專利名稱：一種檢測裸子植物花粉管內抗原的方法
技術領域：
本發明涉及一種檢測裸子植物花粉管內抗原的方法，特別涉及一種利用熒光免疫技術檢測裸子植物花粉管內抗原的方法。
背景技術：
花粉管作為有花植物受精過程中雄性生殖單位的載體，攜帶和傳遞著精細胞到達胚珠，實現精卵結合，完成受精作用。花粉管是一種典型的具頂端生長特性且獨立存在的單倍體細胞，在體外生長時呈現均一的柱狀極性生長模式，因而被認為是生物技術領域研究極性生長的理想的細胞體系。另外，花粉管作為一個模式體系，對于深入研究細胞極性生長，細胞間相互作用以及信號傳導也有重要意義。由于花粉管細胞壁主要由纖維素、胼胝質、果膠質等多糖類和一些蛋白質類物質組成，胞內抗原的檢測定位受到胞壁物質的限制，外源物質很難進入胞內與抗原發生發應。另外，對于一些蛋白質抗原，由于在固定過程中很容易導致抗原失活，以及抗原抗體反應過程中所需的時間溫度條件的限制，使得花粉管內抗原檢測定位較難，且迄今還沒有有關裸子植物花粉管內抗原檢測定位的行之有效的方法，導致與裸子植物相關的生物學研究相對被子植物而言比較滯后。
發明內容
本發明的目的是提供一種檢測裸子植物花粉管內抗原的方法。
本發明提供的檢測裸子植物花粉管內抗原的方法，包括以下步驟1)用含多聚甲醛的磷酸緩沖液將花粉管固定后，用含纖維素酶和離析酶的酶解液酶解裸子植物花粉管，再用質量百分比濃度為0.2％-1％的TritonX-100或NP-40水溶液洗滌；2)將經步驟1)處理的花粉管與抗待測抗原對應的抗體進行免疫熒光反應，如檢測到熒光，則裸子植物花粉管內含有該待測抗原并得到該待測抗原的定位情況。
步驟1)中，為了獲得更高的靈敏度和更高的信噪比，所述含多聚甲醛的磷酸緩沖液中，多聚甲醛的質量百分含量是2-4％。
所述固定的時間可為1-2小時。
所述固定花粉管用的多聚甲醛的質量百分比濃度優選為2％，固定時間優選為2小時。
所述含纖維素酶和離析酶的酶解液含有質量百分比濃度為1.5-3％的纖維素酶，質量百分比濃度為1.2％-2％的離析酶，pH5-6、15mM 2-(N-嗎啡啉)乙磺酸(MES)，400mM甘露醇，5mM氯化鈣和1μg·mL-1蛋白酶抑制劑。
所述蛋白酶抑制劑可為aprotinin，pepstatin A，chymostatin或leupeptin。
所述纖維素酶的質量百分比濃度優選為1.5％；所述離析酶的質量百分比濃度優選為1.2％。
所述酶解裸子植物花粉管的時間可為8-15分鐘，優選為10分鐘。
所述TritonX-100的質量百分比濃度優選為0.2％。
所述纖維素酶可為市售的各種纖維素酶，優選cellulase R-10；所述離析酶可為市售的各種離析酶，優選macerozyme R-10。
步驟2)中，所述經步驟1)處理的花粉管與抗待測抗原對應的抗體進行免疫熒光反應是將經步驟1)處理的花粉管轉移到多聚賴氨酸包被的載玻片上，用1-3％牛血清白蛋白溶液在室溫下封閉1-2小時，經含0.2％-1％的TritonX-100或NP-40的磷酸緩沖液充分洗滌后，在抗待測抗原的一抗中0-4℃或室溫下孵育2-12小時，轉移到熒光標記的抗IgG的二抗溶液中在室溫或37℃下孵育1-2小時，用含50％甘油的磷酸緩沖液封片，在熒光顯微鏡下觀察結果。
所述在一抗中孵育溫度優選為4℃；所述在二抗中孵育溫度優選為37℃，孵育時間優選為1小時。
所述裸子植物可為白皮松、雪松，青扦，白扦等松杉綱裸子植物；優選為松科裸子植物，特別優選為白皮松和青扦。
所述磷酸緩沖液是以10mM磷酸鹽，138mM氯化鈉，2.7mM氯化鉀配制的。本發明的方法可以用現有的已知抗原制備抗該抗原的一抗，或直接從商業途徑獲得該抗已知抗原的一抗，通過免疫熒光反應檢測裸子植物花粉管內有無該已知抗原。
本發明的方法中，多聚甲醛能快速固定花粉管內蛋白質、DNA、質膜等成分，而不破壞抗原。氯化鈣可以保護原生質體膜的穩定性。纖維素酶可以酶解花粉內壁的纖維素成分，而離析酶降解花粉內壁中的果膠質等組分，從而可部分降解內壁，同時Triton X-100可進一步透化細胞壁，使得抗原抗體充分結合。由于花粉管較小，將其黏附在多聚賴氨酸包被的載玻片上，可達到固定抗原，方便操作的目的。使用含50％甘油的磷酸緩沖液進行封片，既可防止熒光快速淬滅，同時價格低廉節省材料。本發明利用免疫熒光技術檢測植物花粉管內抗原的方法克服了由于花粉管壁而無法標記胞內抗原的障礙，同時優化各種反應條件，抗原抗體結合充分，標記效果好，靈敏度高，掃描得到的圖象信噪比高，能真實而充分地反映抗原在花粉管內的分布情況，具有較大的實際應用價值。
圖1為在激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察到的G-protein在青扦花粉管質膜上的定位情況圖2為在激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察到的G-protein在白皮松花粉管質膜上的定位情況具體實施方式
下述實施例中的方法如無特別說明，均為常規方法。
以下實施例中的百分比濃度，如無特別說明，均為質量百分比濃度。
實施例1、青扦花粉管內抗原的檢測取培養18h的青扦花粉管，用無菌水懸浮，制成花粉管懸浮液，進行如下步驟的處理1)收集花粉管，用pH7.2PBS緩沖液(10mM磷酸鹽，138mM氯化鈉，2.7mM氯化鉀)重懸，然后重復此步驟一次；2)加入多聚甲醛，使其終濃度為2％(新鮮配制)，室溫孵育2h，吸去多聚甲醛，用pH7.2的PBS緩沖液(10mM磷酸鹽，138mM氯化鈉，2.7mM氯化鉀)充分洗滌2次，每次5min；3)用含1.5％纖維素酶cellulase R-10(購自Yakult Honsha Co.Ltd)和1.2％離析酶macerozyme R-10(購自Yakult Honsha Co.Ltd)的酶解液(pH5.5、15mMMes，400mM甘露醇，5mM氯化鈣和1μg·mL-1蛋白酶抑制劑(aprotinin，Calbiochem)酶解青扦花粉管10分鐘，酶解后的花粉管立即用pH7.2，10mM磷酸緩沖液(10mM磷酸鹽，138mM氯化鈉，2.7mM氯化鉀)洗滌；加入含0.2％TritonX-100的pH7.2的PBS緩沖液(10mM磷酸鹽，138mM氯化鈉，2.7mM氯化鉀)，室溫作用5min后用pH7.2PBS緩沖液(10mM磷酸鹽，138mM氯化鈉，2.7mM氯化鉀)洗滌4次，每次5min；調整細胞濃度至1×105個/ml，將花粉管懸液滴加到多聚賴氨酸包被的載玻片上，室溫下靜置10min，然后用含有3％(3g/100ml)牛血清白蛋白的pH7.2、10mM PBS緩沖液(10mM磷酸鹽，138mM氯化鈉，2.7mM氯化鉀)在室溫下封閉1h；4)用抗G蛋白抗體(Calbiochem)(用含1％牛血清白蛋白的10mM PBS將G蛋白抗體稀釋到20-50ug/ml)在4℃孵育12小時；用PBST(含有PBS緩沖液(10mM磷酸鹽，138mM氯化鈉，2.7mM氯化鉀)和0.05％TritonX-100)清洗10min，共3次。吸凈液體，但不可干燥；加入異硫氰酸熒光黃(FITC)標記的二抗(Sigma，St.Louis，USA)，37℃下孵育1h，同上用PBST清洗10min，清洗3次后吸干液體；
滴加50μl封固液(含有50％(V/V)甘油的PBS溶液(10mM磷酸鹽，138mM氯化鈉，2.7mM氯化鉀))于載玻片上的花粉管上，加蓋玻片，空氣干燥30min，熒光顯微鏡下觀察、拍照。
相對于青扦花粉管設陰性對照將青扦花粉管用免疫前動物血清代替一抗進行孵育，或省略一抗直接進行二抗孵育。結果如圖1所示，表明G-protein主要定位于青扦花粉管質膜上，在頂端濃度最高(熒光最亮)。而設置的陰性對照并沒有觀察到熒光，說明本發明的方法是可靠的。
實施例2、白皮松花粉管內抗原的檢測取培養72h的白皮松花粉管，用無菌水懸浮，制成花粉管懸浮液，進行如下步驟的處理1)收集花粉管，用pH7.2PBS緩沖液(10mM磷酸鹽，138mM氯化鈉，2.7mM氯化鉀)重懸，然后重復此步驟一次；2)加入多聚甲醛，使其終濃度為4％(新鮮配制)，室溫孵育1h，吸去多聚甲醛，用pH7.2的PBS緩沖液(10mM磷酸鹽，138mM氯化鈉，2.7mM氯化鉀)充分洗滌2次，每次5min；3)用含3％纖維素酶cellulase R-10(購自Yakult Honsha Co.Ltd)和2％離析酶macerozyme R-10(購自Yakult Honsha Co.Ltd)的酶解液(pH5.5、15mM Mes，400mM甘露醇，5mM氯化鈣和1μg·mL-1蛋白酶抑制劑(pepstatin，Calbiochem)酶解白皮松花粉管8分鐘，酶解后的花粉管立即用pH7.2，10mM磷酸緩沖液(10mM磷酸鹽，138mM氯化鈉，2.7mM氯化鉀)洗滌；加入含0.2％Triton X-100的pH7.2的PBS緩沖液(10mM磷酸鹽，138mM氯化鈉，2.7mM氯化鉀)，室溫作用5min后用pH7.2PBS緩沖液(10mM磷酸鹽，138mM氯化鈉，2.7mM氯化鉀)洗滌4次，每次5min；調整細胞濃度至1×105個/ml，將花粉管懸液滴加到多聚賴氨酸包被的載玻片上，室溫下靜置10min，然后用含有3％(3g/100ml)牛血清白蛋白的pH7.2、10mM PBS緩沖液(10mM磷酸鹽，138mM氯化鈉，2.7mM氯化鉀)在室溫下封閉1h；4)用抗G蛋白抗體(Calbiochem)(用含1％牛血清白蛋白的10mM PBS將G蛋白抗體稀釋到20-50ug/ml)在4℃孵育12小時；用PBST(含有PBS緩沖液(10mM磷酸鹽，138mM氯化鈉，2.7mM氯化鉀)和0.05％TritonX-100)清洗10min，共3次。吸凈液體，但不可干燥；加入異硫氰酸熒光黃(FITC)標記的二抗(Sigma，St.Louis，USA)，37℃下孵育1h，同上用PBST清洗10min，清洗3次后吸干液體；滴加50μl封固液(含有50％(V/V)甘油的PBS溶液(10mM磷酸鹽，138mM氯化鈉，2.7mM氯化鉀))于載玻片上的原生質體上，加蓋玻片，空氣干燥30min，熒光顯微鏡下觀察、拍照。
相對于白皮松花粉管設陰性對照將白皮松花粉管用免疫前動物血清代替一抗進行孵育，或省略一抗直接進行二抗孵育。結果如圖2所示，表明G-protein主要定位于白皮松花粉管質膜上，在頂端濃度最高(熒光最亮)。而設置的陰性對照并沒有觀察到熒光，說明本發明的方法是可靠的。
權利要求
1.一種檢測裸子植物花粉管內抗原的方法，包括以下步驟1)用含多聚甲醛的磷酸緩沖液將花粉管固定后，用含纖維素酶和離析酶的酶解液酶解裸子植物花粉管，再用質量百分比濃度為0.2％-1％的TritonX-100或NP-40水溶液洗滌；2)將經步驟1)處理的花粉管與抗待測抗原對應的抗體進行免疫熒光反應，如檢測到熒光，則裸子植物花粉管內含有該待測抗原并得到該待測抗原的定位情況。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述含多聚甲醛的磷酸緩沖液中，多聚甲醛的質量百分含量是2-4％。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于所述固定花粉管用的多聚甲醛的質量百分比濃度為2％，固定時間為2小時。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述含纖維素酶和離析酶的酶解液含有質量百分比濃度為1.5-3％的纖維素酶，質量百分比濃度為1.2％-2％的離析酶，pH5-6、15mM 2-嗎啡啉乙磺酸，400mM甘露醇，5mM氯化鈣和1μg·mL-1蛋白酶抑制劑。
5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于所述纖維素酶的質量百分比濃度為1.5％，所述離析酶的質量百分比濃度為1.2％。
6.根據權利要求4所述的方法，其特征在于所述酶解裸子植物花粉管的時間為8-15分鐘，優選為10分鐘。
7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟1)中，TritonX-100的質量百分比濃度為0.2％。
8.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟2)中，所述經步驟1)處理的花粉管與抗待測抗原對應的抗體進行免疫熒光反應是將經步驟1)處理的花粉管轉移到多聚賴氨酸包被的載玻片上，用牛血清白蛋白溶液在室溫下封閉1-2小時，經含0.2-1％Triton X-100或NP-40的磷酸緩沖液充分洗滌后，在抗待測抗原的一抗中0-4℃或室溫下孵育2-12小時，轉移到熒光標記的抗IgG的二抗溶液中在室溫或37℃下孵育1-2小時，用含50％甘油的磷酸緩沖液封片。
9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于所述一抗中孵育溫度為4℃；所述在二抗中孵育溫度為37℃，孵育時間為1小時。
10.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述裸子植物為松杉綱松科裸子植物；優選為白皮松或青扦。
全文摘要
本發明公開了一種檢測裸子植物花粉管內抗原的方法。該方法，包括以下步驟1)用含多聚甲醛的磷酸緩沖液將花粉管固定后，用含纖維素酶和離析酶的酶解液酶解裸子植物花粉管，再用質量百分比濃度為0.2－1％的TritonX－100或NP－40水溶液洗滌；2)將經步驟1)處理的花粉管與抗待測抗原對應的抗體進行免疫熒光反應，如檢測到熒光，則裸子植物花粉管內含有該待測抗原并得到該待測抗原的定位情況。本發明的利用免疫熒光技術檢測植物花粉管內抗原的方法抗原抗體結合充分，標記效果好，靈敏度高，掃描得到的圖象信噪比高，能真實而充分地反映抗原在花粉管內的分布情況，具有較大的實際應用價值。
文檔編號G01N21/76GK1811433SQ20061000316
公開日2006年8月2日 申請日期2006年2月20日 優先權日2006年2月20日
發明者林金星, 張凌云 申請人:中國科學院植物研究所