達的肺炎支原體的融合蛋白約占 菌體蛋白總量的30%左右。
[0038] 材料與方法 1.菌種與質粒：宿主菌BL21(DE3)及表達載體pET28a(+)為美國Novagen公司產品。
[0039] 2.分子生物學試劑：限制性內切酶Λ%1、此oRI、及T4 DNA連接酶為TaKaRa公司 產品。質粒純化試劑盒及從瓊脂糖凝膠內回收DNA片段的試劑盒為TaKaRa公司產品。DTT 及IPTG為TaKaRa公司產品。其它試劑為進口或國產分析純試劑。
[0040] 3.基因片段的合成：由南京金斯瑞公司幫助合成。
[0041] 4.基因克隆方法：DNA的酶切、連接、電泳；質粒的提取、轉化；蛋白的SDS-PAGE 分析等一般分子克隆方法按常規方法進行。其它試劑盒按說明書進行操作。
[0042] 5. DNA序列分析：用南京金斯瑞公司質粒純化試劑盒純化質粒，用DNA全自動測 序儀測序。
[0043] 結果 1.肺炎支原體P116蛋白、P1蛋白和P30蛋白抗原表位的篩選及其基因片段的化學合 成： 利用ANTHEWIN等軟件，通過計算機分析肺炎支原體P116蛋白、P1蛋白和P30蛋白的 氨基酸序列（GeneBank，登錄號分別為：AGC041381、AAA883251和AAB366031)，發現P116蛋 白的N端第261個氨基酸至第466個氨基酸含有較強的抗原決定簇（圖1)，P1蛋白的N端 第1125個氨基酸至第1395個氨基酸含有較強的抗原決定簇（圖2)，P30蛋白的N端第107 個氨基酸至第161個氨基酸含有較強的抗原決定簇（圖3)。
[0044] 篩選的肺炎支原體P116蛋白內的抗原表位氨基酸序列（第261個aa -第466個 aa)：
篩選的肺炎支原體P1蛋白內的抗原表位氨基酸序列(第1125個aa -第1395個aa):
篩選的肺炎支原體P30蛋白內的抗原表位氨基酸序列(第107個aa -第161個aa):
選擇真核和原核生物均偏愛的密碼子，化學合成包含上述抗原決定簇的P116蛋白、 P1蛋白和P30蛋白的串聯基因序列。在合成的融合蛋白基因片段的5'端增加了 AWel酶 切位點，在3'端增加了此〇# I酶切位點。使合成的串聯基因片段易于串聯克隆至質粒 pET28a (+)內的AWel和方coRI酶切位點內。
[0045] 化學合成的肺炎支原體P116蛋白片段、P1蛋白片段和P30蛋白片段的串聯基因 序列（1629bp):
EcoRl 2.表達肺炎支原體P116蛋白片段、P1蛋白片段和P30蛋白片段的融合蛋白重組質粒 的構建： 提取質粒pET28a (+)(美國Novagen公司產品)，用Λ% I和AcoR I雙酶切，電泳后 回收酶切的質粒大片段，溶于去離子水內。用I和EcoRI雙酶切化學合成的肺炎支原 體融合蛋白基因片段，電泳回收后，溶于去離子水內。
[0046] 取等摩爾濃度的上述兩種酶切后DNA片段，在同一離心管內用T4 DNA連接酶連 接，使肺炎支原體P116蛋白基因片段、P1蛋白基因片段與P30蛋白基因片段插入到載體 pET28a (+)內的Λ% I和此oR I位點之間，表達一個肺炎支原體P116蛋白片段、P1蛋白 片段和P30蛋白片段的融合蛋白。構建流程見圖4。
[0047] 3.重組質粒的篩選與鑒定： 將上步連接的重組質粒轉化到大腸桿菌BL21(DE3)，將轉化產物涂布含卡那霉素 (eOPg / ml)的固體LB培養基上，置37°C培養過夜。次日隨機挑選轉化子菌落，并接種到含 4 ml液體LB培養基(含卡那霉素60yg / ml)的試管內，置37°C振蕩培養6h，取菌液lml， 離心收菌。分別用50μ1去離子水懸浮菌體，沸水煮5min,離心（4°C，12000rpm )5min，測 定質粒內的肺炎支原體P116蛋白基因片段，P1蛋白基因片段與P30蛋白基因片段的串聯 基因序列，DNA序列分析證實，重組質粒含有串聯的肺炎支原體P116蛋白基因片段，P1蛋白 基因片段與P30蛋白基因片段，序列完全正確。
[0048] 構建的重組質粒表達肺炎支原體P116蛋白基因片段，P1蛋白基因片段與P30蛋 白基因片段的融合蛋白，全長538個氨基酸，在其N端為P116蛋白片段，長206個氨基酸， 中間部分為P1蛋白片段，長271個氨基酸，C端為P30蛋白片段，長55個氨基酸，三者之間 由氨酸-甘氨酸-絲氨酸三個氨基酸連接，其氨基酸序列如下：


4.表達融合蛋白工程菌的篩選鑒定： 將挑選的11個轉化子接種至含3ml LB培養基（含卡那毒素60 yg / ml)的試管內， 37°C振蕩培養3h，加 IPTG至終濃度0. 5mmol/L，繼續振蕩培養誘導6h，離心收集菌體進行 SDS-PAGE檢測，第1、2、3、4、5、6、7、11、12號號4個轉化子表達相對分子量約為60 kD的 肺炎支原體S蛋白和N蛋白的融合蛋白，而第8、9、10號3個轉化子無此蛋白帶（圖6)。
[0049] 表達肺炎支原體P116蛋白片段、P1蛋白片段和P30蛋白片段的融合蛋白的純化 根據表達肺炎支原體P116蛋白片段、P1蛋白片段和P30蛋白片段的融合蛋白的氨基 酸序列，分析其理化特性，確定適當的純化方法。經計算機分析，表達肺炎支原體P116蛋白 片段、P1蛋白片段和P30蛋白片段的融合蛋白含有His標簽，因此我們決定在pH為7. 4 的磷酸鹽緩沖液內，用鎳離子親和層析柱純化。具體步驟如下： 材料和方法 1.主要試劑： 鎳離子凝膠為南京金斯瑞公司產品，IPTG、DTT為TaTaRa公司產品。其它試劑為國產 或進口分析純試劑。
[0050] 2.表達肺炎支原體P116蛋白片段、P1蛋白片段和P30蛋白片段的融合蛋白的工 程菌的誘導表達及超聲裂解 從接種有5號工程菌的LB平板上，挑取單菌落，接種到含200ml LB液體培養基的三角 燒瓶內，加卡那霉素至終濃度6(^g/ml，置37°C搖床內培養過夜。次日，將菌液接種到4個 分別含200ml LB液體培養基的三角燒瓶，每瓶接種菌液50ml，置37°C搖床內振蕩培養1小 時，然后加 IPTG至終濃度0. lmmol/L，誘導表達4小時。
[0051] 將誘導表達融合蛋白的1000ml工程菌離心（8000 rpm、10 min、4°C )收菌，菌體 重懸于 100ml 的細菌裂解液（20 mmol/L PB pH7.4、10 mmol/L EDTA、1 mmol/L DTT、5% 甘 油）內，冰浴超聲破菌10 min，離心（12000 rpm、30 min、4°C)收集上清。
[0052] 3.表達肺炎支原體P116蛋白片段、P1蛋白片段和P30蛋白片段的融合蛋白的鎳 離子親和層析柱純化 用平衡液（20 mmol/L PB pH7. 4)沖洗平衡鎳離子親和層析柱，然后將上步破碎離心好 的上清直接上柱，上樣流速1.5 ml / min。上樣結束后用平衡液充分洗柱，再依次用含20、 50、100、200、500 mmol/L咪唑的平衡液洗脫蛋白，收集各洗脫峰蛋白，用12% SDS - PAGE 電泳檢測各峰蛋白，確定哪個洗脫峰含表達的肺炎支原體P116蛋白片段、P1蛋白片段和 P30蛋白片段的融合蛋白。
[0053] 結果 將不同濃度咪唑從鎳柱上洗脫的蛋白進行SDS-PAGE分析，結果顯示（見圖7)，電泳結 果顯示，200 mmol/L咪唑洗脫蛋白峰即為肺炎支原體P116蛋白片段、P1蛋白片段和P30蛋 白片段的融合蛋白，顯色一條很濃的肺炎支原體的P116蛋白片段、P1蛋白片段和P30蛋 白片段的融合蛋白（約60 kD處），其它洗脫峰內無明顯肺炎支原體P116蛋白片段、P1蛋 白片段和P30蛋白片段的融合蛋白帶。
[0054] 肺炎支原體P116蛋白片段、P1蛋白片段和P30蛋白片段的融合蛋白的多抗血清 的制備及純化 將純化的重組肺炎支原體P116蛋白片段、P1蛋白片段和P30蛋白片段的融合蛋白用 作抗原制備多抗血清，我們使用抗原通過與佐劑聯合免疫新西蘭大耳白兔的方式，制備并 純化獲得大量的兔抗血清，間接ELISA法檢測抗肺炎支原體抗體滴度。
[0055] 材料和方法 1.主要試劑： DEAE Sepharose? Fast Flow為GE Heathcare公司產品，完全弗氏佐劑和不完全弗氏 佐劑為SIGMA公司產品。其他試劑為國產或進口分析純試劑。
[0056] 2.免疫原及免疫程序： 使用融合蛋白作為免疫原，免疫5只新西蘭大耳白兔，每只白兔免疫100 μ g抗原，免疫 方式為背部多點免疫。第一次免疫使用完全弗氏佐劑與抗原混合，第二、三次免疫使用不完 全弗氏佐劑。
[0057] 3.間接ELISA法測抗血清效價： 每次免疫后2周，從兔耳緣靜脈取血，4000rpm離心10min獲得抗血清。包被融合蛋白， 每孔1 μ g，4°C過夜，20%小牛血清封閉，37°C，2h，將離心獲得的抗血清梯度稀釋作為一抗， 37°C，2h后，加二抗，1:5000稀釋羊抗兔IgG，加 A，B液顯色并讀數。
[0058] 4.抗血清的獲取： 間接ELISA法測定血清效價達到一定高度后，從兔頸動脈取血，4 °C過夜后，3000rpm， 離心10min，獲得抗血清，過濾除菌，-20°C凍存。
[0059] 5.抗血清的純化： 等體積飽和（NH4)2S04，溶液與血清混勻，4°C靜置lh后，3000rpm離心10min，棄上清， 使用0. 07M Na3P04溶液溶解沉淀，透析后上柱，DEAE S印harose? Fast Flow陰離子交換 層析法純化多抗。
[0060] 結果 最后一次免疫后2周，采用兔頸動脈取血法取得血液60ml，4°C放置過夜后分離血清， DEAE Sepharose? Fast Flow陰離子交換層析法純化多抗作為ELISA檢測中的一抗，結果 顯示1:100000為血清有效稀釋梯度，即血清效價，如圖8,說明制備的肺炎支原體的P116蛋 白片段、P1蛋白片段和P30蛋白片段的融合蛋白具有較好的抗原性和特異性。
【主權項】
1. 一種肺炎支原體P116蛋白片段、Pl蛋白片段和P30蛋白片段的融合蛋白，即肺炎支 原體的肺炎支原體的Pl 16蛋白的第261個氨基酸至第466個氨基酸片段、Pl蛋白的第1125 個氨基酸至第1395個氨基酸片段、肺炎支原體的P30蛋白的第107個氨基酸至第161個氨 基酸片段的融合蛋白，P116蛋白片段在融合蛋白的N端，PlC蛋白片段在融合蛋白的中間， P30蛋白片段在融合蛋白的C端，三個蛋白片段之間用甘氨酸-甘氨酸-絲氨酸連接，融合 蛋白全長538個氨基酸，氨基酸序列如下： Lys Tyr Leu Asn Thr His Val Lys Ala Glu Asp Val Lys Lys Asp Val 15 10 15 Asn Ala Asn He Lys Asn Gln Phe Asp He Ala Lys He He Ala Glu 20 25 30 Leu Met Gly Lys Ala Leu Lys Glu Phe Gly Asn Gln Gln Glu Gly Gln 35 40 45 Pro Leu Ser Phe Leu Lys Val MET Asp Lys Val Lys Glu Asp Phe Glu 50 55 60 Lys Leu Phe Asn Leu Val Arg Pro Gly Leu Gly Lys Phe Val Lys Asp 65 70 75 80 Leu He Gln Ser Ser Ser Gln Ala Glu Asn Lys lie Thr Val Tyr Lys 85 90 95 Leu He Phe Asp Asn Lys Lys Thr lie Leu Asn Leu Leu Lys Glu Leu 100 105 HO Ser He Pro Glu Leu Asn Ser Ser Leu Gly Leu Val Asp Val Leu Phe 115 120 125 Asp Gly He Thr Asp Ser Asp Gly Leu Tyr Glu Arg Leu Gln Ser Phe 130 135 140 Lys Asp Leu He Val Pro Ala Val Lys Thr Asn Glu Lys Thr Ala Ala 145 150 155 160 Leu Ser Pro Leu He Glu Glu Leu Leu Thr Gln Lys Asp Thr Tyr Val 165 170 175 Phe Asp Leu He Gln Lys His Lys Gly lie Leu Thr Asn Leu Leu Lys 180 185 190 Asn Phe Leu Ala Asp Phe Gln Lys Ser Thr Pro Phe Met Ala Gly Gly 195 200 205 Ser Thr Asp Phe Val Lys Pro Arg Ala Gly Tyr Leu Gly Leu Gln Leu 210 215 220 Thr Gly Leu Asp Ala Ser Asp Ala Thr Gln Arg Ala Leu lie Trp Ala 225 230 235 240 Pro Arg Pro Trp Ala Ala Phe Arg Gly Ser Trp Val Asn Arg Leu Gly 245 250 255 Arg Val Glu Ser Val Trp Asp Leu Lys Gly Val Trp Ala Asp Gln Ala 260 265 270 Gln Ser Asp Ser Gln Gly Ser Thr Thr Thr Ala Thr Arg Asn Ala Leu 275 280 285 Pro Glu His Pro Asn Ala Leu Ala Phe Gln Val Ser Val Val Glu Ala 290 295 300 Ser Ala Tyr Lys Pro Asn Thr Ser Ser Gly Gln Thr Gln Ser Thr Asn 305 310 315 320 Ser Ser Pro Tyr Leu His Leu Val Lys Pro Lys Lys Val Thr Gln Ser 325 330 335 Asp Lys Leu Asp Asp Asp Leu Lys Asn Leu Leu Asp Pro Asn Gln Val 340 345 350 Arg Thr Lys Leu Arg Gln Ser Phe Gly Thr Asp His Ser Thr Gln Pro 355 360 365 Gln Pro Gln Ser Leu Lys Thr Thr Thr Pro Val Phe Gly Thr Ser Ser 370 375 380 Gly Asn Leu Ser Ser Val Leu Ser Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Ser 385 390 395 400 Ser Gly Ser Gly Gln Ser Gly Val Asp Leu Ser Pro Val Glu Lys Val 405 410 415 Ser Gly Trp Leu Val Gly Gln Leu Pro Ser Thr Ser Asp Gly Asn Thr 420 425 430 Ser Ser Thr Asn Asn Leu Ala Pro Asn Thr Asn Thr Gly Asn Asp Val 435 440 445 Val Gly Val Gly Arg Leu Ser Glu Ser Asn Ala Ala Lys Met Asn Asp 450 455 460 Asp Val Asp Gly He Val Arg Thr Pro Leu Ala Glu Leu Leu Asp Gly 465 470 475 480 Gly Gly Ser Leu Leu Glu Glu Lys Glu Arg Gln Glu Gln Leu Ala Glu 485 490 495 Gln Leu Gln Arg lie Ser Ala Gln Gln Glu Glu Gln Gln Ala Leu Glu 500 505 510 Gln Gln Ala Ala Ala Glu Ala His Ala Glu Ala Glu Val Glu Pro Ala 515 520 525 Pro Gln Pro Val Pro Val Pro Pro Gln Pro 530 535 〇2.權利要求1所述的肺炎支原體P116蛋白片段、Pl蛋白片段和P30蛋白片段的融合 蛋白，利用基因工程技術表達、制備該蛋白，具體方法如下： 肺炎支原體P116蛋白、Pl蛋白和P30蛋白抗原表位的篩選及其基因片段的化學合成： 利用ANTHEWIN等軟件，通過計算機分析肺炎支原體P116蛋白、Pl蛋白和P30蛋白的 氨基酸序列，發現P116蛋白的N端第261個氨基酸至第466個氨基酸含有較強的抗原決定 簇，Pl蛋白的N端第1125個氨基酸至第1395個氨基酸含有較強的抗原決定簇，P30蛋白 的N端第107個氨基酸至第161個氨基酸含有較強的抗原決定簇；選擇真核和原核生物均 偏愛的密碼子，化學合成全新的肺炎支原體P116蛋白片段、Pl蛋白片段和P30蛋白片段的 串聯基因序列，將三個基因片段串聯，利用基因工程技術表達P116蛋白片段、Pl蛋白片段 和P30蛋白片段的融合蛋白，融合蛋白從N端到C端依次為P116蛋白片段、Pl蛋白片段 和P30蛋白片段，三個蛋白片段之間用甘氨酸-甘氨酸-絲氨酸連接，融合蛋白全長538個 氨基酸；在合成的融合蛋白基因片段的5'端增加了 AWeI酶切位點，在3'端增加了終止密 碼子TAA和及^oRI酶切位點；使合成的融合蛋白基因片段易于克隆至質粒pET28a(+)內的 UeI和方coRI酶切位點內； 篩選的肺炎支原體P116蛋白內的抗原表位氨基酸序列(第261個aa -第466個aa): Lys Tyr Leu Asn Thr His Val Lys Ala Glu Asp Val Lys Lys Asp Val Asn Ala Asn He Lys Asn Gln Phe Asp He Ala Lys He He Ala Glu Leu Met Gly Lys Ala Leu Lys Glu Phe Gly Asn Gln Gln Glu Gly Gln Pro Leu Ser Phe Leu Lys Val Met Asp Lys Val Lys Glu Asp Phe Glu Lys Leu Phe Asn Leu Val Arg Pro Gly Leu Gly Lys Phe Val Lys Asp Leu He Gln Ser Ser Ser Gln Ala Glu Asn Lys He Thr Val Tyr Lys Leu He Phe Asp Asn Lys Lys Thr He Leu Asn Leu Leu Lys Glu Leu Ser He Pro Glu Leu Asn Ser Ser Leu Gly Leu Val Asp Val Leu Phe Asp Gly He Thr Asp Ser Asp Gly Leu Tyr Glu Arg Leu Gln Ser Phe Lys Asp Leu He Val Pro Ala Val Lys Thr Asn Glu Lys Thr Ala Ala Leu Ser Pro Leu He Glu Glu Leu Leu Thr Gln Lys Asp Thr Tyr Val Phe Asp Leu He Gln Lys His Lys Gly He Leu Thr Asn Leu Leu Lys Asn Phe Leu Ala Asp Phe Gln Lys Ser Thr Pro Phe Met Ala 篩選的肺炎支原體Pl蛋白內的抗原表位氨基酸序列(第1125個aa -第1395個aa): Thr Asp Phe Val Lys Pro Arg Ala Gly Tyr Leu Gly Leu Gln Leu Thr Gly Leu Asp Ala Ser Asp Ala Thr Gln Arg Ala Leu He Trp Ala Pro Arg Pro Trp Ala Ala Phe Arg Gly Ser Trp Val Asn Arg Leu Gly Arg Val Glu Ser Val Trp Asp Leu Lys Gly Val Trp Ala Asp Gln Ala Gln Ser Asp Ser Gln Gly Ser Thr Thr Thr Ala Thr Arg Asn Ala Leu Pro Glu His Pro Asn Ala Leu Ala Phe Gln Val Ser Val Val Glu Ala Ser Ala Tyr Lys Pro Asn Thr Ser Ser Gly Gln Thr Gln Ser Thr Asn Ser Ser Pro Tyr Leu His Leu Val Lys Pro Lys Lys Val Thr Gln Ser Asp Lys Leu Asp Asp Asp Leu Lys Asn Leu Leu Asp Pro Asn Gln Val Arg Thr Lys Leu Arg Gln Ser Phe Gly Thr Asp His Ser Thr Gln Pro Gln Pro Gln Ser Leu Lys Thr Thr Thr Pro Val Phe Gly Thr Ser Ser Gly Asn Leu Ser Ser Val Leu Ser Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Ser Ser Gly Ser Gly Gln Ser Gly Val Asp Leu Ser Pro Val Glu Lys Val Ser Gly Trp Leu Val Gly Gln Leu Pro Ser Thr Ser Asp Gly Asn Thr Ser Ser Thr Asn Asn Leu Ala Pro Asn Thr Asn Thr Gly Asn Asp Val Val Gly Val Gly Arg Leu Ser Glu Ser Asn Ala Ala Lys Met Asn Asp Asp Val Asp Gly He Val Arg Thr Pro Leu Ala Glu Leu Leu Asp Gly 篩選的肺炎支原體P30蛋白內的抗原表位氨基酸序列(第107個aa -第161個aa): Leu Leu Glu Glu Lys Glu Arg Gln Glu Gln Leu Ala Glu Gln Leu Gln Arg He Ser Ala Gln Gln Glu Glu Gln Gln Ala Leu Glu Gln Gln Ala Ala Ala Glu Ala His Ala Glu Ala Glu Val Glu Pro Ala Pro Gln Pro Val Pro Val Pro Pro Gln Pro 化學合成的肺炎支原體P116蛋白片段、Pl蛋白片段和P30蛋白片段的串聯基因序列 (1629bp)： Ndel Cat atg AM TAC CTG AAT ACC CAC GTT AM GCG GAA GAT GTG AM AM GAT GTG AAT GCT MT ATC AAA AAC CAG TTC GAC ATT GCT AAA ATC ATC GCG GAA CTG ATG GGT AAA GCC CTG AAA GAA TTT GGT AAC CAG CAA GAA GGC CAG CCG CTG AGC TTC CTG AAA GTC ATG GAC AAA GTG AAA GAA GAT TTC GAA AAA CTG TTC AAC CTG GTC CGT CCG GGT CTG GGC AAA TTT GTG AAA GAC CTG ATT CAA AGC TCT AGT CAG GCG GAA AAC AAA ATC ACC GTG TAC AAA CTG ATC TTC GAT AAC MG AAA ACC ATT CTG MT CTG CTG AAA GAA CTG TCC ATC CCG GAA CTG AAC TCC TCA CTG GGC CTG GTT GAC GTC CTG TTT GAT GGT ATT ACC GAC TCC GAT GGC CTG TAT GAA CGC TTA CAG AGC TTT AAA GAC CTG ATC GTC CCG GCC GTG AAA ACC MT GAA AAA ACG GCG GCC CTG AGC CCG CTG ATT GAA GAA CTG CTG ACC CAA AAA GAC ACG TAC GTG TTT GAT CTG ATT CAG AAA CAT AAA GGT ATC CTG ACC AAC CTG CTG AAA MT TTT CTG GCG GAC TTC CAG AAA TCT ACC CCG TTT ATG GCC GGC GGT AGT ACG GAT TTC GTT AAA CCG CGT GCG GGT TAC CTG GGT CTG CAA CTG ACC GGC CTG GAC GCG AGC GAT GCA ACG CAG CGC GCG CTG ATC TGG GCA CCG CGT CCG TGG GCA GCT TTT CGC GGT TCG TGG GTC AAC CGT CTG GGC CGC GTT GAA AGC GTC TGG GAT CTG AAA GGT GTT TGG GCA GAC CAG GCT CAA TCG GAT AGC CAG GGC TCT ACC ACG ACC GCA ACC CGT AAC GCT CTG CCG GAA CAT CCG MT GCC CTG GCA TTC CAG GTG TCT GTG GTT GAA GCT AGT GCG TAT AAA CCG AAC ACC AGC AGC GGT CAG ACC CAG AGC ACC AAC AGC AGC CCG TAC CTG CAC CTG GTG AAA CCG AAA AAA GTT ACC CAG AGT GAC AAA CTG GAT GAC GAT CTG AAA AAC CTG CTG GAC CCG MT CAA GTT CGT ACG AAA CTG CGC CAG TCC TTT GGC ACC GAT CAT TCA ACG CAG CCG CAA CCG CAG TCT CTG AAA ACG ACC ACG CCG GTT TTC GGC ACC AGC AGC GGC MT CTG TCG AGC GTC CTG AGT GGC GGT GGC GCA GGT GGC GGT TCT AGT GGT TCG GGT CAG AGC GGC GTG GAT CTG TCG CCG GTG GAA AAA GTT AGC GGT TGG CTG GTT GGC CAG CTG CCG TCT ACC AGT GAC GGT AAC ACC AGC AGC ACC AAC MT CTG GCC CCG AAC ACC MT ACG GGC MT GAT GTC GTG GGT GTG GGC CGT CTG TCC GAA TCA AAC GCG GCC AAA ATG AAT GAC GAT GTT GAC GGC ATC GT CCG CAC CCC GCT GGC AGA ACT GCT GGA TGG CGG TGG CTC CCT GCT GGA AGA AAA AGA ACG TCA AGA ACA GCT GGC TGA ACA ACT GCA ACG CAT TTC AGC ACA GCA AGA AGA ACA GCA AGC TCT GGA ACAG CAA GCA GCT GCG GAA GCC CAC GCA GAA GCT GAA GTG GAA CCG GCG CCG CAA CCG GTG CCG GTT CCG CCG CAG CCG TAAGAA TTC BcoRI 表達肺炎支原體P116蛋白片段、Pl蛋白片段和P30蛋白片段的融合蛋白重組質粒的 構建： 提取質粒pET28a (+)(美國Novagen公司產品），用Λ% I和I雙酶切，電泳 后回收酶切的質粒大片段，溶于去離子水內；用AWe I和及MflI雙酶切化學合成的肺炎支 原體融合蛋白基因片段，電泳回收后，溶于去離子水內；取等摩爾濃度的上述三種酶切后 DNA片段，在同一離心管內用T4 DNA連接酶連接，插入到載體pET28a (+)內的I和 此〇R I位點之間，表達一個肺炎支原體P116蛋白片段、Pl蛋白片段和P30蛋白片段的融合 蛋白； 構建的重組質粒表達肺炎支原體P116蛋白片段、Pl蛋白片段和P30蛋白片段的融合 蛋白，在其N端為P116蛋白片段，長206個氨基酸，中間部分為Pl蛋白片段，長271個氨基 酸，C端為P30蛋白片段，長55個氨基酸，三者之間由氨酸-甘氨酸-絲氨酸三個氨基酸連 接，融合蛋白全長538aa，其氨基酸序列如下： Lys Tyr Leu Asn Thr His Val Lys Ala Glu Asp Val Lys Lys Asp Val 15 10 15 Asn Ala Asn He Lys Asn Gln Phe Asp He Ala Lys He He Ala Glu 20 25 30 Leu Met Gly Lys Ala Leu Lys Glu Phe Gly Asn Gln Gln Glu Gly Gln 35 40 45 Pro Leu Ser Phe Leu Lys Val MET Asp Lys Val Lys Glu Asp Phe Glu 50 55 60 Lys Leu Phe Asn Leu Val Arg Pro Gly Leu Gly Lys Phe Val Lys Asp 65 70 75 80 Leu He Gln Ser Ser Ser Gln Ala Glu Asn Lys lie Thr Val Tyr Lys 85 90 95 Leu He Phe Asp Asn Lys Lys Thr lie Leu Asn Leu Leu Lys Glu Leu 100 105 HO Ser He Pro Glu Leu Asn Ser Ser Leu Gly Leu Val Asp Val Leu Phe 115 120 125 Asp Gly He Thr Asp Ser Asp Gly Leu Tyr Glu Arg Leu Gln Ser Phe 130 135 140 Lys Asp Leu He Val Pro Ala Val Lys Thr Asn Glu Lys Thr Ala Ala 145 150 155 160 Leu Ser Pro Leu He Glu Glu Leu Leu Thr Gln Lys Asp Thr Tyr Val 165 170 175 Phe Asp Leu He Gln Lys His Lys Gly lie Leu Thr Asn Leu Leu Lys 180 185 190 Asn Phe Leu Ala Asp Phe Gln Lys Ser Thr Pro Phe Met Ala Gly Gly 195 200 205 Ser Thr Asp Phe Val Lys Pro Arg Ala Gly Tyr Leu Gly Leu Gln Leu 210 215 220 Thr Gly Leu Asp Ala Ser Asp Ala Thr Gln Arg Ala Leu lie Trp Ala 225 230 235 240 Pro Arg Pro Trp Ala Ala Phe Arg Gly Ser Trp Val Asn Arg Leu Gly 245 250 255 Arg Val Glu Ser Val Trp Asp Leu Lys Gly Val Trp Ala Asp Gln Ala 260 265 270 Gln Ser Asp Ser Gln Gly Ser Thr Thr Thr Ala Thr Arg Asn Ala Leu 275 280 285 Pro Glu His Pro Asn Ala Leu Ala Phe Gln Val Ser Val Val Glu Ala 290 295 300 Ser Ala Tyr Lys Pro Asn Thr Ser Ser Gly Gln Thr Gln Ser Thr Asn 305 310 315 320 Ser Ser Pro Tyr Leu His Leu Val Lys Pro Lys Lys Val Thr Gln Ser 325 330 335 Asp Lys Leu Asp Asp Asp Leu Lys Asn Leu Leu Asp Pro Asn Gln Val 340 345 350 Arg Thr Lys Leu Arg Gln Ser Phe Gly Thr Asp His Ser Thr Gln Pro 355 360 365 Gln Pro Gln Ser Leu Lys Thr Thr Thr Pro Val Phe Gly Thr Ser Ser 370 375 380 Gly Asn Leu Ser Ser Val Leu Ser Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Ser 385 390 395 400 Ser Gly Ser Gly Gln Ser Gly Val Asp Leu Ser Pro Val Glu Lys Val 405 410 415 Ser Gly Trp Leu Val Gly Gln Leu Pro Ser Thr Ser Asp Gly Asn Thr 420 425 430 Ser Ser Thr Asn Asn Leu Ala Pro Asn Thr Asn Thr Gly Asn Asp Val 435 440 445 Val Gly Val Gly Arg Leu Ser Glu Ser Asn Ala Ala Lys Met Asn Asp 450 455 460 Asp Val Asp Gly He Val Arg Thr Pro Leu Ala Glu Leu Leu Asp Gly 465 470 475 480 Gly Gly Ser Leu Leu Glu Glu Lys Glu Arg Gln Glu Gln Leu Ala Glu 485 490 495 Gln Leu Gln Arg lie Ser Ala Gln Gln Glu Glu Gln Gln Ala Leu Glu 500 505 510 Gln Gln Ala Ala Ala Glu Ala His Ala Glu Ala Glu Val Glu Pro Ala 515 520 525 Pro Gln Pro Val Pro Val Pro Pro Gln Pro 530 535 重組質粒的篩選與鑒定： 將重組質粒轉化大腸桿菌BL21 (DE3)，涂布含卡那霉素（60 μ g / ml) LB平板，置37°C 過夜； 次日隨機挑取轉化菌落和對照菌（質粒pET28a轉化菌），分別提取質粒，將含有串聯 基因的質粒進行DNA序列分析，序列分析證實重組質粒含有連接在一起的肺炎支原體Pl 16 蛋白基因片段、Pl蛋白基因片段與P30蛋白基因片段，序列完全正確； 表達融合蛋白工程菌的篩選鑒定： 將含有重組質粒的陽性轉化子，接種至含3ml LB培養基（含卡那毒素60 yg / ml)的 試管內，37°C振蕩培養3h，加 IPTG至終濃度0. 5mmol/L，繼續振蕩培養誘導6h，離心收集菌 體進行SDS-PAGE檢測，轉化子表達相對分子量約為60 kD的肺炎支原體Pl 16蛋白片段、 Pl蛋白片段和P30蛋白片段的融合蛋白，而對照菌BL21(DE3)無此蛋白帶； 表達肺炎支原體P116蛋白片段、Pl蛋白片段和P30蛋白片段的融合蛋白的純化： 表達肺炎支原體P116蛋白片段、Pl蛋白片段和P30蛋白片段的融合蛋白工程菌的超 聲裂解，將誘導表達融合蛋白的工程菌離心（8000 rpm、10 min、4°C)收菌，菌體重懸于原培 養液 1 / 10 體積的細菌裂解液（20 mmol/L PB pH7.4、10 mmol/L EDTA、1 mmol/L DTT、5% 甘油）內，冰浴超聲破菌，離心收集上清； 表達肺炎支原體P116蛋白片段、Pl蛋白片段和P30蛋白片段的融合蛋白的鎳離子親 和層析柱純化； 用平衡液（20 mmol/L PB pH7. 4)沖洗平衡鎳離子親和層析柱，然后將上步超聲破碎離 心好的上清直接上柱，上樣結束后用平衡液液充分洗柱，再依次用含梯度濃度咪唑的平衡 液洗脫蛋白，收集各洗脫峰蛋白，用SDS - PAGE電泳檢測各峰蛋白，確定哪個洗脫峰含表 達的肺炎支原體Pl 16蛋白片段、Pl蛋白片段和P30蛋白片段的融合蛋白，200 mmol/L咪 唑洗脫蛋白峰即為肺炎支原體P116蛋白片段、Pl蛋白片段和P30蛋白片段的融合蛋白； 純化的肺炎支原體P116蛋白片段、Pl蛋白片段和P30蛋白片段的融合蛋白用作抗原 檢測肺炎支原體抗體： 將復性的肺炎支原體P116蛋白片段、Pl蛋白片段和P30蛋白片段的融合蛋白用50 mmol/L的碳酸鹽（pH9. 6)倍比稀釋后包被酶聯板，間接酶聯免疫法檢測制備的抗肺炎支原 體、兔陽性血清及空白對照血清，肺炎支原體P116蛋白片段、Pl蛋白片段和P30蛋白片段 的融合蛋白能與抗肺炎支原體陽性血清反應，不與空白對照血清反應，說明表達的肺炎支 原體P116蛋白片段、Pl蛋白片段和P30蛋白片段的融合蛋白有較好抗原性和特異性。3. 權利要求1所述的肺炎支原體P116蛋白片段、Pl蛋白片段和P30蛋白片段的融合 蛋白，通過基因重組技術，利用細菌、酵母細胞、昆蟲細胞、哺乳動物細胞及轉基因動植物進 行重組表達、制備。4. 權利要求1所述的肺炎支原體P116蛋白片段、Pl蛋白片段和P30蛋白片段的融合 蛋白，融合蛋白中肺炎支原體P116蛋白片段、Pl蛋白片段和P30蛋白片段的任意組合連接， 以融合蛋白的形式進行表達、制備。5. 權利要求1所述的肺炎支原體P116蛋白片段、Pl蛋白片段和P30蛋白片段的融合 蛋白用于疫苗、抗體或抗原檢測試劑的研制，及用于肺炎支原體單抗和多抗制備。
【文檔編號】C12N15/70GK105884902SQ201510757773
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2015年11月9日
【發明人】李越希, 陳晨, 李佳萌, 齊勇, 李素梅, 王新國, 李素芹, 潘英
【申請人】李越希