一種高活性cik細胞的制備方法
【專利摘要】本發明公開了一種高活性CIK細胞的制備方法，該方法采用多級、分步培養的方式，對外周血單個核細胞進行培養制備高活性的CIK細胞。使用本發明的CIK細胞制備方法制得的CIK細胞具有較強的增殖能力，較高的細胞毒活性，具有更佳的腫瘤殺傷效率。本發明還公開了使用該方法制備的CIK細胞在制備藥物中的應用，該藥物可以用于治療腫瘤或免疫相關疾病。
【專利說明】
一種高活性ClK細胞的制備方法
技術領域
[0001] 本發明涉及生物醫藥領域，尤其涉及一種高活性CIK細胞的制備方法及通過該方 法制備的CIK細胞。
【背景技術】
[0002] 過繼性細胞免疫治療（Adoptive Cellular Immunotherapy，ACI 或 ΑΙΤ)是指向 腫瘤患者轉輸具有抗腫瘤活性的免疫細胞，直接殺傷腫瘤或激活機體的免疫應答殺腫瘤細 胞。該療法可以提高腫瘤的治療效果和改善患者的生存質量，在臨床中可以作為手術、放 療、化療的有效補充。
[0003] 國內外在臨床應用的自體免疫細胞治療腫瘤，主要是細胞因子誘導的殺傷細胞 (Cytokine-Induced Killer Cell, CIK)、樹突狀細胞（Dendritic Cell, DC)、自然殺傷細 胞（Natural Killer Cell, NK)等。CIK細胞最初是指在正常人體外周血中只占1-5%的 ⑶3+⑶56+T淋巴細胞。臨床應用的CIK細胞是將人體外周血單個核細胞（Peripheral Blood Mononuclear Cell，PBMC)在體外用多種細胞因子共同培養而獲得的一群以⑶3+⑶56+、 CD3+CD8+、CD4+為主的異質性細胞，是一種高效的具有廣譜殺瘤活力的免疫效應細胞，也是 目前國際上公認的最有效的腫瘤生物治療細胞之一。
[0004] CIK細胞具有增殖速度快、殺瘤活性高、殺瘤譜廣、非主要組織相容性復合體 (Major Histocompatibility Complex，MHC)限制性、對正常骨髓造血影響輕微等優點。特 別是對于術后清除微小轉移灶、防止癌的擴散和復發、提高患者自身抗腫瘤免疫能力有重 要作用。對于無法手術或對化療耐受的中晚期腫瘤患者也可起到改善生活質量、延長生命 的積極作用。CD3 +CD56+雙陽性細胞在正常人體外周血組分中含量極少，體外在含多種細胞 因子的培養基中擴增，可使CD3 +CD56+雙陽性細胞數量擴增1000倍以上。目前CIK細胞的 傳統制備方法是將分離得到的外周血單個核細胞用干擾素-Y刺激24小時后，再用CD3單 抗、IL-1 a、IL-2等因子進行刺激但是由于CIK細胞中⑶3+、⑶4+、⑶8+的T細胞含量低、細 胞活力和腫瘤殺傷能力低，對腫瘤的治療效果十分有限。因此本領域技術人員仍致力于開 發一種提高CIK細胞毒活性的技術。
【發明內容】
[0005] 本發明目的之一是提供一種高活性CIK細胞的制備方法。
[0006] 本發明的另一目的是提供一種通過上述方法制備的高活性CIK細胞在腫瘤治療 中應用。
[0007] 本發明的第一方面，提供了一種高活性CIK細胞的制備方法，其中，采用多級、分 步培養的方式，對外周血單個核細胞進行培養制備高活性的CIK細胞。
[0008] 優選地，所述的高活性CIK細胞的制備方法包括以下步驟：
[0009] (1)制備CIK前期細胞
[0010] 分選去除外周血單個核細胞中的⑶4+⑶25+Treg細胞，得到CIK前期細胞；
[0011] (2)初級培養
[0012] 將CIK前期細胞置于初級細胞培養液培養18-24小時，
[0013] 其中，初級細胞培養液中加入：PHA70-150ng/ml、IL-21 10-30ng/ml、 IL-63〇-60ng/ml ；
[0014] (3)二級培養
[0015] 加入⑶3單克隆抗體l-5ug/ml、IFN- γ 700-1200U/ml，進行二級培養，培養時間為 40-60小時；
[0016] ⑷三級培養
[0017] 加入 IL-1720-30ng/ml、IL-12 20-40ng/ml，進行三級培養，培養時間為 72-96 小 時；
[0018] (5)四級培養
[0019] 補充含有吐溫-80 0· 1-lug/ml、胰島素0· 5-2ug/ml的培養液，進行四級培養，培 養時間為6-10天。
[0020] 優選地，步驟⑵中初級細胞培養液中PHA濃度為90-120ng/ml、IL-21濃度為 20-25ng/ml、IL-6濃度為40-50ng/ml ;更優選地，步驟（2)中初級細胞培養液中，PHA濃度 為 100ng/ml、IL-21 濃度為 20ng/ml、IL-6 濃度為 40ng/ml。
[0021] 優選地，步驟（3)中加入CD3單克隆抗體2ug/ml、IFN- γ 1000U/ml。
[0022] 優選地，步驟（4)中加入 IL-17 25ng/ml、IL-12 30ng/ml。
[0023] 優選地，步驟（5)中補充培養液中含有吐溫-80 0· 5ug/ml、胰島素 lug/ml。
[0024] 優選地，步驟（2)-(5)中的培養的條件均為37°C、5% C02的培養條件。
[0025] 優選地，步驟（2)中的初級細胞培養液選自：X-VIV0無血清細胞培養液或AM-V 無血清細胞培養液。在其他實施方式中，也可以使用本領域中常用的其他細胞培養液。
[0026] 上述個步驟中所涉及的濃度均為終濃度。
[0027] 在本發明的第二方面，提供了上述方法制備的CIK細胞在制備藥物中的應用，所 述藥物用于治療腫瘤或免疫相關疾病。
[0028] 優選地，所述腫瘤包括：B淋巴細胞腫瘤細胞、白血病細胞、肺癌細胞、胃癌細胞、 結直腸癌細胞、肝癌細胞、食管癌細胞、乳腺癌細胞、胰腺癌細胞、膀胱癌細胞和宮頸癌細 胞。
[0029] 技術效果
[0030] 本發明在細胞培養液加入IL-21和IL-6培養外周血單個核細胞，能夠顯著抑制外 周血單個核細胞向⑶4+⑶25+Treg細胞的分化。
[0031 ] 本發明在CIK細胞培養4天的最后階段使用含吐溫-80和胰島素的細胞培養液進 行細胞培養，能夠有效的促進CIK細胞的增殖，顯著地縮短了 CIK細胞的培養時間，并增加 了細胞毒活性。
[0032] 通過本發明的方法制備的CIK細胞具有較高的毒活性，較強的增殖能力，明顯的 縮短了 CIK細胞的制備時間。提高了臨床效率，增強了 CIK細胞治療的療效。
[0033] 以下將結合實施例對本發明作進一步說明，以充分地了解本發明的目的、特征和 效果。
【附圖說明】
[0034] 圖1顯示了本發明實施例中制備的CIK細胞的增殖倍數。
[0035] 圖2顯示了本發明實施例中CIK細胞對K562的殺傷率。
【具體實施方式】
[0036] 實驗方法
[0037] 制備外周血單個核細胞（PBMC)
[0038] 采用本領域常規的Ficoll密度梯度法制備外周血單個核細胞（PBMC)。將人抗凝 血1500rpm離心15分鐘后，吸取上層血漿，56°C滅活30分鐘，4°C靜置30分鐘后3000rpm 離心8min，去除沉淀，4°C保存待用。
[0039] 用生理鹽水稀釋血細胞沉淀，比重為1.077的人淋巴細胞分離液與稀釋血按1 : 2 的比例加入離心管中，2000rpm離心20分鐘，抽取白細胞層，用生理鹽水清洗兩次，低速離 心后得到PBMC。
[0040] 活細胞數檢測
[0041] 取培養第偶數天的（如第2、4、6、8、10、12、14、16天）的CIK細胞100ul，加入 lOOulO. 4%胎盤藍染色液，死細胞被染成藍色，活細胞不著色。計算活細胞率。
[0042] CIK細胞增殖力檢測
[0043] 取不同培養天數的100ul的細胞，分別加入檢測用鼠抗人CD3-PerCP、CD4-FITC、 ⑶8-PE、⑶56-APC抗體10ul，室溫避光孵育30分鐘，用生理鹽水洗滌兩次，流式細胞儀檢測 計算細胞擴增倍數。
[0044] 檢測CIK細胞的細胞毒活性
[0045] CIK細胞按效靶比例2.5 : 1、5 : 1、10 : 1、20 : 1、40 : 1加入K562腫瘤細胞株 (購自武漢普諾賽生命科技有限公司）細胞接種24小時的96孔板內，共同培養24小時后加 入新鮮配制的5mg/ml的ΜΤΤΙΟμ 1，共同培養4小時，離心吸棄上清液，每孔加 DMSOlOOy 1 振蕩溶解10分鐘，用酶標檢測儀在570nm處測定吸光度A值。同時設空白對照、靶細胞對 照、效應細胞對照。每孔數值減去空白對照孔，求出3個復孔的平均A值，以殺傷率計算效 應細胞的細胞毒活性，殺傷率（％) =[靶細胞對照A值-(實驗孔A值-效應細胞對照A 值）]/靶細胞對照A值X 100 %。
[0046] 實施例1制備高活性CIK細胞
[0047] (1)去除 CD4+CD25+Treg 細胞（Mini MACS 磁珠分離柱）
[0048] 取PBMC細胞懸液調整到適宜的細胞濃度，加入PE-labeled AntiHuman CD25,4°C 孵育30min后取出，PBS離心洗滌3次后，加入Anti-PE磁珠，4°C孵育30min，過MACS柱，洗 脫液為去除Treg細胞的⑶3 +、⑶4+、⑶8+的CIK前期細胞。
[0049] (2)將得到的 CIK 前期細胞，置于含有 PHA(100ng/ml)、IL-21 (20ng/ml)、 IL-6(40ng/ml)的初級細胞培養液中，37°C，5% C02的培養箱中孵育24小時。
[0050] (3)加入 CD3 單抗（2ug/ml)，IFN- γ (1000U/ml)，37°C，5% C02 的培養 48 小時。
[0051] (4)加入 IL-17 (25ng/ml)、IL-12 (30ng/ml)，37°C，5% C02 的培養 96 小時。
[0052] (5)補充含有吐溫-80終濃度0· 2ug/ml、胰島素 lug/ml的培養基繼續培養9天， 得到高細胞毒活性的CIK細胞。
[0053] 實施例2
[0054] 按照實施例1中的方法進行CIK細胞的制備，不同點在于，在步驟（2)細胞培養液 中不添加 IL-21。
[0055] 實施例3
[0056] 按照實施例1中的方法進行CIK細胞的制備，不同點在于，在步驟（4)細胞培養液 中不添加 IL-17。
[0057] 實施例4
[0058] 按照實施例1中的方法進行CIK細胞的制備，不同點在于，在步驟（5)細胞培養液 中不添加吐溫-80。
[0059] 實施例5
[0060] 按照實施例1中的方法進行CIK細胞的制備，不同點在于，在步驟（5)細胞培養液 中不添加胰島素。
[0061] 實施例6
[0062] 按照中國專利CN201110036490. 7中記載的方法進行CIK細胞的制備。
[0063] 實施例7 :CIK細胞的活性檢測
[0064] (1)活細胞數檢測
[0065] 活細胞數檢測結果如下表所示：
[0066]
[0067] 從上表中可以看出，實施例1中采用本發明的方法制備CIK細胞，活細胞率要由于 實施例2-6中的對照組。實施例4、5中的數據表明，胰島素的添加對培養后期的細胞存活 較為關鍵，在不添加胰島素僅添加吐溫-80的實施例5中，活細胞率最低；僅添加胰島素不 添加吐溫-80的實施例4中，細胞存活率也較低。而同時添加吐溫-80和胰島素的實施例 1中，細胞存活率最高，說明吐溫-80和胰島素的同時存在有助于提高培養后期的CIK細胞 的存活率。
[0068] (2) CIK細胞增殖力檢測
[0069] 取培養第16天的CIK細胞計數，實驗結果如圖1所示，實施例1中制備的細胞中 CIK細胞擴增倍數為1312倍，遠高于實施例2-5中CIK細胞的擴增倍數。
[0070] (3)細胞毒活性檢測
[0071] 實驗結果表明，本發明實施例1制備的CIK細胞效靶比為5 : 1時K562細胞的殺 傷活性達到87%，10 : 1時對K562細胞的殺傷活性達到96%。而實施例2-6中制備的CIK 細胞，效靶比為10 : 1時的殺傷率分別為83%、74%、81%、77%、86%(圖2)。
[0072] 以上結果說明，使用本發明的方法制備CIK細胞，增殖能力強、所得細胞活性高， 具有更佳的腫瘤殺傷效率。
[0073] 以上詳細描述了本發明的較佳具體實施例。應當理解，本領域的普通技術人員無 需創造性勞動就可以根據本發明的構思作出諸多修改和變化。因此，凡本技術領域中技術 人員依本發明的構思在現有技術的基礎上通過邏輯分析、推理或者有限的實驗可以得到的 技術方案，皆應在由權利要求書所確定的保護范圍內。
【主權項】
1. 一種高活性CIK細胞的制備方法，其特征在于，采用多級、分步培養的方式，對外周 血單個核細胞進行培養制備高活性的CIK細胞。2. 如權利要求1所述的方法，包括以下步驟： (1) 制備CIK前期細胞 分選去除外周血單個核細胞中的⑶4+⑶25+Treg細胞，得到CIK前期細胞； (2) 初級培養 將CIK前期細胞置于初級細胞培養液培養18-24小時， 其中，初級細胞培養液中加入：PHA 70-150ng/ml、IL-21 10-30ng/ml、IL-6 30-60ng/ ml ； (3) 二級培養 加入⑶3單克隆抗體l-5ug/ml、IFN- γ 700-1200U/ml，進行二級培養，培養時間為 40-60小時； (4) 三級培養 加入IL-17 20-30ng/ml、IL-12 20-40ng/ml，進行三級培養，培養時間為72-96小時； (5) 四級培養 補充含有吐溫-80 0. 1-lug/ml、胰島素0. 5-2ug/ml的培養液，進行四級培養，培養時 間為6-10天。3. 如權利要求1所述的方法，步驟⑵中初級細胞培養液中PHA濃度為90-120ng/ml、 IL-21濃度為20-25ng/ml、IL-6濃度為40-50ng/ml ;更優選地，步驟（2)中初級細胞培養液 中，PHA 濃度為 100ng/ml、IL-21 濃度為 20ng/ml、IL-6 濃度為 40ng/ml。4. 如權利要求1所述的方法，其中步驟（3)中加入CD3單克隆抗體2ug/ml、 IFN-γ1000U/ml〇5. 如權利要求1所述的方法，其中步驟（4)中加入IL-17 25ng/ml、IL-12 30ng/ml。6. 如權利要求1所述的方法，其中步驟（5)中補充培養液中含有吐溫-80 0.5ug/ml、 胰島素 lug/ml。7. 如權利要求1所述的方法，其中步驟（2)-(5)中的培養的條件均為37°C、5% CO2的 培養條件。8. 如權利要求1所述的方法，其中步驟（2)中的初級細胞培養液選自=X-VIVO無血清 細胞培養液或A頂-V無血清細胞培養液。9. 上述任一項權利要求所述的方法制備的CIK細胞在制備藥物中的應用，所述藥物用 于治療腫瘤或免疫相關疾病。10. 如權利要求9所述的應用，其中所述腫瘤為：B淋巴細胞腫瘤、白血病、肺癌胞、胃 癌、結直腸癌、肝癌、食管癌、乳腺癌、胰腺癌、膀胱癌或宮頸癌。
【文檔編號】A61P35/00GK105886467SQ201410442771
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2014年8月27日
【發明人】楊鐘華
【申請人】瑞安市普羅生物科技有限公司