專利名稱：一種酮體檢測方法
技術領域：
本發明屬酮體檢測領域，具體地說，涉及一種檢測血、尿、乳中草酰乙酸或丙酮含量的方法。
背景技術：
奶牛酮病(Ketosis in dairy cows)是圍產期高產奶牛能量代謝障礙性疾病。主要生化特征低血糖癥、酮血癥、酮尿癥、酮乳癥。該病是奶牛業危害最大的營養代謝病之一，發達國家發病率5％～30％，國內20％～30％。由于造成高產奶牛泌乳量下降、繁殖能力降低、繼發乳房炎、胎衣不下、脂肪肝、真胃變位等圍產期疾病，給全世界奶牛業造成巨大的經濟損失。
用于該病早期診斷的方法就是酮體測定。目前，酮體檢測方法有試紙條定性檢測方法；水楊醛比色法、高效液相色譜法及β-羥丁酸試劑盒等定量檢測方法。以上這些方法的不足之處表現在準確性差，假陽性高，成本高，操作繁瑣，需要昂貴儀器。
目前還沒有穩定性、靈敏度、準確性兼優而又操作簡便、成本低的酮體檢測方法。
發明內容
本發明的目的是提供一種方便實用、穩定性好、靈敏度高、準確性高、成本低的酮體檢測的方法。該方法用于血、尿、乳中酮體的檢測。為現場集約化奶牛場防治奶牛隱性酮病提供依據。發明人經過嚴謹的試驗，對現有水楊醛比色法進行了改良，克服了原有方法準確性差、假陽性高、成本高、操作繁瑣等不足，完成了本發明。
本發明提供了一種酮體檢測的方法，它包括如下步驟(1)量取樣品，按體積計用量1∶6～12加入蒸餾水，混勻；(2)加入12％HClO4，邊加入邊混勻；(3)離心，取上清液置于安瓿中，加入氧化劑混勻，將安瓿封口，高壓加熱；(4)加入顯色液和50％KOH混勻，置于冰箱中16～22小時；(5)在波長470nm光下進行比色測定，用空白管調零點，讀取光密度讀數；(6)繪制酮體標準曲線，計算樣品中酮體含量。
本發明中安瓿用汽油噴燈封口。
本發明中樣品選自血、尿、乳。
本發明中氧化劑為0.2％K2Cr2O7和6N H2SO4混合液。
本發明中顯色液是由2％水楊醛、5％Na2SO3、6N KOH按體積計用量2∶1∶1比例配成。
所述方法詳述如下(1)取血液、尿液、乳液0.2ml，加1.2ml～2.4ml蒸餾水，振蕩混合。
(2)加0.4ml的12％HCLO4，邊加邊搖，混勻。
(3)離心去蛋白(3000r/min，15min)，取上清液1ml加入安瓿里，加入氧化劑0.5ml，用汽油噴燈將安瓿封口，在高壓消毒鍋內高壓加熱(15磅，30min)。
(4)加入顯色液2ml和50％KOH 2.5ml，放置在4℃的冰箱中16-22小時。
(5)用國產722光柵分光光度儀，波長470nm、光徑1cm、溫度4℃～25℃下進行比色，空白管調零點，讀取測定管光密度讀數。
(6)酮體標準曲線繪制①分別配置濃度為(ug/ml)3.125，6.25，12.5，25，50，100，150，200，250，300，350，400的丙酮標準液。
②加入顯色液和50％KOH，放置在4℃的冰箱中16～22小時。
③用國產722光柵分光光度儀，在波長470nm、光徑1cm、溫度4℃～25℃下進行比色，空白管調零點，讀取測定管光密度讀數。當濃度高于100ug/ml時，因反應后顏色較深，依次進行2、4、6、8、10、12倍稀釋(倍比稀釋法)，再進行比色。
④以吸光度值為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線。
其中氧化劑按如下方法配制取0.2g K2Cr2O7加入100ml的6NH2SO4(83.33ml濃硫酸加蒸餾水至500ml)中。
其中顯色液為2％水楊醛(取2.22ml水楊醛加3N KOH至100ml)、5％Na2SO3和6N KOH按體積計用量2∶1∶1比例配成。
其中酮體標準液(39.7ug/ml≈40ug/ml)按如下方法配制準確吸取丙酮1ml，加入容量瓶中，加蒸餾水稀釋至100ml，混勻。此溶液含丙酮790mg/l。吸出此溶液25.2ml，用蒸餾水稀釋至500ml，配成40ug/l酮體標準液。
此方法標準曲線線性范圍3～389ug/mL；變異系數批內為2.94％～8.97％，批間為3.48％～11.07％；回收率108％；所配試劑保存期避光，干燥處，1周。
所述方法設備簡便、易于操作、可大批量檢測，同時其線性范圍、變異系數、穩定性、回收率和所配試劑保存期等基本一致。
新采集的血清、尿液、乳汁，如不能立刻測定，需要在-20℃保存。
奶牛血、尿、乳樣品酮體水平10-20mg/dl為亞臨床酮病，20mg/dl以上為臨床酮病。
本發明所述方法的反應原理酮體中的乙酰乙酸和β-羥丁酸氧化水解后生成丙酮，丙酮在強堿溶液中與水楊醛生成一種顯色的1，5-雙(2-羥苯基)-3，4-戊二烯酮產物。其顏色的深度與丙酮的含量成正比。可用光電比色法和分光光度法測定。
本發明所述方法的優點有以下幾個方面試劑來源方便，價格低廉；所配溶液易分裝保存，貯存時間較長；僅需要簡易設備，成本低；工藝簡便、性能穩定，可以對大批量樣品進行測定。
本發明所述方法可作為檢測奶牛血、尿、乳中酮體的定量檢測，作為奶牛酮病的診斷指標，適用于現場獸醫實驗室。
圖1為酮體標準曲線。縱坐標為吸光度值(OD)。橫坐標為酮體濃度。
具體實施例方式
實施例1酮體標準曲線和線性方程分別配置濃度為(ug/ml)3.125，6.25，12.5，25，50，100，150，200，250，300，350，400的丙酮標準液。去各濃度丙酮標準液1.5ml，加入顯色液(2％水楊醛、5％Na2SO3、6N KOH按體積計用量2∶1∶1)2ml和50％KOH 2.5ml，放置在4℃的冰箱中20小時。用國產722光柵分光光度儀，在波長470nm、光徑1cm、溫度20℃下進行比色，空白管調零點，讀取測定管光密度讀數。當濃度高于100ug/ml時，因反應后顏色較深，依次進行2、4、6、8、10、12倍稀釋(倍比稀釋法)，再進行比色。以吸光度值為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線(圖1)。
表1 酮體標準曲線值
標準曲線方程y＝0.0176x R2＝0.9834
實施例2奶牛血、尿、乳中酮體的檢測分別取正常奶牛和酮病奶牛血樣、尿樣、乳樣各0.2ml，分別加1.2ml蒸餾水，振蕩混合。加0.4ml的12％HCLO4，邊加邊搖，混勻。在3000r/min下離心15min，去蛋白，取上清液1ml加入安瓿里，加入氧化劑(0.2％K2Cr2O7和6N H2SO4混合液)0.5ml，用汽油噴燈將安瓿封口，在高壓消毒鍋內15磅高壓加熱30min。加入顯色液2ml和50％KOH 2.5ml，放置在4℃的冰箱中16小時。用國產722光柵分光光度儀，在波長470nm、光徑1cm、溫度4℃下進行比色，空白管調零點，讀取測定管光密度讀數。
表2 奶牛血酮、尿酮和乳酮測定結果 單位mg/dl
實施例3奶牛血、尿、乳中酮體的檢測分別取正常奶牛和酮病奶牛血樣、尿樣、乳樣各0.2ml，分別加2.4ml蒸餾水，振蕩混合。加0.4ml的12％HCLO4，邊加邊搖，混勻。在3000r/min下離心15min，去蛋白，取上清液1ml加入安瓿里，加入氧化劑(0.2％K2Cr2O7和6N H2SO4混合液)0.5ml，用汽油噴燈將安瓿封口，在高壓消毒鍋內15磅高壓加熱30min。加入顯色液2ml和50％KOH 2.5ml，放置在4℃的冰箱中22小時。用國產722光柵分光光度儀，在波長470nm、光徑1cm、溫度25℃下進行比色，空白管調零點，讀取測定管光密度讀數。
表3 奶牛血酮、尿酮和乳酮測定結果單位mg/dl
權利要求
1.一種奶牛酮體檢測的方法，它包括如下步驟(1)量取樣品，按體積計用量1∶6～12加入蒸餾水，混勻；(2)加入12％HClO4，邊加入邊混勻；(3)離心，取上清液置于安瓿中，加入氧化劑混勻，將安瓿封口，高壓加熱；(4)加入顯色液和50％KOH混勻，置于冰箱中16～22小時；(5)在波長470nm光下進行比色測定，用空白管調零點，讀取光密度讀數；(6)繪制酮體標準曲線，計算樣品中酮體含量。
2.根據權利要求1所述的方法，其中安瓿用汽油噴燈封口。
3.根據權利要求1所述的方法，其中樣品選自血、尿、乳。
4.根據權利要求1所述的方法，其中氧化劑為0.2％K2Cr2O7和6N H2SO4混合液。
5.根據權利要求1所述的方法，其中顯色液是由2％水楊醛、5％Na2SO3、6N KOH按體積計用量2∶1∶1比例配成。
全文摘要
本發明涉及一種酮體檢測的方法，該方法可用于血、尿、乳中草酰乙酸或丙酮的檢測。為現場集約化奶牛場防治奶牛隱性酮病提供依據。
文檔編號G01N21/77GK1851464SQ20051001162
公開日2006年10月25日 申請日期2005年4月22日 優先權日2005年4月22日
發明者張洪友, 夏成, 吳凌 申請人:張洪友, 夏成, 吳凌