用于微晶晶體學的樣品支架的制作方法

專利名稱：用于微晶晶體學的樣品支架的制作方法
技術領域：
本發明總體上涉及用于安裝和操縱大分子的和病毒晶體和用于X射線晶體學的其它樣品的樣品支架，以及利用該樣品支架的方法。
背景技術：
安裝用于X射線數據收集和結構測量的晶體的最普通方法之一是將它們插入薄壁(通常10微米)玻璃或石英毛細管。這些薄毛細管是X射線可透過的，并產生較少的本底散射。它們可以在兩端被密封、并提供用于晶體的穩定環境。對于含有大于溶劑(主要是水)和必須保持在恒定的濕度環境下以保持它的結構和序列的蛋白質和其它生物大分子的晶體，這是特別重要的。能夠改變毛細管內部的晶體環境。例如，通過將少量的飽和鹽溶液射入毛細管內可以使晶體受控地脫水。還可以將結晶浸泡在毛細管內部的含有藥分子、小分子配合基、以及重原子化合物的溶液中。可以使用安裝晶體的毛細管從晶體溶劑的融化至遠在室溫之下的溫度收集數據。對于不引入過多的晶體紊亂進行數據收集不能被閃凍的晶體它們是特別重要的。
在用于毛細管內安裝蛋白質和其它生物分子晶體的一已知技術中，首先選擇其直徑與晶體直徑相差不大的毛細管，以便最后安裝的晶體位于毛細管的中央，用于簡化在X射線束中的對齊。其次，將毛細管的密封端劃痕和折斷，以及用于產生附連于某些結構的另一、較大直徑端的吸口。將毛細管的敞開端插入晶體位于其中的液滴中，并將少量該液體吸入毛細管內。從該液體取出毛細管，并將少量空氣引入，用于從端部除去該液體。其次，將毛細管插回入液滴內，并仔細地使用毛細管吸入。利用紙芯去除晶體周圍的多余液體，并用蠟、油脂等密封毛細管的敞開端。從大直徑端拆去吸入裝置，將毛細管劃痕和折斷到所需長度，密封端部，然后通常使用模型粘土將毛細管安裝在一針桿或測角器上，用于X射線測量。
其中采用晶體安裝和操作的另一領域是在于X射線低溫晶體學，X射線低溫晶體學廣泛地用于蛋白質晶體、蛋白質核酸合成物和病毒以及易于被X射線輻射損壞的其它晶體。低溫晶體學技術的發展和應用對于能夠溶解生物大分子和大分子化合物的結構的速度有很大影響。在輻射損壞變得顯著之前能夠吸收很大的X射線劑量，以致通常使用單個晶體能夠收集許多完整的數據組。
已采用許多不同方法操縱安裝晶體，用于閃冷和低溫晶體學數據收集。較早的試驗將晶體連接于玻璃纖維的端部或者將它們放置在小型玻璃刮刀的頂部上。使用用于圈的低X射線吸收材料的圈安裝方法現在是用于操縱和安裝晶體的最廣泛的使用方法。圈低溫架包括小(10～20微米)直徑尼龍(或金屬)絲，該絲被加捻形成圈，然后對它螺旋狀加工成為小的空心金屬桿。然后將該桿插入金屬或塑料測角器相容的基底。從母液取回晶體，在母液中通過將它們保持在該圈內使它們生長，然后使用在一個或多個溶液之間的圈轉移它們，這些溶液包括穩定溶液、重原子化合物溶液、包含小分子、藥物或配合基的溶液、或低溫防護劑溶液。比該圈較大的晶體能夠位于它的表面之上，同時較小晶體能夠被保持在跨越該圈或者還粘附于該圈的側邊的液體薄膜內。通過浸入液體氮或丙烷內或者通過插入在冷氣流內，對圈安裝的晶體閃冷。
諸圈提供了方便的晶體操縱。通過將晶體保持在圈的液薄膜中，與硬表面(例如那些可替換選用的安裝工具)的可能的損壞性被減少到最少。該圈自身是柔性的，足以由于不大嚴重的偶然接觸造成損壞。諸圈有助于使熱物質減至最小，使用于熱傳遞的表面最大，增加了冷卻表面，從而減少了防止在晶體內的晶體周圍的六角冰生形所需的低溫防護劑濃度。由于這些原因，在全世界選擇圈基架作為同步加速器X射線束線處關于高生產率的自動低溫晶體學的標準。
關于在晶體學應用中安裝試樣的上述已知技術具有許多缺點。尤其，毛細管安裝技術要求毛細管被密封的和大直徑的敞開端必須被切割，然后被密封。這些操作增加了毛細管會斷裂和內部晶體損壞的可能性。此外，能夠使用的和仍舊提供用于切割的適當堅牢度的最小的毛細管壁厚被限制到約10微米。這又使毛細管有助于本底X射線散射，這在測量很小晶體時能顯著地惡化整個信號對干擾的比值。
對于很小晶體(＜50微米)，通過毛細作用吸去多余的液體又不干擾晶體是很困難的。在晶體和毛細管之間的剩余液體可能具有與晶體容積相差不大的容積(因為小晶體的較大的表面對容積的比值)，這將增加X射線的本底散射。在晶體和毛細管之間的任何剩余液體還與作為畸變透鏡的彎曲的毛細管壁一起作用，這使X射線束中的準確的晶體對齊較困難。雖然要求某些液體以依靠著毛細管壁將晶體操作在適當位置中，如果有過多的液體，那么在繞射測量期間晶體可能相對于壁滑動，這可能增加在數據分析中的誤差。
為了保證晶體終止在毛細管的徑向中心附近，毛細管直徑必須與晶體尺寸匹配。因此，必須儲存許多直徑的毛細管。甚至對于一有正確尺寸的毛細管，晶體相對于X射線系統的軸線的垂直和水平位置也是被控制得較差，并對于各晶體都要求耗費時間的對齊。例如離開測角器頭部中安裝的基部一特定距離處定位晶體要求仔細地操作晶體和仔細地切割毛細管，這些都可能很耗費時間。在晶體取回期間吸取裝置中調節壓力也要求相當的技能。因為它們的較大尺寸，毛細管能夠妨礙觀察被安裝的晶體，并使小滴中的操作困難。在取出期間與毛細管端部和壁的接觸經常損壞晶體(尤其是帶有板類幾何形狀的那些晶體)，增加了它們的嵌鑲性和惡化了它們的X射線繞射性能。雖然為了進一步處理或測量可以從毛細管取出晶體，但這種取出晶體是極其困難的。在原來結構的數據收集之后在毛細管中可以進行將晶體浸泡在配合基、藥物或重原子化合物中。但是這操作不方便和經常移動晶體。
在低溫晶體學中，使用圈架也是有問題的。尤其，圈是很柔性的，尤其是用10微米直線尼龍絲制成的那些圈。因此，在從溶液取出晶體期間，在液體和表面張力作用下圈可能彎曲，一旦安裝了晶體在晶體和周圍液體的重量作用下它們也可能彎曲。因為它們不規則的空氣動力學外形，所以在低溫流的拖拉力作用下它們能夠彎曲和顫振，稍許加寬了對于最低的嵌鑲性和入射來擴散匹配時所實現的最大的繞射信號對干擾比值。
此外，圈提供了較差的晶體定位精度和相對于X射線主軸線的可再現性。對于某一標定的圈直徑的圈形狀是不規則的和不可再現的。相對于金屬柱的圈取向是不規則的通過該金屬柱它們被螺旋狀加工，部分是由于在它們基部為改進剛度所需的對尼龍的加捻所產生。晶體在圈內的定位是不可再現的，尤其是對于很小的晶體。晶體和圈自射(從冷凍液體獲得剛度)在現場晶體“退火”或“回火”原始記錄期間可能移動，這將樣品溫度上升到周圍溶劑的融化點/玻璃化轉換點附近或之上，需要在X射線束中再對齊晶體。
圈還能在晶體周圍保持較多液體。這液體可能難以吸去，尤其是如果晶體比圈的內部區域較小時。保留的液體增加了本底散射、減小了繞射信號對干擾的比值、增加熱質量、從而減少了冷卻速度。并且，周圍液體比晶體具有不同的冷凍性能和熱擴散性能，又在冷卻期間施加破壞力。冷凍的周圍液體還能使小(小于50微米)晶體難以成像和接合。
隨著通過在X射線源、鏡片、檢測器方面的不斷改進可以用越來越小的晶體進行晶體學試驗結構研究，圈的限制性變得越來越顯著。最初的結晶試驗-尤其是基于高生產率的自動操縱篩的那些試驗-通常產生很小晶體。從這些晶體收集X射線數據能夠提供在生長優化過程中早期的有價值的反饋，并有時立即產生有用的結構信息。甚至在晶體質量基本優化之后晶體尺寸可以保持較小，尤其是在大分子化合物和膜蛋白質的情況下。盡管減小了信號對干擾的比值和增加了輻射損壞，因為它們閃冷更迅速，從而更早地低溫保護，所以較小的晶體可以甚至是更希望得到的；比較大的晶體它們能夠產生較好的繞射數據組，除非仔細地優化對于較大晶體的低溫保護狀態。
對于尺寸在50微米之下的晶體，圈變得極其難以使用。柔性制約限制了最小的尼龍直徑，這又限制了最小的內圈直徑。較小的晶體通常必須保持在較大容積的液體彎液面內，減少了繞射信號對干擾的比值和使接合更困難。較大的液體對晶體容量比還限制在熱物質和冷卻時間方面的減小。
按照以上觀點，仍然需要關于用在X射線晶體學和低溫晶體學應用中的安裝微晶體的改進技術。

發明內容
本發明旨在通過提供微晶體試樣支架滿足上述需要，在該支架中使用塑料薄膜，以支持將分析的晶體。該薄膜具有50微米或以下的厚度，并較佳地由聚酰亞胺制造。本發明的關鍵特征是對薄膜施加曲率，以顯著地增加它的結構剛性。剛性的增加就能夠使用約3～15微米(或甚至更薄，只要相應地減小其它支架尺寸)厚度的較薄的薄膜，這較薄厚度減少了X射線的本底散射。
為了提供必需的曲率，可以采用許多技術，這取決于晶體學應用類型。在諸低溫晶體學應用場合，其中不采用毛細管，較佳地將聚酰亞受薄膜安裝于桿或針的外彎曲表面、中空桿或套筒的內彎曲表面、或者在套筒和桿之間。在這些實施例中，桿和/或中空套筒較佳地具有傾斜頂端，以使試樣位置的觀察角最大，以致當桿、套筒和支架相對于水平面傾斜時，能夠看到晶體和任何晶體孔。或者，可以將薄膜附連于具有錐形端的桿，以致塑料支架相對于該桿傾斜，從而較容易地刮取一晶體、脫離平表面，并使該晶體位于軸線上，這樣使接合更加容易。
在使用毛細管的晶體學應用中，通過使薄膜足夠大以致在將薄膜插入毛細管中時毛細管自身將施加必要的細率，也能夠施加曲率。在這變化型式中，可以使用例如一對鑷子的適當工具首先對薄膜施加曲率，以致能夠將它插入毛細管或管子內。
聚酰亞胺是用于薄膜材料的良好選擇，這是因為它的極好機械性能；因為它具有較低的密度和由低原子數成分組成，以致它很微弱地散射X射線；以及因為它的金黃色提供了與大分子晶體的良好光學對比度、微加工聚酰亞胺薄膜，使它具有用于保持被檢測的晶體的錐形末端。這錐形使在薄膜平面的方位平行于光束(它的尺寸通常與晶體尺寸一致或較小)時于X射線束中的薄膜容積最小。較佳地，在末端設置用于接納晶體的一第一試樣孔，不過該孔不是必不可少的。這孔允許晶體精確的被定位，進一步使X射線束中的薄膜容積最小，從而使從薄膜的本底散射最小。對于用于大分子的低溫晶體學的或在溶液中生長的病毒晶體的支架，較佳地在薄膜中設置將試樣孔連接于較大孔的小通道，便于從試樣孔通過毛細作用吸去任何多余液體，同時幾乎沒有接觸晶體的風險。該較大孔還減小了聚酰亞胺的總面積，從而減小了該支架移動通過含晶體的液滴時的液體阻力和流動擾動。通道和較大孔對于無機的或小分子有機材料的、其中過多液體不是一問題的“干”晶體不是必不可少的。
薄膜較佳地具有圍繞試樣孔的較小的固定不變的寬度(5～100微米，這取決于被檢查的晶體的尺寸)，這減少了當薄膜平面的方位平行于X射線束時從聚酰亞胺薄膜(和任何吸附的液體)的散射。用于延伸超過它所附連的桿或套筒的薄膜頂部的整個三角形提供了良好的空氣動力學外形，這外形使試樣在氣體冷卻流中的試樣“顫振”最小(與最低的嵌鑲性晶體有關)。
這樣本發明提供了對于傳統的圈的可替換選用方案，該方案保持了它們的全部優點(包括與用于高生產率晶體學的現有的和研制的技術的完全相容性)，但是解決了在安裝較小晶體方面的如果不是全部問題也是大部分問題。它們潛在的優點包括如果使用帶有較大曲率的較薄、較短薄膜完全可再現小到3微米或甚至更小的試樣“圈”尺寸、準確的和可再現的試樣定位、良好的試樣-支架對比度、較容易地去除多余液體、使熱物質最小和更迅速閃冷、減少本底散射、以及較容易設計定制和大量生產。此外，支架的顏色、剛度和再現能力應該能使用自動裝置提取晶體、顯著地節省勞動力，相反，使用圈型支架要求通過手從結晶液滴取出全部晶體，這是因為圈是松軟的和具有與液滴溶液的很小對比度。
附圖簡述從以下結合附圖對本發明的多個實施例進行的敘述，本發明的特征和優點將變得更明顯，在附圖中

圖1A-1D是按照本發明的諸較佳實施例構造的四個微晶試樣支架的視圖；圖2A和2B是尤其使用一個較佳試樣支架將一微晶定位在受控環境的毛細管或使用與標準X射線設備差不多的基底的管子內的一組件的分解立體圖和組裝立體圖；以及圖3是在本發明的諸較佳實施例中形成有效的晶體支架的有圖形的聚酰亞受薄膜的視圖。
具體實施例方式
參閱圖1A-1D，示出了微晶支架10的若干變化形式，它們按照本發明的四個較佳實施例構造，各個微晶支架尤其被設計成與在X射線晶體學中使用的測角器或其它標準的試樣保持件/定位件一起使用。在各實施例中，支架10包括微加工的塑料薄膜12，將該薄膜附連于具有曲面的一結構，以致將曲率施加于薄膜12。在圖1A的實施例中，用任何合適的措施、例如粘接劑、膠帶、熱粘合等將薄膜12附連于小直徑圓筒形塑料或金屬柱16。如圖2A所示，柱16的尺寸被確定為可插入標準的塑料或金屬磁測角器頭架18，例如由HamptonResearch銷售的或大分了晶體學團體為高生產率自動晶體學所研制的頭架，或者插入允許薄膜12和柱16相對于測角器頭部(未示出)高精度接合的那樣關鍵的變化型式內。薄膜12具有呈錐形至末端24的和當連接于桿16時形成勺形的錐形端。
在圖1B所示的實施例中，還使用中空的金屬或塑料套筒或桿14與桿16相結合，以致薄膜12被保持在這兩件之間。套筒14牢固地將薄膜12連接于桿16的外側彎曲表面26，并迫使薄膜12與該桿的曲率相一致，同時允許易于裝配。較佳地，使用少量的膠水密封在套筒14和桿16之間的區域，相對于桿16固定套筒14。或者，可以使用可熱皺縮的管子制成套筒14，將薄膜12夾持在套筒14與桿16之間。或者，如圖1C所示，可以使用中空套筒14自身，以致例如通過粘接劑、膠帶、熱粘合等將薄膜12連接于中空套筒14的內側彎曲表面28。也可以通過坍塌套筒的一側使薄膜12被壓接于套筒14的內側彎曲表面，以致它依靠于另一彎曲側擠壓薄膜。
在圖1A和1B所示的兩實施例中，套筒14和桿16較佳地分別具有傾斜的頂端20和22，使位于聚酰亞胺薄膜12的末端24處的試樣位置的觀察角最大，如后面結合圖3更詳細討論的那樣。在圖1D中示出了實現相同目標的另一實施例，其中桿16具有薄膜12連附于其的錐形頂端29。如圖所示，薄膜12相對于桿16的垂直縱向軸線以一角度安裝，以致薄膜的末端24直接位于該軸線之上。因此，使薄膜12的接合更加容易。更重要地，薄膜12的傾斜以使晶體刮離平表面更加容易的方式定位它的勺形末端。
由任何較佳實施例施加的聚酰亞胺薄膜12的曲率顯著地增加了它的彎曲剛度；紙的圓筒狀彎曲件比平的紙件較難于彎曲。在允許薄膜12制得很薄、約3～15微米方面這附加的剛度是很關鍵的，因此使從聚酰亞胺薄膜12的本底散射最小，并允許膜薄圖形達到安裝最小的晶體所要求的小側向尺寸。如剛剛所述的，這曲率還產生在取出晶體時和用于在溶液之間傳送晶體的方便的適度的勺狀作用，這使晶體損壞的機率最小。
對于其中試樣晶體將被保持在受控環境的室溫晶體學應用場合，塑料管或玻璃X射線毛細管30在支架10上滑動，然后將管30的末端32密封，如圖2B所示。在這實施例中，如果希望，可以不需要使用中空套筒14和桿16。代之以，由在薄膜12上施加所需曲率的一對鑷子可以保持聚酰亞胺薄膜12。然后利用鑷子將薄膜12插入X射線毛細管30。當釋放鑷子時，薄膜12的曲率松弛。選擇薄膜寬度比毛細管內徑稍大，以便通過它的彈簧狀作用將薄膜12保持在毛細管中尖附近的適當位置中。然后使用油脂或蠟可以密封毛細管30的端部32。如果希望，在密封之前可以將附加液體引入毛細管內。
在使用套筒14和/或桿16支持薄膜12的情況中，帶有切斷的窄端的X射線毛細管30仔細地在晶體上被拉動和下降到基底18上。可以用油或油脂潤滑基底18和在毛細管的端部上拉動的橡膠或硅酮墊圈/O形環提供與毛細管的氣密的密封。毛細管在其上被拉動的圓筒形部分可以是連接于X射線設備的基底的一整體部分，或者可以是帶有通過其將該桿插入基底的一通孔的單獨的圓筒形件，并在桿和用油脂密封的孔的內徑之間有任何間隙。然后利用油脂、蠟、膠水等密封該窄端。或者，可以用薄膜塑料管代替玻璃毛細管30。例如，新罕布什爾州、Salem現代聚合物公司制造了帶有0.0002英寸或5微米壁厚的有規律的和低溫熱皺縮半剛性透明管。在這情況下，在晶體上拉動該管和到達基底上。用油脂或油可以進行兩端密封，和/或在低溫熱皺縮管的情況下使用帶有定制的彎曲末端的可變溫度焊接的鐵可以進行兩端密封。在密封之前可以將任何材料的小塞子插入敞開端，以改進該密封。在該兩種情況下，在密封之前可以將附加的液體引入毛細管/塑料管。并且在這兩種情況下，毛細管或塑料管的直徑可以比試樣支架的寬度大得多，使在試樣上滑動毛細管或塑料管較容易，而不會干擾試樣。
在所有以上三種情況下，在X射線數據收集或受到其它操作、例如浸泡在配合基、藥物或重原子溶液之后可以從毛細管/管子取出晶體，尤其在較佳的第二和第三方法中較容易取出，然后較容易地再插入，用于另外的數據收集。
圖3示出了聚酰亞胺薄膜12的典型的圖形。應該注意還可以由聚酰亞胺之外的、在X射線束上臨時窗口廣泛使用的(KAPTON帶形式的)、具有它的組成成分的低密度、低原子數、以及因此低X射線吸收和散射的任何其它合適的塑料或其它材料制造薄膜12，使用微電子工業的微石版印刷技術它易于被形成圖形，是較佳的選擇。在金黃的聚酰亞胺薄膜和晶體之間的良好對比度使放置和接合晶體較容易。薄膜12較佳地包括在窄末端24處的一小試樣孔50，用于保持將被分析或檢測的試樣晶體。較佳地通過通道52將試樣孔50連接至大得多的孔54。這結構允許一紙芯插入較大孔54，用于通過通道52從晶體周圍去除多余的液體，而幾乎沒有接觸晶體的風險。較大的孔54還減小了聚酰亞胺的總面積，從而減小隨著通過含晶體的液滴移動該支架所引起的液體阻力和流動擾動。或者，因為要被檢測的晶體還可以例如通過一小液滴或一聚合物直接連接于薄膜12的末端24，可以不使用孔50和54，不需要通道52。
薄膜12具有圍繞試樣孔50的較小寬度的邊緣56，它在薄膜12的平面被定向成平行于X射線束時減少了離開聚酰亞胺薄膜12(和任何被吸收的液體)的散射。較佳地，邊緣56具有取決于被檢測的晶體的尺寸的在5和100微米之間的一固定寬度。小十字形孔58位于試樣孔52和大孔54之下的薄膜內的中央處，它可以用于幫助自動接合。可以使用其它的諸接合孔，以適合于將使用的接合規則系統。延伸越過柱16的薄膜的頂部60的整個三角形與柱的錐形一起提供了良好的空氣動力外形，使在氣體冷卻流中的試樣“顫振”(與最低的嵌鑲性晶體有關)最小。可以將試樣孔52定制成任何形狀，以便簡化例如桿形晶體的安裝。薄膜的厚度也可以改變，例如用于圍繞試樣孔52產生隆起部分，用于提供較剛性的基部，或者用于改進空氣動力學，但是均勻的厚度提供了更加適合的性能。
為了組裝方便，尤其是附連至中空套筒14的內側，薄膜12包括帶有錐形端64的延伸尾部62，該錐形端允許將薄膜12易于插入套筒14，或者在應用毛細管的情況下易于插入塑料管或毛細管。當薄膜12插入套筒14時一對小翼部66伸出和限制薄膜進入套筒14的運動距離，提供了可再現的定位。對于附連于桿16的外側的薄膜，可以使用帶有方形端的較短、較寬的尾部。在這兩種情況下，尾部可以穿有諸小孔68，以改進膠合強度。此外，在受控的大氣毛細管實施例中，當將薄膜12放在含晶體的一液滴中時諸小孔68保持諸小液滴，后來這些小液滴用于保持毛細管30內的濕氣環境。對于最薄的聚酰亞胺，在設計中的全部直角切割-是應力集中的諸位置-可以由有限半徑的曲線代替，以改進防止撕裂的薄膜堅牢度。
為了制造有圖形的聚酰亞胺薄膜，可以采用許多不同的加工過程，這取決于所需的晶體孔尺寸和薄膜厚度。一第一、較佳的薄膜制造加工是基于光可定界的聚酰亞胺，并可產生很小的孔尺寸。首先，將用作為在薄膜拉起期間的防蝕層的1/2微米二氧化硅層設置在清潔的硅晶片的表面上。用正色調光可暴露的PWDC 1000聚酰亞胺旋轉涂復晶片。例如帶有粘接促進劑的預涂復或在蒸汽帶水爐內預焙烘的標準加工保證在晶片和聚酰亞胺之間的良好粘接。在簡要焙烘之后，聚酰亞胺是通過含有支架的圖形的鉻-玻璃面罩露出的軟接觸面，然后浸在顯像劑中去除被暴露的聚酰亞胺。然后在氮氣氛爐中固化留下的有圖形的聚酰亞胺。最后，將晶片浸在稀釋的HF中，以去除防蝕的二氧化硅層，允許有圖案的聚酰亞胺薄膜浮起，脫離晶片。這加工過程適合于制造帶有3-15微米厚度的聚酰亞胺薄膜，然后該薄膜可以形成圖案、達到5微米的孔尺寸，該尺寸適合于安裝最小的大分子晶體，從該晶體通常能夠獲得繞射。能夠得到較薄的薄膜和較小的尺寸，同時通過減小薄膜的橫向尺寸和增加它的曲率保持適當的薄膜剛度。在使用3英寸硅晶片和有圖形的聚酰亞胺薄膜的一試驗裝置中，一次能夠生產130個試樣支架。對于8英寸晶片，這個數目能夠增加到1000個之上，使各個支架的生產很便宜。也能夠使用例如接觸打印和噴射(“噴墨”)印刷的其它普通微制造加工，尤其是對于帶有大孔尺寸的諸支架。
對于比50微米較大的試樣孔，能夠使用用于柔性電子電路的基于銅-聚酰亞胺-銅片材上的制造加工過程。用光致抗蝕劑旋轉涂復硅晶片，并利用一塊玻璃將與晶片尺寸匹配的一件該片材加壓在頂部上，以保證一平表面。然后焙烘這組件，以固化光致抗蝕劑，并將銅-聚酰亞胺-銅牢固地連接至晶片。然后將光致抗蝕劑的一第二層第二次施加在焙烘過的銅和晶片的頂部上。將該層通過含有試樣支架圖形(為復蓋晶片面積而復制的)鉻玻璃面罩暴露于寬帶紫外線接觸校準器中，然后被顯像以去除暴露的光致抗蝕劑。利用氯化鐵將該圖形蝕刻進入頂部銅層，然后利用O2CHF3氣體等離子體蝕刻將該圖形蝕刻進入聚酰亞胺，在該蝕刻之后將有圖形的銅-聚酰亞胺-銅薄膜與晶體分離。將這有圖形的片放在Shipley 1165池中，以去除剩余的光致抗蝕劑，然后放入一第二氯化鐵池中，用于蝕刻掉在聚酰亞胺薄膜的頂部和底沖的所有剩余的銅。不垂直的蝕刻外形和商業上可得到的柔性電路材料的最小的銅厚度(9微米)和聚酰亞胺厚度(25微米)將由該主體加工過程方便地得到的最小結構特征(例如孔)尺寸限制到約50微米。
可選地，能夠修改所制造的聚酰亞胺薄膜的表面性能，以改進在許多不同溶液中的該支架的性能。聚酰亞胺是自然地親水性的。在這情況下，試樣支架趨于排斥可溶解的蛋白質的母液，以及能夠引起含蛋白質晶體的小滴的損壞。已研發了很多種技術修改聚酰亞胺的表面性能。為了使主體聚酰亞胺薄膜有親水性，較佳的加工過程是在提起和干燥之后，將它們簡短地暴露于氧氣等離子體蝕刻。這處理使液滴損壞減至最少，并允許晶體較容易地取出。但是，用實際未處理的支架也顯示出差不多一樣地進行，并減小了多余的液體，并且對于含洗滌劑的諸液滴它們的親水性能可以是很有用的。
進行了許多試驗，以比較由現行技術20微米尼龍圈支架和按照本發明的較佳實施例構造的9微米厚聚酰亞胺支架產生的擴散X射線本底與分辨率。該諸試驗確認較剛性的聚酰亞胺支架提供了較少的本底散射-尤其是在重要的2-5埃分辨率范圍。通常，勺狀作用與試樣孔尺寸、形狀和方位的可再現能力一起使主體支架比圈更加容易使用，尤其是對于小晶體。作為一個例子，已使用該支架安裝和得到了來自5-7微米大分子晶體的一完整的數據組。對于幾百微米尺寸的大晶體也能夠使用該主體支架，只要使用較厚的聚酰亞胺薄膜(10-25微米)。因為對于所有試樣和支架方位在射線束路徑中的聚酰亞胺的小容積和聚酰亞胺的低密度和原子數成分，所以甚至對于很小的晶體與來自無序的內和外溶劑的后果比較它對于本底散射的影響是較小的。通過優化在薄膜厚度(它決定了彎曲剛度)和試樣孔周圍的聚酰亞胺的寬度之間的差異，能夠減小這容積。由薄膜加工產生的相同的基本設計應該可應用于幾微米或很小的試樣孔，只要減小薄膜的厚度，以考慮蝕刻外形，并減小橫向支架尺寸，以防止彎曲。對于極小的晶體，可以不用該孔，能夠使用在末端處的小彎曲的實心區域，以取出和支持晶體。
按照較佳實施例構造的支架的另一主要優點是它們比圈有大得多的剛性。當浸泡在含晶體的液滴中時它們保持剛性，簡化了晶體取出。在用于改進繞射質量的“回火”或“退火”步驟期間它們不坍塌，并顯示出沒有由于在低溫流中的顫振而產生的嵌鑲性加寬的跡象。最后，應該注意這些制造的支架應該較普遍地應用于所有類型、有機和無機的小晶體。對于“干”晶體，如以上所指示可以不用毛細作用吸孔，使用膠水或油脂、或利用在數據收集之后可洗去的乙苯纖維素-乙酸乙酯的一小滴能夠牢固地連接晶體。
對于諸較佳實施例可以作出許多附加的變化或修改。例如，能夠利用其它聚合物制造該薄膜，或者利用兩層或多層不同的聚合物，以賦予較好的剛性。薄膜的表面可以形成圖形，以產生有肋的結構，用于較好的剛性和彎曲特性，并帶有最小的總質量。此外，可以化學處理該表面，例如，使試樣孔有排水性和“毛細作用吸液”孔有吸水性。在薄膜上、試樣孔周圍可以設置圖案對齊標記，以便于晶體的自動對齊。為方便諸不同尺寸的晶體，可以將試樣孔制成任何尺寸，并可以在一片聚酰亞胺上制造多個尺寸。對于各晶體尺寸然后可以使孔周圍的聚酰亞胺的寬度最小，使從該孔散射的X射線量最少。在其中支持件包括使用一圓筒桿的場合，可以將該桿制成中空狀和低比熱的、為高熱傳導材料，以使熱質量和在插入冷卻期間氮的蒸發最少。最后，薄膜連接的桿端可以成錐形，以致薄膜彎曲進入圓錐部分內，而不是圓筒部分內。通過對于某一試樣尺寸正確選擇孔尺寸和通過選擇桿的錐體的角度，可以將晶體放置在試樣支架/測角器的轉動軸線上。
總之，本發明包括用于大分子低溫晶體學的安裝晶體的一新方法，它保留了目前廣泛使用的尼龍圈的許多優點，同時解決了它們的大部分的許多缺陷。微加工的聚酰亞胺薄膜試樣支架較好的適合于處理很小晶體，這些很小晶體現在能夠特征為同步加速器束線的技術發展水平，并通過在結構基因中心處的自動結晶大量生產。這些支架應該簡化了X射線數據收集的自動化，并比用于從液滴自動取出晶體的現有的可替換方案更加適合。因為它們的制造是基于標準的微電子工業加工過程，所以這些支架應該容易地和便宜地每年生產幾百萬的數量，這些數量不久將被世界范圍的結構基因工作所要求。它們應該更普遍地用于所有類型的小有機/無機晶體，尤其是從用于X射線數據收集的低溫冷卻得益的那些小有機/生物分子。
雖然以許多較佳實施例和在其上的許多變化揭示了本發明，但是應該理解在不脫離如以下權利要求書所規定的本發明范圍的情況下，能夠作出許多附加的修改和變化。
權利要求
1.一種保持使用X射線晶體學進行檢測的一晶體的一支架，所述支架包括具有用于接納晶體的錐形末端的薄膜；以及用于對所述薄膜施加曲率、以增加所述薄膜的結構剛度的結構。
2.如權利要求1所述的支架，其特征在于，所述薄膜由塑性材料形成。
3.如權利要求2所述的支架，其特征在于，所述塑性材料是聚酰亞胺。
4.如權利要求1所述的支架，其特征在于，將曲率施加于所述薄膜的所述結構包括具有彎曲外表面的桿，所述薄膜附連于該彎曲外表面。
5.如權利要求4所述的支架，其特征在于，所述桿具有傾斜頂端，以增加用于所述晶體的觀察角。
6.如權利要求4所述的支架，其特征在于，所述桿具有錐形頂端，所述薄膜以相對于所述桿的縱向軸線成一角度附連于該錐形頂端，以增加用于所述晶體的觀察角。
7.如權利要求1所述的支架，其特征在于，用于將曲率施加于所述薄膜的所述結構包括中空套筒，將所述薄膜插入該套筒內，所述薄膜和中空套筒的尺寸被確定為在所述薄膜定位在中空套筒內時所述中空套筒將曲率施加于所述薄膜。
8.如權利要求7所述的支架，其特征在于，所述中空套筒包括內彎曲表面，所述薄膜被保持成與所述內彎曲表面接合。
9.如權利要求7所述的支架，其特征在于，所述套筒具有傾斜頂端，以增加用于所述晶體的觀察角。
10.如權利要求1所述的支架，其特征在于，用于對所述薄膜施加曲率的所述結構包括具有彎曲外表面的一桿，將所述桿插入具有彎曲內表面的一中空套筒，其中將所述薄膜插入在所述桿的所述彎曲外側表面和所述中空套筒的所述彎曲內表面之間。
11.如權利要求10所述的支架，其特征在于，所述桿和所述套筒各自具有傾斜頂端，以增加用于所述晶體的觀察角度。
12.如權利要求1所述的支架，其特征在于，所述薄膜具有50微米或以下的厚度。
13.如權利要求12所述的支架，其特征在于，所述薄膜具有15微米或以下的厚度。
14.如權利要求1所述的支架，其特征在于，所述一第一試樣孔設置在所述薄膜的所述末端處。
15.如權利要求14所述的支架，其特征在于，所述薄膜還包括與所述第一試樣孔分開的和通過一通道連接于所述第一孔的一第二孔，用于從所述第一試樣孔通過毛細作用吸去多余液體。
16.如權利要求14所述的支架，其特征在于，由在所述薄膜的所述末端處的邊緣圍繞所述第一試樣孔，所述邊緣具有100微米或以下的寬度。
17.如權利要求1所述的支架，其特征在于，所述薄膜包括與所述末端相對的一第二尾端，所述尾端為錐形，以便于所述薄膜插入安裝套筒內。
18.如權利要求1所述的支架，其特征在于，所述薄膜被包含在一密封的管內，以控制晶體在其中暴露的環境。
19.如權利要求18所述的支架，其特征在于，所述薄膜包括用于保持諸小滴液體的多個孔，用于控制所述微晶體在其中暴露的環境。
20.一種保持利用X射線晶體學進行檢測的一晶體的一支架，所述支架包括由具有50微米或以下的厚度的塑性材料制造的、并具有用于接納晶體的錐形末端的薄膜；以及具有彎曲外表面的桿，所述薄膜連接于該外表面，所述桿起到將曲率施加于所述薄膜的結構的作用，以增加所述薄膜的結構剛性。
21.如權利要求20所述的支架，其特征在于，所述塑性材料是聚酰亞胺。
22.如權利要求20所述的支架，其特征在于，所述桿具有傾斜頂端，以增加用于所述晶體的觀察角。
23.如權利要求20所述的支架，其特征在于，所述桿具有錐形頂端，所述薄膜以相對于所述桿的縱向軸線成一角度附連于該錐形頂端，以增加用于所述晶體的觀察角。
24.如權利要求20所述的支架，其特征在于，進一步包括中空套筒，將所述桿插入該套筒內，所述套筒具有彎曲內表面，其中將所述薄膜插入在所述桿的所述彎曲外側表面和所述中空套筒的所述彎曲內表面之間
25.如權利要求20所述的支架，其特征在于，所述桿和所述套筒各自具有傾斜頂端，以增加用于所述晶體的觀察角。
26.如權利要求20所述的支架，其特征在于，所述薄膜具有15微米或以下的厚度。
27.如權利要求20所述的支架，其特征在于，一第一試樣孔設置在所述薄膜的所述末端處。
28.如權利要求27所述的支架，其特征在于，所述薄膜還包括與所述第一試樣孔分開的和通過一通道連接于所述第一孔的一第二孔，用于從所述第一試樣孔通過毛細作用吸去多余液體。
29.如權利要求27所述的支架，其特征在于，由在所述薄膜的所述末端處的邊緣圍繞所述第一試樣孔，所述邊緣具有100微米或以下的寬度。
30.如權利要求20所述的支架，其特征在于，所述薄膜包括與所述末端相對的一第二尾端，所述尾端為錐形，以便于所述薄膜插入安裝套筒內。
31.如權利要求20所述的支架，其特征在于，所述薄膜被包含在一密封的管內，以控制晶體在其中暴露的環境。
32.如權利要求31所述的支架，其特征在于，所述薄膜包括用于保持諸小滴液體的多個孔，用于控制所述微晶體在其中暴露的環境。
33.一種安裝利用X射線晶體學進行檢測的一晶體的一方法，所述方法包括以下步驟提供具有用于接納晶體的錐形末端的薄膜；以及對所述薄膜施加曲率，以增加所述薄膜的結構剛度，并將所述末端形成為勺形；從液體溶液勺取要檢測的晶體進入所述末端內；以及將所述薄膜放置在X射線晶體學設備內。
34.如權利要求33所述的方法，其特征在于，選擇所述薄膜由塑性材料形成。
35.如權利要求34所述的方法，其特征在于，選擇所述塑性材料由聚酰亞胺形成。
36.如權利要求33所述的方法，其特征在于，對所述薄膜施加曲率的所述步驟包括將所述薄膜附連于桿的彎曲外表面。
37.如權利要求36所述的方法，其特征在于，選擇新桿具有傾斜頂端，以增加用于所述晶體的觀察角。
38.如權利要求36所述的方法，其特征在于，選擇所述桿具有錐形頂端，將所述薄膜以相對于所述桿的縱向軸線成一角度附連于所述錐形頂端，以增加用于所述晶體的觀察角。
39.如權利要求33所述的方法，其特征在于，對所述薄膜施加曲率的所述步驟包括將所述薄膜插入中空套筒內，所述薄膜和中空套筒的尺寸被確定為在所述薄膜位于所述套筒內時所述中空套筒對所述薄膜施加曲率。
40.如權利要求39所述的方法，其特征在于，所述中空套筒包括內彎曲表面，并保持所述薄膜與所述內彎曲表面接合。
41.如權利要求39所述的方法，其特征在于，選擇所述套筒具有傾斜頂端，以增加用于所述晶體的觀察角。
42.如權利要求33所述的方法，其特征在于對所述薄膜施加曲率的所述步驟包括提供具有彎曲外表面的桿和具有彎曲內表面的中空套筒；將所述薄膜附連于所述桿的所述外表面；以及將所述桿插入所述中空套筒，以致所述薄膜被設置在所述桿的所述彎曲外側表面和所述中空套筒的所述彎曲內表面之間。
43.如權利要求42所述的方法，其特征在于，選擇所述桿和所述套筒各自具有傾斜頂端，以增加用于所述晶體的觀察角。
44.如權利要求33所述的方法，其特征在于，選擇所述薄膜具有50微米或以下的厚度。
45.如權利要求44所述的方法，其特征在于，選擇所述薄膜具有15微米或以下的厚度。
46.如權利要求33所述的方法，其特征在于，在所述薄膜的所述末端設置一第一試樣孔。
47.如權利要求46所述的方法，其特征在于，所述薄膜還包括與所述第一試樣孔分開的和通過一通道連接于所述第一孔的一第二孔，所述方法還包括通過將毛細作用材料放在所述第二孔內，從所述第一試樣孔通過毛細作用吸去多余液體的步驟。
48.如權利要求46所述的方法，其特征在于，在所述薄膜的所述末端處的邊緣包圍所述第一試樣孔，所述邊緣具有100微米或以下的寬度。
49.如權利要求33所述的方法，其特征在于，選擇所述薄膜以包括與所述末端相對的一第二尾端，所述尾端是錐形的，將所述薄膜設置在X射線晶體學設備內的所述方法包括將所述薄膜的所述錐形尾端插入一安裝套筒內。
50.如權利要求33所述的方法，其特征在于，將所述薄膜設置在X射線晶體學設備內的所述步驟包括將所述薄膜密封在一管子內，以控制所述晶體在其中暴露的環境。
51.如權利要求50所述的方法，其特征在于，選擇所述薄膜以包括用于保持諸小滴液體的多個孔，所述方法還包括將諸小滴液體放置在所述諸孔內、以控制所述微晶體在其中暴露的環境的步驟。
全文摘要
通過使用具有被施加的曲率的、有圖形的聚酰亞胺薄膜(12)、并將該薄膜附加于小金屬桿(16)的彎曲外表面為X射線晶體學備制用于安裝生物大分子的微晶體的試樣支架。有圖形的薄膜(12)較佳地包括用于保持晶體的錐形末端(24)。較佳地，在該薄膜內設置用于接納晶體的小試樣孔。還可提供通過排液通道連接于試樣孔的一第二較大的孔，允許排除過多的液體和在粘性溶性中較容易的操作。施加于薄膜(12)的曲率增加了薄膜的剛度和允許用于取出晶體的方便的勺狀作用。聚酰亞胺最少地影響本底和吸收，并可被處理成得到所需的疏水性或親水性。
文檔編號G01N23/20GK101080628SQ200480007486
公開日2007年11月28日 申請日期2004年3月22日 優先權日2003年3月20日
發明者R·E·瑟尼, Z·斯特姆, K·奧尼爾, J·卡米托 申請人:康奈爾研究基金會股份有限公司