專利名稱：一種造紙污水處理用復合菌劑的高密度培養方法
技術領域：
本發明涉及一種造紙污水處理用復合菌劑的高密度培養方法。
背景技術：
造紙污水處理一般使用物理處理法和生物處理法相結合的二級處理工藝，其中生物處理法主要是利用活性污泥來降解污水中的污染成份。在現實生產實施過程中，活性污泥法常常遇到的一些不便或缺陷，比如1.冬季低溫，毒性物質，負荷高，高鹽度，經常造成系統崩潰。2.硝化細菌難于培養，硝化系統不穩定，出水氨氮不達標。3.水中芳香族、木質素等復雜有機成分無法被高效降解。4.生化系統抗沖擊能力低，穩定性差。為了解決上述問題，生物增效技術被應用到包括造紙工業廢水的各種污水處理過程中來。生物增效技術(Bioaugmentation technique)是一種通過加入具有特定降解能力的生物菌群，增強污水處理系統自身處理效果的高科技生物技術。通過添加具有特定降解功能的菌株以強化土著細菌的功效，強化了土著微生物抗沖擊負荷及降解某些化合物的能力。生物增效技術的關鍵是篩選到對應特定污染物的相應微生物并實現工業化生產，目前菌種篩選方面的研究較多，但是一般停留在實驗室階段，實際應用到工業生產的極少。所以對特定菌劑的規模化生產研究還有待進一步加強。高密度培養技術，在工業微生物領域亦稱高密度發酵技術，是一種應用一定的培養技術和設備來提高菌體生物量和目標產物時空產率的微生物培養技術，現已成功應用于基因工程菌及其產物的生產中。實現高密度發酵的途徑主要有1.培養基組成的優化； 2.特殊營養物的添加；3.限制代謝副產物的積累；4.流加補料策略等。高密度發酵技術的發展為各種菌劑的規模化生產提供了可行的途徑，所以針對不同用途微生物的高密度發酵工藝研究將成為菌劑研發領域的一個熱點方向。目前，復合菌劑的生產方法主要是通過分別發酵各成分菌種，然后再按照一定比例混合制成菌劑。這種生產方法的優點是根據不同菌種的特點，選擇不同的培養基和發酵條件，可以達到各種菌的最優化生產，并且最終菌劑的成分比例易于控制；但是這種方法也有一定不足，如需要的設備等生產要素多、混合后的菌劑其中的各種菌活性狀態等不同， 投加后要有一段適應期或者出現由于競爭力不同而產生菌劑活菌比例出現較大變化等。
發明內容
本發明的目的在于設計一種專用于造紙污水處理的生物增效劑的高密度培養技術，包含一種適于工業化生產該增效劑的培養基及生產該增效劑的發酵控制工藝條件，從而達到節省設備等生產要素的投資及提高復合菌劑的穩定性等效果。本發明采用的技術方案是一種造紙污水處理用復合菌劑的高密度培養方法，所述方法包括在高密度發酵用基礎培養基中依次接種黃孢原毛平革菌(Wianerochaete chrysosporium)ATCC 20696、珊瑚色諾卡式菌(Nocardia coralline)ACCC40100 和銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa) CGMCC No. 1. 239進行發酵培養，控制溫度為28 32°C、ρΗ5· O 7· 5、溶解氧為1 5mg ·Ι^，發酵過程中分批流加總體積為高密度發酵用基礎培養基體積10 20%的質量濃度50 60%的葡萄糖溶液，發酵總時間為80 IOOh ；所述高密度發酵用基礎培養基組成如下葡萄糖10 15g · L—1、大豆蛋白胨10 15g · L—1、磷酸二氫鈉8 12g · L—1、 維生素B^ 5mg · L—1、生物素0. 1 0. 5mg · L—1、微量元素母液1 3mL · L—1、發酵用消泡劑(PPE高效聚醚消泡劑，浙江大學化工廠)0. ImL · L_\用磷酸調節pH至5. 5 ；所述微量元素母液組成如下C。C12 · 6H20 Img · πιΓ\ MnCl2 · 4H20 6mg · πιΓ1、CuCl2 · 2H20 0. 6mg · πιΓ1、 H3BO4 1. 2mg · πιΓ\ Na2M0O4 · 2H20 Img · mF\ Zn (CH3COO) 2 · 2H205. 2mg · πιΓ1、FeC6H5O7 · 5H20 40mg · πιΓ1.,復合菌劑含有3種微生物，均是具有能降解造紙污水中特定污染物的能力且無公害。發酵后得到的菌種成分比例(w/V)為黃孢原毛平革菌15 25%;銅綠假單胞菌 65 75%;珊瑚色諾卡式菌5 15%。上述三種菌的含量最佳優選值黃孢原毛平革菌含量20% ；銅綠假單孢菌含量70% ；珊瑚色諾卡式菌含量10%。具體的，接種黃孢原毛平革菌后培養Mh，再接種珊瑚色諾卡式菌，繼續培養24h 后再接種銅綠假單胞菌。所述葡萄糖溶液在接種銅綠假單胞菌24h后開始流加，于3 內流加完畢，流加方式可選擇指數增加的方式。優選的，在接種黃孢原毛革菌后控制pH在5. 5士0. 3，接種珊瑚色諾卡式菌后直至發酵結束控制PH在7. 0士0. 3，發酵過程中pH調節液為氨水。所述高密度發酵用基礎培養基最佳組成為葡萄糖IOg ·ΙΛ大豆蛋白胨IOg ·ΙΛ 磷酸二氫鈉IOg · L—1、維生素BJmg · L—1、生物素0. 4mg · L—1、微量元素母液2. 5mL · L-1、發酵用消泡劑(PPE高效聚醚消泡劑，浙江大學化工廠)0. ImL · L_\用磷酸調節pH至5. 5。發酵工藝過程如下(1)菌種的平板活化將保存在-80°C冰箱中的菌種取出，冰上融化，分別無菌操作接種于相應的平板培養基中，30°C恒溫培養48 72h，備用。(2)種子液制備分別挑取平板培養基上的單菌落，無菌接種于裝有相應培養基的三角瓶中，30°C、 以適當轉速在水平搖床上培養M 36h。(3)上罐發酵首先將6. 5L基礎培養基放入10L發酵罐中，121°C滅菌25min，待培養基冷卻后，通入無菌空氣并以ISOrpm的轉速攪拌5min。停止通氣，設置此時的溶解氧水平為100% (約為 7 8mg · L"1) ο將黃孢原毛平革菌種子液按照2%左右的體積比接種到發酵罐中，控制pH在 5. 5士0. 3的水平(設置發酵罐控制程序，由在線檢測系統控制的蠕動泵決定氨水的添加速度)，溫度30°C，開始發酵；24h后再按同樣的接種量接種珊瑚色諾卡式菌，接種前調節pH 到7. 0士0. 3，繼續發酵Mh ；然后接種銅綠假單孢菌，培養24h后開始補料。補料方式參考三種微生物進入對數生長期的時機，按照指數形式的速度添加，設置IL的補料量的補料時間為36h，補料結束后，繼續發酵池后結束發酵培養。整個發酵培養過程中，通過改變攪拌槳轉速及通入壓縮空氣或純氧的方式控制溶解氧水平在30% (約為ang·!/1)以上。發酵結束后，發酵液中菌體干重達到22. 46g · L—1及以上。本發明的有益效果主要體現在本發明中設計的培養基具有價格低廉(僅為LB培養基的20%左右)、滿足本復合菌劑的工業化高密度發酵要求；設計的發酵工藝控制條件達到了復合菌劑的高密度生產要求(發酵結束后，發酵液中菌體干重達到22. 46g -Γ1及以上)，實現了節省設備等生產要素的投資(如果三種成分分別進行生產，要么至少要三套發酵設備同時使用、要么同一套設備要三個生產周期才能達到相同的效果，也就是說設備等生產資料的投資可以節省60%以上)；混合菌劑發酵后各菌種比例及活性都符合要求的目的按照本技術的控制要點，發酵結束后三種成分完全可以達到要求的比例，并且三種菌已經互相適應并保持各自的活性與降解污染物的能力，為復合菌劑的規模化生產及應用奠定了基石出。
圖1為黃孢原毛平革菌在所選培養基中的生長曲線；圖2為銅綠假單胞菌在所選培養基中的生長曲線；圖3為珊瑚色諾卡式菌在所選培養基中的生長曲線；圖4為混合菌種高密度發酵過程中微生物量增長曲線。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護范圍并不僅限于此實施例1 1.菌種的活化(1)黃孢原毛平革菌ATCC 20696的活化將保存在_80°C冰箱中的菌種取出，冰上融化，無菌操作接種于平板培養基上，30°C恒溫培養48 72h，待單菌落出現且大小適合挑取接種時，用封口膜密封后，4°C冰箱保藏備用。平板培養基麥芽汁浸提物30g · L—1、瓊脂粉15g · L_\用去離子水溶解后調節pH至5. 5，121°C滅菌25min，無菌條件下倒入平皿中冷卻備用。(2)銅綠假單孢菌ACCC 40100的活化將保存在_80°C冰箱中的菌種取出，冰上融化，無菌操作接種于平板培養基上，30°C恒溫培養M 36h，待單菌落出現且大小適合挑取接種時，用封口膜密封后，4°C冰箱保藏備用。牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基牛肉膏3g · L—1、蛋白胨IOg · L—1、氯化鈉5g · L_\瓊脂粉15g · L_\用去離子水溶解后調節pH至7. 0，121°C滅菌25min，無菌條件下倒入平皿中冷卻備用。(3)珊瑚色諾卡式菌CGMCC No. 1. 239的活化將保存在_80°C冰箱中的菌種取出， 冰上融化，無菌操作接種于平板培養基上，30°C恒溫培養48 72h，待單菌落出現且大小適合挑取接種時，用封口膜密封后，4°C冰箱保藏備用。GY培養基葡萄糖IOg · L_\酵母膏 IOg · L—1、瓊脂粉15g · ΙΛ去離子水溶解后調節pH至7. 0，121°C滅菌25min，無菌條件下倒入平皿中冷卻備用。
2.種子液的制備(1)黃孢原毛平革菌種子液的制備取冰箱保藏平板培養菌種，無菌操作挑取單菌落接種于裝有200ml麥芽汁培養基的500ml三角瓶中，30°C、IOOrpm恒溫培養M 36h。 種子液培養基為上述菌種活化時使用的對應培養基不加瓊脂粉。(2)銅綠假單孢菌種子液的制備取冰箱保藏平板培養菌種，無菌操作挑取單菌落接種于裝有200ml牛肉膏蛋白胨培養基的500ml三角瓶中，30°C、180rpm恒溫培養M 36h。種子液培養基為上述菌種活化時使用的對應培養基不加瓊脂粉。(3)珊瑚色諾卡式菌種子液的制備取冰箱保藏平板培養菌種，無菌操作挑取單菌落接種于裝有200ml GY培養基的500ml三角瓶中，30°C、100rpm恒溫培養對 3611。種子液培養基為上述菌種活化時使用的對應培養基不加瓊脂粉。3.上罐發酵(1)上罐準備工作①將發酵罐通氣系統中的除菌濾器及相應軟管拆下，用紗布及牛皮紙包裹后連同裝有補料培養基的補料瓶和用作裝PH調節液的空瓶一起120°C滅菌25min后備用。補料培養基成分碳源為質量分數為60%的葡萄糖溶液。②將6. 5L溶解好的基礎培養基放入IOL發酵罐中，121°C滅菌25min。基礎培養基葡萄糖IOg · L—1、大豆蛋白胨IOg · L—1、磷酸二氫鈉IOg · L—1、維生素B1 3mg · L—1、生物素 0. 4mg · L—1、微量元素GOO X )2. 5mL · L—1、發酵用消泡劑(PPE高效聚醚消泡劑，浙江大學化工廠)0. ImL · L_\用磷酸調節pH至5. 5③待培養基冷卻后，裝上除菌濾器及相應軟管，通入無菌空氣并以ISOrpm的轉速攪拌5min。停止通氣，設置此時的溶解氧水平為100%。④無菌條件下，將氨水裝入滅菌好的空瓶中，并將其和補料瓶分別經軟管通過蠕動泵連接到發酵罐加樣孔(蠕動泵與在線檢測系統相連，并可根據檢測數據自動調節加樣速度)。(2)發酵過程在發酵過程中，溫度全程控制在30°C;溶解氧的控制目標為30%以上，當溶氧不足時，第一選擇是提高攪拌速度。當速度達到300rpm還不能滿足溶解氧需要時，開始通入無菌壓縮空氣，攪拌槳速度回落至150rpm左右；隨著菌體增加所造成的需氧升高，可以通過加大通氣量來增加溶氧，當需氧量進一步增加時，可以考慮通入無菌純氧和壓縮空氣的混合氣體來增加溶解氧水平。發酵罐的排氣管有單向截止閥，控制發酵罐頂部的空氣壓力稍高于大氣壓，并防止外面的空氣進入發酵罐。①將黃孢原毛平革菌種子液140ml無菌操作接種到發酵罐中，控制pH在5. 5士0. 3 的水平(設置發酵罐控制程序，由在線檢測系統控制的蠕動泵決定氨水的添加速度)、溫度 30°C、攪拌槳轉速為150rpm開始發酵。②發酵開始24h后，無菌操作，再按同樣的接種量接種珊瑚色諾卡式菌，接種前調節pH到7. 0 士 0. 3，繼續發酵24h。③最后無菌操作接種銅綠假單孢菌種子液140ml，繼續培養24h后開始補料。補料方式參考三種微生物進入對數生長期的時機，按照指數形式的速度添加，設置IL的補料量的補料時間為36h，補料結束后，繼續發酵2h，結束發酵過程。
④關閉排氣閥，通過通氣產生的壓力，將發酵液從出料口排出。⑤取混勻的發酵液稀釋一定倍數后，鏡檢，觀察到三種菌的數量為黃孢原毛平革菌43個，銅綠假單孢菌139個，珊瑚色諾卡式菌23個，確認各菌種比例在控制范圍內。⑥發酵結束后，取IOml發酵液放入稱量瓶中，100°C烘箱中干燥至恒重并稱量其質量，計算后得到發酵液中菌體干重達到22. 46g · L—1。實施例2 本實施例與實施例1的不同點是，基礎培養基配方為葡萄糖Kg·!/1、大豆蛋白胨15g · L—1、磷酸二氫鈉Sg · Γ1、維生素B1 2mg · Γ1、生物素0. Img · L—1、微量元素 GOOXUmL·!/1、發酵用消泡劑0. 11^化_1、用磷酸調節？!1至5.5。其他步驟及所選參數與實施例1相同，發酵結束經計算后得到發酵液中菌體干重達到24. 7g · Γ1。實施例3 本實施例與實施例1的不同點是，基礎培養基配方為葡萄糖IOg · L—1、大豆蛋白胨15g · L—1、磷酸二氫鈉12g · Γ1、維生素B1 5mg · L—1、生物素0. 5mg · L—1、微量元素 GOOXMmL·!/1、發酵用消泡劑0. 11^化_1、用磷酸調節？!1至5.5。其他步驟及所選參數與實施例1相同，發酵結束經計算后得到發酵液中菌體干重達到23. Ig · Γ1。實施例4 按照以上實施例1生產的復合菌劑應用與某造紙廠生化段曝氣池該污水處理工藝為日處理量15000m3/D，進水水質(月平均)化學需氧量(COD) 321 ang·!/1、生物需氧量(BOD5) UOOmg·!/1、懸浮固體含量(SS) 105mg · L—1 ；使用本復合菌劑前出水水質(月平均)化學需氧量(COD) IOOmg ·Ι^、生物需氧量(BOAHSmg·!/1、懸浮固體含量 (SS) 20mg · Γ1 ；使用復合菌劑后出水水質(月平均)化學需氧量(C0D)60mg · L—1、生物需氧量(BOD5) 20mg · L—1、懸浮固體含量(SS) 17mg · 可見按本發明方法培養獲得的復合菌劑對造紙污水處理效果的增益很明顯。
權利要求
1.一種造紙污水處理用復合菌劑的高密度培養方法，所述方法包括在高密度發酵用基礎培養基中依次接種黃孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)ATCC 20696、 珊瑚色諾卡式菌(Nocardia coralline) ACCC 40100和銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa) CGMCC No. 1. 239進行發酵培養，控制溫度為28 32°C、ρΗ5· O 7· 5、溶解氧為1 5mg ·Ι^，發酵過程中分批流加總體積為高密度發酵用基礎培養基體積10 20%的質量濃度50 60%的葡萄糖溶液，發酵總時間為80 IOOh ；所述高密度發酵用基礎培養基組成如下葡萄糖10 15g · L—1、大豆蛋白胨10 15g · L—1、磷酸二氫鈉8 12g · L—1、 維生素B1 2 5mg · L—1、生物素0. 1 0. 5mg · L—1、微量元素母液1 3mL · L—1、發酵用消泡劑0. ImL. L—1、用磷酸調節pH至5. 5 ；所述微量元素母液組成如下=C0Cl2 · 6H201mg · ml—1、 MnCl2 ·4Η20 6mg ·ι Γ\CuCl2 · 2H20 0. 6mg ·πιΓ\H3BO4L 2mg ·πιΓ\Na2M0O4 ' 2H20 Img ·πιΓ\ Zn (CH3COO) 2 · 2H20 5. 2mg · πιΓ\ FeC6H5O7 · 5H20 40mg · πιΓ1。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于接種黃孢原毛平革菌后培養Mh，再接種珊瑚色諾卡式菌，繼續培養24h后再接種銅綠假單胞菌。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述葡萄糖溶液在接種銅綠假單胞菌24h 后開始流加，于36h內流加完畢。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于在接種黃孢原毛革菌后控制pH在 5. 5 士 0. 3，接種珊瑚色諾卡式菌后直至發酵結束控制pH在7. 0 士 0. 3。
5.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述高密度發酵用基礎培養基組成如下 葡萄糖IOg · L—1、大豆蛋白胨IOg · L—1、磷酸二氫鈉IOg · L—1、維生素B1 3mg · L—1、生物素 0. 4mg · L—1、微量元素母液2. 5mL · L—1、發酵用消泡劑0. ImL · L—1、用磷酸調節pH至5. 5。
全文摘要
本發明提供了一種造紙污水處理用復合菌劑的高密度培養方法，在高密度發酵用基礎培養基中依次接種黃孢原毛平革菌ATCC20696、珊瑚色諾卡式菌ACCC 40100和銅綠假單胞菌于一定條件下進行發酵培養80～100h；本發明中設計的培養基具有價格低廉(僅為LB培養基的20％左右)、滿足本復合菌劑的工業化高密度發酵要求；設計的發酵工藝控制條件達到了復合菌劑的高密度生產要求，實現了節省設備等生產要素的投資，混合菌劑發酵后各菌種比例及活性都符合要求的目的按照本技術的控制要點，發酵結束后三種成分完全可以達到要求的比例，并且三種菌已經互相適應并保持各自的活性與降解污染物的能力，為復合菌劑的規模化生產及應用奠定了基礎。
文檔編號C02F3/34GK102250805SQ201110183629
公開日2011年11月23日 申請日期2011年7月1日 優先權日2011年7月1日
發明者王斌, 鄭展望 申請人:浙江商達環保有限公司