用于檢測目標反應與治療黃病毒感染癥狀之組合物及方法

專利名稱：用于檢測目標反應與治療黃病毒感染癥狀之組合物及方法
用于檢測目標反應與治療黃病毒感染癥狀之組合物及方法相關申請案本申請案主張美國專利申請案第12/079，576號(2008年3月27日申請)及美國 專利申請案第11/469，270號(2006年8月31日申請)之巴黎公約優先權，其主張美國臨 時申請案第60/713，463號(2005年8月31日申請)之巴黎公約優先權，上述各申請案之 揭示內容全文皆以參考數據方式納入本說明書中。本發明由臺灣國家科學委員會94F008-5、NSC 95-2320-B-010010及NSC 95-3112-B-010-017之計劃所支持。本發明亦由臺灣中央研究院94M002-1與國立陽明大學 95A-CT8G02之計劃所支持。
背景技術：
在本說明書中所參照之任何先前技術皆不或不應被視做承認或以任何形式暗示 該先前技術在任何國家構成通識之一部分。本文所引用之所有文獻，其全文皆以參考數據 方式具體納入本說明書中。免疫系統能使宿主生物區辨本身及非本身抗原，以及識別及清除侵入之病原體。 后天性免疫系統(adaptive immunity system)依存于高度多形(highly polymorphic) 分子，諸如主要組織兼容性復合體(MHC)之第I類及第II類抗原、T細胞受體及B細胞受 體，以向T細胞及B細胞呈遞抗原，因而導致免疫系統之活化。先天免疫系統識別此等多樣 性抗原之機制未明，直到Janeway提出模式識別受體(pattern recognition receptors, PRRs)之觀念(Janeway，1989，Cold Spring Harb Symp Quant Biol 54Pt 1，1-13)。該假說 后來藉由鑒定出由下列受體識別之病原體相關性分子模式(PAMPs)而證明為正確，該等受 體為類鐸受體(TOLL-like receptors) (Aderem and Ulevitch, 2000Nature 406，782-7 ； Akira and Takeda,2004, Nat Rev Immunol 4,499-511 ；Athman and Philpott,2004,Curr Opin Microbiol 7，25-32)、凝集素(lectin)受體(Cambi and Figdor，2003，Curr Opin Cell Biol 15，539-46)、類免疫球蛋白(類 Ig)受體(Daws et al. ,2003, J Immunol 171， 594-9)、及NOD蛋白(Athman and Philpott, 2004, Curr Opin Microbiol 7，25_32)、以及其 它(Liu et al.，2001，J Biol Chem 276,34686-94 ；McDonald et al.，2005，J Biol Chem 280,20177-80)。除了由類鐸受體所識別且經充分鑒定特征之PAMPs(Akira and Takeda, 2004, Nat Rev Immunol 4,499-511)之外，新近之研究顯示宿主免疫系統可經由特異性碳水化合 物抗原而識別侵入之病原體。舉例言之，甘露糖受體可識別在病原體表面表現之具高甘露 糖分子部分(Stahl and Ezekowitz, 1998, Curr Opin Immunol 10，50-5)，同時樹狀細胞 凝集素-I(Dectin-I)受體可特異性地與β-葡聚糖結合，該β _葡聚糖為真菌壁表面之 多醣體之主要骨架(Brown and Gordon, 2001, Nature 413，36-7 ；Herre et al.，2004，Mol Immunol 40，869-76)。此等結果暗示與病原體相關之碳水化合物結構為由免疫細胞之先天 性免疫受體所識別之標靶之一。靈芝類(Ganoderma)及冬蟲夏草類(Cordyc印s)真菌為在中國為最盛行服用之草藥。自靈芝(Ganoderma lucidum，亦稱為Ling zhi、Reishi)萃取出之多醣體曾被用于傳 統中藥而作為抗腫瘤劑及免疫調節劑(Lien, 1990, Prog Drug Res 34,395-420 ；Wang et al.，2002，Bioorg Med Chem 10，1057-62 ；Shiao，2003，Chem Rec 3，172-80)，而從冬蟲夏 草(Cordyceps sinensis) (Cordyceps> Caterpillar fungus)萃取出者貝Ijll示會改變細 胞凋亡自穩態(apoptotic homeostasis)，并會改善呼吸、腎臟、及心血管功能(Buenz et al. ,2005, J Ethnopharmacol 96,19-29 ；Zhu et al. , 1998, J Altern Complement Med 4, 289-303 ；Zhu et al.，1998，J Altern Complement Med 4，429-57)，以及增加全身對于胰島 素之敏感性(Balon et al. ,2002, J Altern Complement Med8，315-23)。不過，萃取物之 多醣體組成于多醣體系萃取自不同來源、不同菌株、及于不同生長條件下培養時皆會發生 變化。仰賴高效液相層析(HPLC)及質子-核磁共振之分析方法曾被用于研究單離自 (Ganoderma lucidum) H&l胃(Cordyceps sinensis)(He and
Seleen，2004，Int. J. Med. Mushrooms 6，253)。不過，高效液相層析圖系基于與靈芝酸 (ganoderic acid) A及C(靈芝之二種主要三萜化合物)或腺苷之比較。依據質譜仍難以知 道萃取物是否含有多醣體之活性成分。本發明辨識出在受到黃病毒(諸如，登革熱病毒(Dengue virus)或日本腦脊髓炎 病毒(Japanese encephamyelitis virus))感染時會誘發細胞滲漏及其它負作用之細胞受 體。使用本發明所揭露之融合蛋白，其判定出病原體(諸如，黃病毒)會經由糖苷鍵結而結 合之受體。一旦判定出該等受體，即可判定結合特定受體之作用，其中對于造成特定癥狀之 受體的尋靶可由能夠阻斷病原體與受體結合之試劑靶向。因此，就登革熱病毒及日本腦脊 髓炎病毒而言，TNF-α會在病原體結合DLVR1/CLEC5A受體時釋出。以單株抗體阻斷DLVRl/ CLEC5A受體可減少TNF- α之分泌，且同時不會影響負責進行病毒清除之細胞激素的分泌， 因而使經感染小鼠之存活率由零增加至約50%。

發明內容
根據本說明書揭示之特征，本發明提供一種方法，其包含取得融合蛋白質族 群(complement)(其中各融合蛋白質包含受體的結合區域(domain)以及提供受質 (substrate)固定之區域)，使融合蛋白質與病原體接觸以確認該病原體是否可與該融合 蛋白質族群中至少一融合蛋白質上之結合區域結合，及檢測該病原體是否與該融合蛋白質 結合。「融合蛋白質族群」乙辭代表至少一受體的許多不同結合區域。根據本說明書揭示之特征，本發明提供一種方法，其包含取得易受病原體感染之 細胞，剔除至少一細胞受體基因，使該等細胞與該病原體接觸，及測量該等細胞之細胞激素 分泌量。根據本說明書揭示之特征，本發明提供一種方法，其包含鑒定至少一可結合病原 體所展示之配體(Iigand)的細胞受體，以及對經該病原體感染之動物投予試劑，以阻斷該 配體與該受體之結合而調控該病原體之作用。根據本說明書揭示之特征，本發明提供一種方法，其包含提供有效量的試劑，以調 節感染動物之病原體的作用，以調節該病原體對該動物上的作用。該試劑系針對至少一該 感染動物原有細胞之細胞受體，以防止該受體與該病原體所展示之配體結合。
根據本說明書揭示之特征，本發明提供一種方法，其包含提供有效量之抗DLVRl/ CLEC5A抗體給予受登革熱病毒感染之動物，其中該抗DLVR1/CLEC5A抗體能防止由登革熱 病毒顆粒所呈現之配體與DLVR1/CLEC5A受體結合，其中TNF-α之分泌可受到抑制。根據本說明書揭示之特征，本發明提供一種方法，其包含提供有效量之抗DLVRl/ CLEC5A抗體給予受日本腦脊髓炎病毒感染之動物，其中該抗DLVR1/CLEC5A抗體能防止由 日本腦脊髓炎病毒所呈現之配體與DLVR1/CLEC5A受體結合，其中TNF-α之分泌可受到抑 制。根據本說明書揭示之特征，本發明提供一種方法，其包含提供有效量之試劑給予 受登革熱病毒感染之動物，其中該試劑可至少部分抑制至少一種促發炎性細胞激素之分 泌，且不影響干擾素-a (Interferon-α )之分泌。根據本說明書揭示之特征，本發明提供一種小鼠，其包含易受登革熱病毒感染之 小鼠，以及sh-RNA顆粒以剔除該小鼠體內之DLVR1/CLEC5A受體。根據本說明書揭示之特征，本發明提供一種組合物，其包含醫藥制備物，包含有效 量之抗體，該抗體系抗動物體內至少一細胞受體，以調節該動物體內病原體感染之作用。該 調節至少包含抑制該動物細胞之促發炎性細胞激素的分泌，且不影響可造成病毒清除之細 胞激素的分泌。根據本說明書揭示之特征，本發明提供一種組合物，其包含醫藥制備物，包含有效 量之抗體，該抗體系對抗受登革熱病毒感染之動物之DLVR1/CLEC5A受體，以調節該動物體 內登革熱病毒感染之作用。該調節至少包含抑制該動物細胞之促發炎性細胞激素的分泌， 且不影響可造成病毒清除之細胞激素的分泌。


本專利或專利申請檔案含有至少一張以彩色制成之圖式。本專利或專利申請公開 案(含彩色圖式)之復印件將依請求及繳付必要費用后由智財局提供。本說明書揭示之上 述特征及目的將可在參照下列之敘述并結合附呈之圖式閱讀時更為明了，該等圖式中之類 似參照數目代表類似之組件，且其中圖IA顯示藉由RT-PCR擴增，然后在0.8%瓊脂糖上分成各部分及藉由溴化乙錠 染色而顯現之先天性免疫受體之DNA片段。圖IB為經表現之重組受體.Fc融合蛋白質在 12% SDS-PAGE凝膠上之電泳圖譜。圖2Α顯示固定于膜上之生物素化GLPS F3與綴合有辣根過氧化酶(HRP)之鏈霉 抗生物素接觸后之點漬圖。圖2Β顯示固定于膜上之生物素化GLPS F3與樹狀細胞凝集 素-1 (Dectin-I). Fc融合蛋白質接觸，繼而與綴合有HRP之山羊抗IgGl抗體一起培育后之 點漬圖。圖2C顯示圖2Β之吸漬圖之點密度分析。圖2D顯示競爭者β-葡聚糖對于樹狀 細胞凝集素-1. Fc融合蛋白質與固定于膜之GLPS F3之結合之點密度之影響。圖2Ε顯示 固定之GLPS F3與樹狀細胞凝集素-1 :Fc融合蛋白質接觸，繼而于存在各種量之競爭者多 醣體(β-葡聚糖、D-葡萄糖及D-半乳糖)下與綴合有HRP之山羊抗IgGl抗體一起培育 后之點漬圖。圖3顯示固定于膜之GLPS F3及GLPS F3C與27種不同的融合蛋白質接觸后之點 漬之半定量分析，其中該等融合蛋白質各包含所列之先天性免疫受體之細胞外區域且該細胞外區域與IgGl Fc偶合。圖4A顯示用圖3所列之27種融合蛋白質檢測固定于膜之GLPS F3及GLPS F3C之點漬圖。圖4B顯示EDTA對于樹狀細胞凝集素-I(Dectin-I). Fe、DC-SIGNR. Fe、 KCR. Fc及TLT-2. Fc與固定于膜之GLPS F3之結合之影響。圖4C顯示用樹狀細胞凝集 素-1 (Dectin-I) · Fc、DC_SIGNR. Fe,KCR. Fc及TLT-2. Fc融合蛋白質檢測固定于膜之β -葡 聚糖之點漬圖。圖5Α顯示用樹狀細胞凝集素-1. Fe、DC-SIGNR. Fe、KCR. Fc及TLT-2. Fc融合蛋白 質檢測多醣體樣品之點漬圖。圖5Β顯示樣品編號之名稱及以半定量形式提供圖5Α之點密度。圖6Α顯示包覆在微量滴定平皿上之生物素化GLPS-F3之量，其系使用過氧化 酶-抗生物素蛋白綴合物檢定分析法測量及在OD 450nm讀數，以檢測黃色反應產物。圖6B 系以圖之方式描述各種受體.Fc融合蛋白質對固定于于微量平皿上之GLPS-F3之親和性。 各受體.Fc融合蛋白質之絕對結合率記載在左側Y軸(以OD 450nm讀數表示)，以及右側 Y軸記載與樹狀細胞凝集素-1. Fc之結合率相較下之相對結合率。圖7系以圖說明在與為多醣體之甘露聚糖及β-葡聚糖，以及與為單醣之D-甘 露糖(Man)、D-葡萄糖(Glc)、N-乙酰基-葡萄糖胺(GlcNAc)、D-半乳糖(Gal)、N-乙酰 基-半乳糖胺(GalNAc)、L-巖藻糖(Fuc)及唾液酸之競爭性檢定分析中，各種受體.Fc融 合蛋白質與GLPS-F3之結合百分率。圖8A系以圖說明在與人類IgG陰性對照組相較下，受體.Fc融合蛋白質與登革熱 病毒之結合率。圖8B顯示登革熱病毒與三種受體.Fc融合蛋白質及人類IgG陰性對照組之 免疫復合物之西方轉漬圖，其中使用對抗登革熱病毒E蛋白質之抗體檢測。圖8C以圖顯示 EDTA抑制登革熱病毒與DC-SIGN. Fc融合蛋白質之結合，但不會抑制登革熱病毒與DVLR1. Fc融合蛋白質之結合。圖8D顯示DVLR1. Fc融合蛋白質與用PNGaseF、二硫蘇糖醇(DTT)、 熱或UV照射處理之登革熱病毒之結合率以及與未經處理之登革熱病毒(non)之結合率。圖9A顯示DVLRl在各種免疫細胞類型中之表現，其藉由使用抗-DVLRl抗體之流 動式細胞計量術測量。DVLRl之表現被示出，其中DVLRl之圖形輪廓(如虛線所示)與抗體 同種型(isotype)對照組(陰影區)不相符。圖9B顯示DC-SIGN在各種免疫細胞類型中 之表現，其藉由使用抗-DC-SIGN抗體之流式細胞計量術測量。DC-SIGN之表現被示出，其中 DC-SIGN曲線(虛線)與抗體同種型對照組(陰影區)不相符。圖IOA顯示在與活登革熱病毒或經UV照射之登革熱病毒(UV-DV)接觸之⑶14+ 巨噬細胞中NS3蛋白質表現之流式細胞計量分析(其中使用抗-NS3抗體)結果，并與匹配 之抗體同種型對照組(陰影區)比較。圖IOB圖示在以不同感染重復數(multiplicities of infection, MOI)之登革熱病毒感染之⑶14+巨噬細胞中或以經UV照射之登革熱病毒 感染之CD14+巨噬細胞中，細胞外登革熱病毒滴度之經時變化。圖IOC系說明在以不同感 染重復數(MOI)登革熱病毒感染之⑶14+巨噬細胞中全部DAP12及磷酰化DAP12之免疫轉 漬圖。圖IOD系說明用活登革熱病毒或經UV照射之登革熱病毒以MOI = 5感染后，于不同 時間在該等經登革熱病毒感染之CD14+巨噬細胞中所有DAP12及磷酰化DAP12之免疫轉漬 圖。圖11系例示說明用活登革熱病毒感染之前，藉由電穿孔導入pLL3. 7載體(對照組)或DVLRl-shRNA之⑶14+巨噬細胞中，所有DAP12及磷酰化DAP12之免疫轉漬圖。圖12A顯示用活登革熱病毒或經UV照射之登革熱病毒以指定之MOI感染⑶14+ 巨噬細胞后6小時，TNF-α之分泌。圖12Β顯示用活登革熱病毒或經UV照射之登革熱病 毒以指定之MOI感染⑶14+巨噬細胞后12小時，TNF-α之分泌。圖12C顯示⑶14+巨噬 細胞感染后TNF-α分泌隨時程之測量值。圖 13Α 顯示在 DC-SIGN-shRNA 或 DVLRl-shRNA、或者載體對照組(pWTSI 及 pLL3. 7) 轉染之⑶14+巨噬細胞中，藉由西方轉漬測得之DC-SIGN及DVLRl之表現。圖1 顯示在 用登革熱病毒染之前，藉由電穿孔導入DC-SIGN-shRNA、DVLRl-shRNA、或者pLL3. 7載體對 照組之⑶14+巨噬細胞中，NS3表現之流動式細胞計量分析(使用抗-NS3抗體)。陰影區 為NS3抗體之同種型對照組。圖13C系例示說明在用登革熱病毒感染之前(t = 0)，藉由電 穿孔導入DC-SIGN-shRNA、DVLRl-shRNA或載體對照組之CD14+巨噬細胞之上清液中病毒滴 度之時程分析。圖14A顯示用登革熱病毒感染之前(t = 0)，藉由電穿孔導入DC-SIGN-shRNA、 DVLRl-shRNA或載體對照組之⑶14+巨噬細胞中各種細胞激素之之分泌之時程分析。圖14B 顯示于相同條件下細胞激素IFN-α之時程分析。圖15顯示由感染有登革熱病毒且用對抗DVLRl之指定單株抗體以指定濃度治療 之⑶14+巨噬細胞分泌入培養上清液中之TNF- α之ELISA測量值。圖16a圖式說明各種受體.Fc融合蛋白對于登革熱病毒之結合。圖16b顯示登革 熱病毒與三種受體.Fc融合蛋白及一種人類IgG陰性控制組之免疫復合物的西方轉漬，以 對抗登革熱病毒E蛋白之抗體探測。圖16c圖標由EDTA可抑制登革熱病毒對DC-SIGN. Fc 融合蛋白之結合，但不會抑制對于DLVR1/CLEC5A融合蛋白之結合。圖16d顯示藉由添加 DC-SIGN. Fc及DLVR1/CLEC5A融合蛋白而產生登革熱病毒對人類細胞結合之增加。16e 圖示各種糖之添加可抑制登革熱病毒對DC-SIGN. Fc融合蛋白之結合。16f圖標PNGaseF對 于登革熱病毒對DLVR1/CLEC5A融合蛋白之結合的效應。圖17a說明DC-SIGN在人類PBMCs中之表現模式。圖17b說明DVLR1/CLEC5A在 人類PBMCs中之表現模式。圖Ife顯示免疫轉漬，其說明使用針對磷酰酪胺酸及DAP12之抗體，測定人類巨噬 細胞中之登革熱病毒誘導之DAP12磷酰化Qh p. i.)。圖18b顯示免疫轉漬，其說明由登革 熱病毒及經UV-失活之登革熱病毒誘導之DAP12磷酰化的動力學。圖18c顯示免疫轉漬， 其說明shRNAs使DVLR1/CLEC5A及DC-SIGN. Fc融合蛋白之表現下降(knock down)以及抑 制登革熱病毒(m. ο. i. = 5)-媒介之DAP12磷酰化的能力。圖18d顯示shRNAs對于巨噬 細胞中之登革熱病毒進入及復制的效應。圖18e顯示抗-DVLR1/CLEC5A mAb、抗-DC-SIGN mAb、及小鼠IgG對于非結構蛋白質NS3表現的效應。圖18f圖示說明shRNAs對于經感染 巨噬細胞之登革熱病毒滴度的效應之時程檢定分析。圖19a圖標說明巨噬細胞之登革熱病毒及經UV失活之登革熱病毒誘導性TNF-α 分泌的劑量-相關性。圖19b說明登革熱病毒感染(m. ο. i. = 5)后之TNF-α表現的動 力學。圖 19 圖示說明 DVLR1/CLEC5A 及 DC-SIGNshRNA 對于 TNF- α、IL-6、MIPl-α、IL-8、 IP-IO及INF-α自經登革熱病毒感染(m. o. i. = 5)之巨噬細胞分泌的效應。在圖19d圖 示說明以特異性shRNA對于登革熱病毒誘導性TNF-α及INF-α分泌之各種分泌途徑所進行之下降(knock down)實驗效應。圖19e圖示說明拮抗性抗_DVLRl/CLEC5AmAbs可抑制 反應登革熱病毒血清型1-4之TNF- α分泌。使用Μ. R. mAb (抗-甘露糖受體mAb，mlgGl) 及小鼠IgM(mlgM)作為陰性控制組。圖20a說明經登革熱病毒、登革熱病毒/抗-E、及登革熱病毒/抗-prM免疫復合 物感染之巨噬細胞的NS3表現。圖20b說明經DV2感染之巨噬細胞的TNF- α及INF- α分 泌量。圖20c說明經抗-prM/登革熱病毒及抗-E/登革熱病毒免疫復合物感染之巨噬細胞 的TNF-α及INF-α分泌量。圖21a圖示說明HMEC-I單層之通透性以及上清液中之TNF-α含量的時程分析。 圖21b圖示說明TNFR2. Fc及抗-DVLR1/CLEC5A對于內皮細胞單層通透化的抑制作用。圖2 圖標說明登革熱病毒與人類及小鼠DVLR1/CLEC5A. Fc融合蛋白的結合親和 力。圖22b顯示mDVLRl/CLEC5A在小鼠脾細胞中之表現。圖22c顯示mDVLRl/CLEC5A在小 鼠骨髓(BM)-衍生性巨噬細胞及小鼠似巨噬細胞RaW64. 7細胞系中之表現。圖23a圖標說明由登革熱病毒與小鼠巨噬細胞細胞系RaW64. 7及穩定表現人類 DC-SIGN之RaW64. 7細胞之結合所產生之TNF- α釋出比較。圖23b圖示說明在mAb之存 在下使穩定表現人類DC-SIGN之RaW64. 7細胞與DV2共同進行培育所產生之TNF- α分泌。 圖23c圖示說明抗-DVLR1/CLEC5A mAbs (3D2H6及10D7H;3)可以劑量-相關性之方式抑制 DV2-誘導之TNF-α釋出。圖 M 說明經 DV2/PL046 或 DV2/NGC-N 系挑戰之 STATl+ 小鼠的 Kaplan-Meier 存 活曲線。圖2 說明對抗小鼠DVLR1/CLEC5A培育之mAb 3D2H6及10D7H3對于經登革熱 病毒挑戰之STAT1+小鼠的皮下及腸道出血之效應。圖2 說明對抗DVLRl/CLEC5A之 mAb(3D2H6及10D7H3)對于經登革熱病毒挑戰之STATl+小鼠的血漿滲漏進入生命器官之 效應。圖25c圖示說明借著自器官萃取Evans藍顯示之生命器官血管通透性。圖25d說明 于有及無抗-DVLR1/CLEC5A mAbs或TNFR2. Fc存在下，經登革熱病毒挑戰之STATl+小鼠 之TNF-α及IP-10之血清含量以及病毒滴度。圖25e圖示說明在拮抗性抗-小鼠DVLRl/ CLEC5A mAbs或TNFR2. Fc存在下，經DV2挑戰之STATl缺陷小鼠的存活。圖沈說明DVLR1/CLEC5A涉及JEV媒介之DAP12磷酸化作用及自人類巨噬細胞之 TNF- α分泌。在圖26a中，分別以ELISA測定DVLR1/CLEC5A (1 μ g)與JEV及登革熱病毒 (DV) (5 X IO6PFU)之交互作用。DV與人類DVLR1/CLEC5A (長度188氨基酸)具交互作用，但 與可變剪接形式sDVLRl/CLEC5A(aa 43-65缺失)則否。相對的，JEV僅與sDVLRl/CLEC5A具 交互作用，但與全長DVLR1/CLEC5A則否。在圖26b中，登革熱病毒可在人類巨噬細胞中誘導 DAP12磷酸化作用(在p. i.)。以抗-DAP12mAb沈淀經DV感染之巨噬細胞中的DAP12， 在SDS-PAGE分離后將其轉漬至硝基纖維素膜上，接著再與對抗磷酰酪胺酸及DAP12之抗體 分別進行培育。JEV誘導之DAP12磷酸化作用(m. o. i. =5)由pLL3. 7/DVLR1/CLEC5A抑 制。在圖^c中，其顯示人類巨噬細胞反應JEV感染之TNF-α分泌的動力學(左)。JEV 誘導之TNF-α分泌由pLL3. 7/DVLR1/CLEC5A mAb抑制(右)。數據系以三次獨立試驗之平 均值士 s. d.表示。
具體實施例方式在下列本發明具體例之詳述中，其參照附呈之圖式閱讀時更為明了，其中類似之 參照數目代表類似之組件，且其中系以說明方式顯示可實施本發明之特定具體例。此等具 體例系以足夠之細節進行敘述，以使所屬技術領域的技術人員可據以實施本發明，且需明 了者，可使用其它具體例，且可在不偏離本發明范圍之情形下進行邏輯、機械、生物、電學、 功能、及其它之改變。下文之詳述因此不應被視為任何限制，而本發明之范圍僅由附呈之申 請專利范圍定義。在本文中，「或」一辭應可被理解為定義一種論理上之選言，且不應被視 為一種排他性選言，除非其被標示為「或不」(xor) —辭。在一具體例中，本發明提供一種融合蛋白質，其包含先天性免疫受體之碳水化合 物識別區域及異源多肽。先天性免疫受體意指1)由白血球受體復合物(LRC)中之基因及人類染色體19上之LRC-相關基因所編 碼之受體，其包括，但不限于CD66家族(CEACAM1及PSG1)、SIGLEC家族、NGK7、FCGRT、ILT/ LILRA/LILRB(CD8Q 家族、LAIR 家族、KIR(CD158)家族(包括 KIR2DL 亞家族、KIR2DS 亞家 族及 KIR3DL 亞家族)、FCAR (CD89)、NKp46 (NCRl)及 GPVI (GP6)；以及2)由在人類染色體12上之天然殺手受體復合物(NKC)中之基因所編碼之受體， 其包括，但非限于，MAFA-L (KLRGl)、A2M、NKR-PlA (KLRBl)、LLtl (CLEC2D)、CD69 (CLEC2C)、 KLRFl、AICL (CLEC2B)、CLEC-2 (CLECFS2)、Lox-I (OLRl)、CD94 (KLRDl)、NKG2-D (KLRKl)、 NKG2-F(KLRC4),NKG2-E(KLRC3)、NKG2_C(KLRC2)、NKG2_A(KLRCl) ,Ly49L(KLRAl)及 PRB3 ；以及3)所有人類及小鼠C-型凝集素(CLEC)家族基因、所有人類之類唾液酸結合性 Ig(SIGLEC)基因、所有人類之在骨髓細胞上表現之激發受體(TREM)基因、所有人類之類 TREM(TREML/TLT)基因、所有人類之類鐸受體(TLI )基因以及所有在人類染色體發現之人 類之類Fc受體(包括FCRLl至FCLR6，亦包括FCLRMl及FCLR1C)基因。使用人類基因組組織(Human Genome Organization, HUGO)搜索引擎網站可以查 到能應用于本發明方法中之此等分類中的其它基因。亦可參考Immunological Reviews 2001Vol. 181 :20-38中之基因座說明，該文全文以參考數據方式納入本文。來自非人類物種之任何上述基因之直系同源物(orthologues)亦可用于本發明 之方法中。可被考慮用于本發明之C-型凝集素基因包括，但不限于，下列人類基因ASGR1、 ASGR2 (CLEC4H2)、CD207 (CLEC4K/ 郎罕細胞特異性蛋白)、CD209 (DC-SIGN/CLEC4L)、 CD302 (CLEC13A)、CLECIA、CLEClB(CLEC-2)、CLEC2A、CLEC2B、CD69、CLEC2D、CLEC2L、CLEC3A、 CLEC3B、CLEC30、CLEC3Q、CLEC4A、CLEC4C、CLEC4D(CLEC-6)、CLEC4E、CLEC4F(KCLR)、CLEC4G、 CLEC4M(DC-SIGNR)、CD209、DLVR1/CLEC5A、CLEC6A(樹狀細胞凝集素-2)、CLEC7A(樹狀 細胞凝集素-1)、CLEC9A、CLEClOA, CLECl 1A、CLEC12A、CLEC14A、FCER2、KLRBl、KLRFl、 LY75 (DEC205)、MRCl、MRClLl、MRC2 (Endo 180)、OLRl、PLA2R1、DCALl 及 COLECIO0 此等 基因之任一者之同源物(homologues)亦在考慮之列，來自其它種動物諸如小鼠(mice) 及大鼠(rats)之直系同源物(orthologues)亦同。同源物(homologues)及直系同源 物(orthologues)與列舉之C-型凝集素(lectin)基因之任一者之相同性可為50 %、 70%,80%,80. 6%,83%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%, 99. 1%,99. 2%,99. 3%,99. 4%,99. 5%,99. 6%,99. 7%,99. 8%或 99. 9% 被特別考慮之直系同源物為小鼠中之庫佛氏(Kupffer)細胞受體(mKCR)基因(與人類CLEC4F同源)。被考慮用于本發明之TREM基因及TREML基因包括，但非限于，下列人類基因 類⑶300抗原家族成員B(⑶300LB)、類⑶300抗原家族成員G(⑶300LG)、TREMU TREM2、 TREMLl (TLTl)、TREML2 (TLT2)、TREML3 (TLT3)及 TREML4 (TLT4)。此等基因之任一者之同源 物亦在考慮之列，來自其它種動物諸如小鼠及大鼠之直系同源物亦同。同源及直系同源物 與此等列舉之TLR基因之任一者之相同性可為50%、70%、80%、80. 6%、83%、85%、90%、 91 %,92 %,93 %,94 %,95 %,96 %,97 %,98 %,99 %,99. 1 %,99. 2 %,99. 3 %,99. 4
99. 5 %,99. 6 %,99. 7 %,99. 8 %或99. 9 %。被特別考慮之直系同源物包括來自小鼠之 mTREMl、mTREM2、mTLTl 及 mTLT4。被考慮用于本發明之TLR基因包括，但不限于，下列人類基因TLR1、TLR2、TLR3、 TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、TLRlU TLR12 及 TLR13。此等基因之任一者 之同源物亦在考慮之列，來自其它種動物諸如小鼠及大鼠之直系同源物亦同。同源物及 直系同源物與所列舉之TLR基因之任一者之相同性可為50%、70%、80%、80.6%、83%、 85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%,99. 1 % ,99. 2 % ,99. 3 %, 99. 4%,99. 5%,99. 6%,99. 7%,99. 8%或 99. 9%。被考慮用于本發明之SIGLEC基因包括，但不限于，下列人類基因⑶22、⑶33、髓 鞘相關醣蛋白(MAG)、SIGLEC5、SIGLEC6、SIGLEC7、SIGLEC8、SIGLEC9、SIGLEC10、SIGLEC11、 SIGLEC12、SIGLEC13及唾液酸黏附素(SN)。此等基因之任一者之同源物亦在考慮之列，來 自其它種動物諸如小鼠及大鼠之直系同源物亦同。同源物及直系同源物與所列舉之SIGLEC 基因之任一者之相同性可為 50%,70%,80%,80. 6%,83%,85%,90%,91%,92%,93%, 94 %,95 %,96 %,97 %,98 %,99 %,99. 1 %,99. 2 %,99. 3 %,99. 4 %,99. 5 %,99. 6
99. 7%,99. 8%或 99. 9% 適用于本發明之其它先天性免疫受體包括在下述實施例中所記載者。融合蛋白質可包含先天性免疫受體之整個細胞外區域，該細胞外區域包括碳水化 合物識別區域；或者融合蛋白質可包含該細胞外區域之一部分，包括碳水化合物識別區域； 或者融合蛋白質可僅包含碳水化合物識別區域。異源多肽可包含能與先天性免疫受體之碳水化合物識別區域融合，以致該異源多 肽在活體內或試管中皆不會干擾碳水化合物區域與其同系(cognate)特異性碳水化合物 之結合之任何多肽。異源多肽較佳為免疫球蛋白，諸如人類IgGl、IgGh、IgG2b、IgG3、IgG4、 IgM、IgE、IgD、IgAa&IgA2或者來自其它種動物之免疫球蛋白。較佳以免疫球蛋白之片段， 例如IgG之Fc片段，做為異源多肽。在較佳之具體例中，該異源多肽為不會與人類Fc受體 結合之免疫球蛋白變型。該等變型在本技術中已為熟知。舉例言之，可使用包含下列突變 之人類 IgGl Fc 變型L234A、L235E, G237A 及 P331S。該異源多肽尚可包含一個或一個以上允許融合多肽固定在固體支撐物上或從復 合物混合物中純化之功能區域。舉例言之，該異源多肽可包含His6tag以允許融合蛋白質 依照本技術中所熟知之方法附接在Ni-NTA固體支撐物上。再舉例言之，該異源多肽可包含 麩胱甘肽-S-轉移酶(glutathione-S-transferase)區域，以致生成之融合蛋白質可吸附 在，例如，麩胱甘肽珠粒或由麩胱甘肽衍生之微量滴定平皿中。該異源多肽亦可包含一分子或一分子以上之生物素或生物素衍生物。以此方式，融合蛋白質可固定在綴合有鏈霉抗生物素蛋白之固體支撐物上，或者可使綴合有鏈霉抗生 物素蛋白之酶與融合蛋白質結合。 融合蛋白質視需要在異源多肽與先天性免疫受體之碳水化合物識別區域之間復 可包含連結子(linker)。該連結子可為肽類連結子，或者其可為非肽類連結子，諸如聚乙二在融合蛋白質中，碳水化合物識別區域可為相對于異源多肽之C-端或者可為相 對于異源多肽之N-端。本發明之融合蛋白質可藉由蛋白質制造技術中已知之任何方法制備。融合蛋白 質較佳使用本技術熟知之重組DNA技術及蛋白質表現技術制備。舉例言之，編碼先天性免 疫受體之碳水化合物識別區域之DNA，可藉由使用對該特定目標先天性免疫受體之碳水化 合物識別區域具特異性之引物進行mRNA之反錄酶PCR(RT-PCR)而制備。然后可將生成之 DNA，連同編碼異源多肽序列之DNA，以可譯讀之方式選殖入表現載體中。本發明所使用之表 現載體典型地含有復制源、位于5’端(即其上游)之啟動子、并接續編碼融合蛋白質之DNA 序列、轉錄終止序列及剩余之載體。該等表現載體亦可包括本技術已知之其它DNA序列，例 如提供表現產物安定性之安定性前導序列、提供表現產物之分泌之分泌前導序列以及允許 調節或誘發融合蛋白質表現之序列。表現載體亦可含有允許使用病毒表現系統，諸如本技 術熟知之桿狀病毒(baculovirus)表現系統，來表現融合蛋白質之病毒序列。可將表現載 體引進宿主細胞，諸如微生物細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞或昆蟲細胞。可將表現載體以 裸DNA之形式引進細胞中，或者其可被包封在病毒(諸如桿狀病毒)中。可將表現載體保 持在宿主細胞內，或者將表現載體整合入宿主細胞基因組中。表現載體較佳包含能使分泌前導序列加至融合蛋白質上之DNA序列，藉此使得融 合蛋白質分泌至環繞宿主細胞之培養基中。然后可用本技術已知之技術將融合蛋白質從培 養基中純化。舉例言之，若融合蛋白質包含IgG以做為異源多肽，則蛋白質A管柱可用于結 合融合蛋白質，以允許融合蛋白質與周圍培養基中之其它蛋白質分離。融合蛋白質亦可藉由使用試管內表現系統諸如爪蟾卵母細胞表現系統，在試管中 轉譯編碼融合蛋白質之mRNA而制造。在一具體例中，融合蛋白質系分開制造，然后使用本技術已知之化學技術將該等 偶合在一起。舉例言之，可將碳水化合物識別區域及異源多肽分開制造，然后藉由使用戊二 醛而將彼此偶合。制造融合蛋白質之后，融合蛋白質可用可檢測之標記諸如熒光物質、放射線標記、 酶、酶受質、染劑、化學發光劑、磁珠、量子點或其它任何能直接或間接產生可檢測信號之部 分予以標幟。本技術已知許多使此等可檢測標記與蛋白質綴合之方法。舉例言之，可將經 N-羥基琥珀酰亞胺活化之染料，最佳為經N-羥基琥珀酰亞胺活化之熒光物質，藉由與融合 蛋白質上之一級胺反應而與融合蛋白質綴合。在一些具體例中，使用本技術已知之方法將融合蛋白質生物素化，以致該融合蛋 白質包含一個或多個生物素分子，或者一個或多個生物素衍生物分子。藉此方式，該融合蛋 白質可附接于鏈霉抗生物素蛋白可檢測部分綴合物，諸如酶-鏈霉抗生物素蛋白綴合物。在一系列之具體例中，本發明之融合蛋白質可被用于測定在包含多醣體之組合物 中是否存在特異性碳水化合物成分。該方法涉及使多醣體與能和多醣體之特異性碳水化合物成分結合之融合蛋白質接觸，然后測定融合蛋白質是否與組合物中之多醣體結合。舉例 言之，已知CLEC7A (亦稱為樹狀細胞凝集素-1)之碳水化合物識別區域可與β-1，3- -葡 聚糖交互作用(參見 Brown，G. D. and Gordon, S.，2001，Nature 413，36-7，該文獻全文以 參考數據方式納入本文)。所以包含CLEC7A之碳水化合物識別區域之融合蛋白質結合至 多醣體組合物表示該多醣體組合物包含β-1，3-D-葡聚糖。同樣地，既然嚿齒動物之庫佛 氏(Kupffer)細胞受體(KCR ；與人類CLEC4F同源)對于D-半乳糖及N-乙酰基半乳糖胺 具有高親和性，并能從血清中清除以D-半乳糖及D-巖藻糖為終端之醣蛋白(參見i^adden， A.J.，Holt, O.J. and Drickamer，K. (2003) ；Glycobiology 13，529-37，該文獻全文以參考 數據方式納入本文)，包含KCR之碳水化合物識別區域之融合蛋白質結合至多醣體組合物 表示該多醣體組合物包含D-半乳糖或N-乙酰基半乳糖胺或以D-半乳糖為終端之醣蛋白 或以D-巖藻糖為終端之醣蛋白。此外，CD209(亦稱為DC-SIGN及CLEC4L)以及CLEC4M (亦 稱為DC-SIGNR及L-SIGN)皆可結合至Man9GlcNAc2Asn醣肽，但只有CD209可結合至具有 終端巖藻糖殘基之聚糖，而CLEC4M則否(參見Guo et al (2004)Nat Struct Mol BiollU 591-8)；所以CD209及CLEC4M之融合蛋白質可區分包含此等碳水化合物成分之多醣體組合 物。所以本發明之方法及試劑可用于鑒定多醣體組合物之碳水化合物成分以及此等碳水化 合物成分之相對量，例如，以「指紋辨識(fingerprint)」多醣體組合物之獨特細微特征。舉 例言之，本發明之方法及試劑可用于測定具有免疫調節活性之多醣體組合物之碳水化合物 成分。此外，若已知表現融合蛋白質之碳水化合物識別區域所來自之先天性免疫受體之 細胞為何種類別，則本發明之檢定分析(assay)將能顯示在身體內與所探討之多醣體結合 之細胞之類別。該知識，例如，有助于揭示特定多醣體組合物(諸如單離自靈芝之多醣體) 對于與該多醣體接觸之生物施予有利或有害作用之機制。在該具體例中，非必須知道該碳 水化合物識別區域所結合之碳水化合物成分之類別。本發明之融合蛋白質與其同系(cognate)碳水化合物成分之結合，可藉由將包含 多醣體之組合物固定于固體支撐物，然后使該固體支撐物與融合蛋白質接觸而進行。融合 蛋白質之結合可藉由檢測在固體支撐物之表面是否存在融合蛋白質，例如，藉由檢測固體 支撐物之表面是否存在異源多肽或檢測固體支撐物之表面是否存在碳水化合物識別區域 而檢測。例如，若異源多肽與熒光物質綴合，則沖洗后固體支撐物之表面存在熒光物質表示 融合蛋白質存在，其最終表示存在包含由融合蛋白質之碳水化合物識別區域所識別之特異 性碳水化合物成分之多醣體。在本文中，「固體支撐物」被界定為分子可經由共價鍵或非共價鍵附接之任何表 面。該固體支撐物包括，但不限于，膜(例如，聚偏二氟乙烯(PVDF)膜)、塑料(例如微量滴 定平皿)、順磁珠(paramagnetic beads)、帶電紙、尼龍、Langmuir-Bodgett薄膜、官能化玻 璃、鍺、硅、PTFE、聚苯乙烯、砷化鎵、金及銀。在本技術中任何已知之在表面能納入胺基、羧 基、硫醇基或羥基之其它材料亦可列入考慮。此包括具有任何拓樸結構之表面，該拓樸結構 包括，但不限于，球表面、有溝槽表面及圓柱形表面，例如管柱。包含多醣體之組合物(在本文中亦稱為多醣體組合物)可非限定地為包括多醣體 之任何組合物，該多醣體包括，例如，醣蛋白(包括蛋白多醣(proteoglycan))、醣脂質、肽 醣(peptidoglycan)、微生物細胞壁、病毒粒子及真菌細胞壁。在其它具體例中，包含多醣體之組合物為在溶液中之游離多醣體，例如未附接于蛋白質或脂質之多醣體。在本文中，「多 醣體」意指包含2個或2個以上單醣之碳水化合物分子。包含多醣體之組合物在固體支撐物上之固定化例如可藉由將組合物中之多醣體 生物素化，然后將其固定在綴合有鏈霉抗生物素蛋白之固體支撐物上而達成。此外，可將多 醣體固定在，例如，經甲醇活化之PVDF膜上。尤被列入考慮者為以「轉漬」之方式進行本發 明之方法，其中使用固定在PVDF膜上之多醣體點。在一些具體例中，融合蛋白質與固定之多醣體之結合可藉由下法檢測使第二試 劑(secondary reagent)結合至融合蛋白質，較佳結合至異源多肽，繼而檢測第二試劑之存 在。舉例言之，可將生物素化融合蛋白質附接于綴合有鏈霉抗生物素蛋白之酶，并藉由加入 能得到可檢測產物之受質來檢測酶之存在。未生物素化之融合蛋白質可用例如可結合至異 源多肽之抗體(若異源多肽為IgG或IgG Fe，則抗體為諸如抗-IgG抗體)而檢測，其中二 次抗體與酶綴合。舉例言之，若酶為辣根過氧化酶(HRP)，則融合蛋白質結合之檢測可用本 技術已知之加強化學發光(ECL)技術進行。可將第二試劑復綴合至或改為綴合至可檢測標 記，諸如熒光物質或放射性核。在本技術中尚知道許多可用于檢測所揭示之融合蛋白質與 固體支撐物之結合之其它技術。尤被考慮者為上述檢定分析可以多任務化數組模式進行。例如固體支撐物可被分 隔成復數個空間上分離之地址，在該等地址上可結合有多個不同的組合物。然后將該固體 支撐物與融合蛋白質接觸并檢測該融合蛋白質之結合。以此方式可以測定被固定之多醣體 組合物中何者(若有)包含可與融合蛋白質之碳水化合物識別區域結合之特異性碳水化合 物成分。在另一具體例中，單一組合物被固定在固體支撐物上，該固體支撐物被分隔成復 數個在空間上分離之地址。各地址然后與不同的融合蛋白質接觸，各不同的融合蛋白質包 含不同的碳水化合物識別區域。沖洗以移除非特異性結合之材料后，然后可如上述檢測融 合蛋白質之結合檢測到之各結合反應之空間地址揭示所結合之融合蛋白質之類別。以此 方式，可同時使用許多不同的融合蛋白質檢測組合物。在該具體例中，各融合蛋白質可包含 相同的異源多肽，藉此允許使用單一第二試劑同時檢測在各地址之結合。例如，若各融合蛋 白質包含IgG Fc以做為異源多肽，則可使用抗-IgG抗體或蛋白質A或蛋白質G檢測融合 蛋白質之結合。本發明之融合蛋白質及方法可用于「指紋辨識(fingerprint)」任何包含多醣 體之組合物之獨特細微特征，該等組合物包括，但不限于得自草藥制劑之多醣體組合物， 諸如單離自真菌靈芝(Ganoderma lucidim)、冬蟲夏草(Cordyc^ps sinensis)及蘑菇 (Lentinus edodes)以及得自植物霍山石斛(Dendrobium huoshanense)之含多醣體部 分。特定而言，尤被考慮者為使用本文所述之方法測定靈芝多醣體之F3多醣體部分之碳水 化合物成分(參見 Wang，et al (2002) Bioorg Med Chem 10,1057-62 ；Chen, et al (2004) Bioorg Med Chem 12，5595-601 ；Chien, et al (2004) Bioorg Med Chem 12，5603-9.；以及 Hsu et al(2004)J Immunol 173，5989-99，各文獻全文以參考數據方式納入本文)。本文提供之方法可被用于指紋辨識復合物混合物之獨特細微特征，該復合物混合 物包括許多不同的多醣體組合物，或者可用于只含單一多醣體種類，例如單一醣蛋白或單 一多醣體之制劑。
若已知表現碳水化合物識別區域所來自之先天性免疫受體之細胞之類別，則上述 檢定分析將可揭示當將多醣體組合物引進體內時，體內會與多醣體結合之細胞。然后亦可 能得到調節所鑒定之先天性免疫受體之活性之藥劑。例如，若先天性免疫受體與多醣體之 交互作用在體內造成有益之作用，則可以制造擬似該多醣體之結構或加強該多醣體與該先 天性免疫受體間之交互作用之藥劑。參見下文以「調節劑」為標題之段落。在另一系列具體例中，本發明之方法及融合蛋白質被用于測定在病原體表面展示 之多醣體之類別(identity)，該等病原體諸如真菌細胞、細菌細胞或病毒(諸如具套膜病 毒；且病毒亦非限定性地包括來自黃熱病毒科之病毒)。適用于本發明方法之黃熱病毒科 病毒非限定性地包括黃熱病毒屬成員(諸如登革熱病毒(DV)、西尼羅熱病毒(WNV)、日本腦 脊髓炎病毒(JEV)、黃熱病毒(YFV)及蜱傳腦脊髓炎病毒)或肝炎病毒屬成員(諸如C型 肝炎病毒)。在一該具體例中，將融合蛋白質固定在固體支撐物上(例如若異源多肽為IgG 或其片段，則使用由蛋白質A所衍生之固體支撐物)，然后使固體支撐物與包含所探究病原 體之組合物接觸。沖洗后，使用例如第二試劑檢測病原體之結合，該第二試劑可以不會與融 合蛋白質之結合競爭之方式，與病原體特異性地結合。舉例言之，可使用對病原體具特異性 之二次抗體。然后第二試劑之結合可如上述檢測(例如使用綴合有HRP之二次抗體)或者 使用與第二試劑結合之第三試劑進行檢測(舉例言之，若第二試劑為抗-病原體IgG，則使 用與HRP綴合之抗-IgG抗體)。若檢測到二次試劑之結合，其顯示該病原體包含多醣體且 該多醣體包含融合蛋白質之碳水化合物識別區域所識別之特異性碳水化合物成分。或者，該檢定分析可藉由將與病原體特異性結合之試劑固定在固體支撐物上而進 行。例如將可與病原體結合之抗體固定在固體支撐物上，繼而與包含病原體之組合物接觸。 然后使固體支撐物與融合蛋白質接觸，并如上述檢測融合蛋白質之結合(該融合蛋白質較 佳不會和病原體競爭與固定試劑之結合)。舉例言之，若融合蛋白質之異源多肽為IgG Fe, 則抗-IgG抗體可檢測融合蛋白質與病原體之結合；或者若融合蛋白質與可檢測之標記綴 合，則該標記之檢測被用于檢測結合。被經常列入考慮者為上述病原體檢定分析，例如同時使用復數種不同的融合蛋白 質以多重方式進行。舉例言之，將可與病原體結合之抗體固定在固體支撐物上之復數個分 開的地址；然后使固體支撐物與包含病原體之組合物接觸；接著使各特異性地址與不同的 融合蛋白質接觸，各不同的融合蛋白質包含不同的碳水化合物識別區域。若各融合蛋白質 包含相同的異源多肽，則融合蛋白質之結合可用能與異源多肽結合之單一試劑檢測。舉例 言之，若異源多肽為IgG Fe，則抗-IgG抗體可被用于檢測融合蛋白質之結合。各結合反應 之空間地址即可揭示出融合蛋白質之種類。或者，可使用固定在固體支撐物之空間分離地 址上之復數種不同融合蛋白質進行多重檢定分析，其中使固體支撐物與包含病原體之組合 物接觸，繼而使固體支撐物與能和病原體特異性結合之第二試劑接觸。舉例言之，若病原體 為登革熱病毒，則第二試劑可為對抗E套膜蛋白質之抗體。如在上述所有檢定分析中者，可 進行沖洗以從固體支撐物移除非特異性結合之物質。使用本文揭示之方法時，已發現登革熱病毒會與⑶14+巨噬細胞表面上之DVLRl/ CLEC5A結合。參見實施例11。再者，已證明DVLR1/CLEC5A結合于登革熱病毒造成DAP12之 活化，其最終導致促發炎性細胞激素TNF-α、MIP-I α、IFN-α及IL_8從巨噬細胞之釋放。 參見實施例12。此等細胞激素之釋放參與出血性登革熱(DHF)及登革熱休克癥候群(DSS)之發展。根據本文揭示方法之具體例，其已明確顯示DVLR1/CLEC5A可與登革熱病毒作用。 參見實施例16-18。此外，其顯示DVLR1/CLEC5A可調節DAP12之磷酸化作用，咸信該磷酸化 作用可至少部分調節諸如TNF-α之促發炎性細胞激素的釋出。參見實施例18。當經登革 熱病毒感染之細胞中的DVLR1/CLEC5A表現下降(knock down)時，DAP12之磷酸化作用會降 低，且包括TNF-α之促發炎性細胞激素之分泌會減少，同時并不會影響諸如干擾素-α之 負責進行病毒清除之細胞激素的分泌。參見實施例18-19。根據具體例，DVLR1/CLEC5A之 下降(knock down)可使用習知之RNA-干擾技術完成，包括si-RNA及sh-RNA兩者之使用。 參見實施例18-19。對于會與病原體交互作用之先天性免疫受體之類別(identity)之認知，繼而可 被用于開發能調節先天性免疫受體之活性之藥劑。例如，可以獲取能活化所鑒定出之先天 免疫性受體之調節劑，以加強對于特定病原體之免疫反應。若先天性免疫受體與特定多醣 體組合物之交互作用對于身體有害(例如當病原體引起過度發炎時)，則可獲取能降低先 天性免疫受體之活性之調節劑。例如可使用能封阻病原體結合于先天性免疫受體之藥劑 (諸如抗體)，以防止該病原體感染所造成之不期望促發炎反應之發生。同樣地，若本發明 之篩選方法揭示特定病原體(諸如病毒)利用先天性免疫受體而獲取進入細胞之管道，則 封阻該病原體結合于先天性免疫受體之藥劑將會防止病原體進入細胞。根據本文揭示方法之具體例，其顯示投與能夠減少可用DVLR1/CLEC5A結合位點 之干擾藥劑可增加經登革熱病毒感染小鼠之存活率。根據具體例，其顯示投與能夠干擾 DVLR1/CLEC5A與DVLR1/CLEC5A配體結合之DVLR1/CLEC5A抗體可增加小鼠之存活率。參見 實施例25。在另一系列具體例中，本發明之融合蛋白質被用于干擾或防止多醣體與細胞表面 上之先天性免疫受體間之交互作用。在該系列之具體例中，融合蛋白質包含在細胞表面上 表現之先天性免疫受體之碳水化合物識別區域。然后使該表現先天性免疫受體之細胞與 融合蛋白質在活體內或試管中接觸，藉此融合蛋白質和多醣體競爭與先天性免疫受體之結果 O若多醣體與細胞表面上之先天性免疫受體間之交互作用對于生物產生有害的作 用，可將治療有效量之融合蛋白質以醫藥組合物之形式投與至生物，以防止或減輕該交互 作用。所投與之融合蛋白質之異源多肽較佳不會與任何細胞表面受體結合。例如，異源多 肽可包含IgG Fc之突變型，該突變型不會與細胞表面上之Fc受體結合。純化在另一系列具體例中，融合蛋白質被用于至少部分純化或單離包含融合蛋白質之 碳水化合物識別區域所識別之特異性碳水化合物成分之多醣體。舉例言之，可將融合蛋白 質固定在固體支撐物上，并使疑似含有或已知含有多醣體組合物之組合物與固體支撐物接 觸。若該組合物包含可與融合蛋白質之碳水化合物識別區域結合之多醣體，則該多醣體會 與融合蛋白質結合。然后可沖洗固體支撐物以移除組合物之非特異性結合成分，而結合之 多醣體可藉由解開與融合蛋白質之交互作用而溶析，然后將其收集。舉例言之，若融合蛋白 質包含凝集素受體之碳水化合物識別區域，則可使用EDTA螯合Ca2+以解開交互作用。以此 方式，可以從復合物混合物純化出特異性多醣體組合物。在較佳具體例中，其使用該方法純化單離自靈芝之多醣體。就上述純化方法而言，該固體支撐物可包含例如結合有融合蛋白質之管柱。適當 的管柱包括瓊脂糖(kpharose)蛋白質A管柱，其中包含IgG以做為異源多肽之融合蛋白 質可經由融合蛋白質之IgG區域與蛋白質A之交互作用而結合在該管柱上。或者，可以經 CNBr活化之管柱介質而與融合蛋白質結合。本發明亦提供可用于上述方法之任一者之套組。在一具體例中，套組包含本發明 之融合蛋白質，其裝在一個或多個容器中。該套組亦可包含第二試劑，諸如與融合蛋白質 之異源多肽區域特異性結合之抗體，舉例言之，若異源多肽為IgG或其片段，該第二試劑為 抗-IgG抗體。該套組亦可包含檢測融合蛋白質與多醣體結合用之試劑及緩沖液。例如， 在使用綴合有HRP之二次抗體檢測融合蛋白質與多醣體之結合之具體例中，該套組可包含 建立增強之化學發光反應所需之試劑，例如一個或一個以上容器包含魯米諾(Iuminol)、 對-香豆酸(p-coumaric acid)、Tris緩沖液及過氧化氫。該套組亦可包含一個或一個以 上陽性對照多醣體。該套組亦可包含一個或一個以上用于上述方法之固體支撐物，例如，一 個或一個以上PVDF膜或者一個或一個以上多孔微量滴定平皿。調節劑如上述，本發明之方法鑒定出會與特定多醣體交互作用之先天性免疫受體。該等 數據使吾等得以得到所鑒定出之先天性免疫受體之調節劑。調節劑可為先天性免疫受體之 催動劑、拮抗劑(包括競爭性或非競爭性拮抗劑)或逆向催動劑。調節劑可(但非限于此) 抑制多醣體與先天性免疫受體之結合；加強多醣體與先天性免疫受體之結合；或者做為可 與先天性免疫受體結合之多醣體之擬似劑，藉此甚至在缺乏多醣體時亦可活化先天性免疫 受體。先天性免疫受體之調節劑包括抗體。舉例言之，對抗先天性免疫受體之拮抗性抗 體可防止病原體與先天性免疫受體之結合。在一些情況，該抗體為中和抗體，因其會防止 病原體進入表現該先天性免疫受體之細胞。或者，催動性抗體可做為對于細胞施予有益作 用之多醣體組合物之擬似物。拮抗性抗體與先天性免疫受體之結合方式亦可封阻受體于病 原體結合時所進行之下游信號傳導。抗體可為(但非限于此)多株抗體、單株抗體、單價 抗體、雙特異性抗體、雜綴合型抗體、多特異性抗體、人類抗體、人型化抗體或嵌合抗體；單 鏈抗體；Fab片段、F(ab')片段、由Fab表現庫產生之片段；抗基因型(anti-idiotypic， anti-Id)抗體；以及上述抗體之任一種之抗原決定部位-結合性片段。本文所用之術語「抗 體」系指免疫球蛋白分子及免疫球蛋白分子之免疫活性部分，亦即含有可與抗原免疫特異 性地結合之抗原結合部位之分子。該免疫球蛋白分子可為免疫球蛋白分子之任何類型(例 如 IgG、IgE、IgM、IgD、IgA 及 IgY)、類別(例如、IgGU IgG2、IgG3、IgG4、IgAl 及 IgA2)或 亞類。再者，術語「抗體」(Ab)或「單株抗體」(Mab)意欲包括完整的分子以及能與蛋白質 特異性地結合之抗體片段(諸如Fab及F(ab' )2片段)。Fab及F(ab‘ )2片段缺乏完整 抗體之Fc片段，因而可較快速地從動物或植物之循環清除，且其與完整的抗體相較，具有 較少的非特異性組織結合性(Wahl et al.、J. Nucl. Med. 24 :316-325 (1983))。制造抗體催 動劑之方法例如記載于PCT公開號WO 96/40281 ；美國專利第5，811，097號；Deng et al.， Blood 92(6) :1981-1988(1998) ；Chen et al.，Cancer Res. 58(16) :3668-3678(1998)； Harrop et al.，J. Immunol. 161(4) :1786-1794(1998) ；Zhu et al.，Cancer Res. 58(15)3209-3214(1998) ；Yoon et al. , J. Immunol. 160(7) :3170-3179(1998) ；Prat et al., J. Cell. Sci. Ill (Pt2) :237-247(1998) ；Pitard et al. , J. Immunol. Methods 205(2) 177-190 (1997) ；Liautard et al. > Cytokine 9 (4) :233-241 (1997) ；Carlson et al. , J. Biol. Chem. 272 (17) :11295-11301 (1997) ；Taryman et al. , Neuron 14(4) 755-762(1995) ；Muller et al.，Structure 6(9) :1153-1167(1998) ；Bartunek et al.， Cytokine 8(1) 14-20(1996) ；Harlow et al. , Antibodies :A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press,2nd ed. 1988) ；Hammerling, et al. , in :Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier，N. Y.，1981)(所有文獻全文以參 考數據之方式納入本文)。本發明提供可在DV感染后防止TNF- α從巨噬細胞釋出之抗-DVLR1/CLEC5A單株 抗體之非限定特異性實施例。參見實施例15。此等抗體可用于本文所指定之醫藥組合物及 治療方法，尤其是用于治療或預防人類DV感染之組合物及方法。本發明亦提供可在DV或JEV感染后防止TNF-α從巨噬細胞釋出之人型化 抗-DVLR1/CLEC5A抗體。參見實施例20-26。在特定具體例中，該人型化抗體系選自由人型 化抗體9B12、3E12A2、3E12C1、3E12G9、及8H8F5所組成之群。此等抗體可用于本文所指定之 醫藥組合物及治療方法，尤其是用于治療或預防人類DV感染之組合物及方法。特定之治療 包括抑制DV-誘發性血漿滲漏以及皮下及生命器官(vital organ)出血。該等人型化抗體 可作為DV-誘發性出血休克及敗血癥之治療方法。尤被考慮者，本文所述有關由病毒所造 成之細胞激素刺激減輕可應用于所有可結合并調節細胞之刺激性受體的病毒。再者，病毒之發現及治療原則可以類似方式延伸至細胞侵入受體以及細菌、真菌、 及寄生物之作用。本發明之方法將可使一般精于本技術者能夠判斷病原體之結合特性(亦 即，其與何種受體結合)，判斷與該受體之結合具有何種作用，并提供諸如抗體之干擾劑以 干擾病原體結合目標受體之能力。根據具體例，藉由融合小鼠脾細胞及NSl骨髓配對細胞而產生之單株抗體(mAbs) 抗-DVLR1/CLEC5A mAb可以噬菌體展示技術產生，以產生單鏈人類抗_人類DVLR1/CLEC5A mAbs。催動性及拮抗性mAbs可根據實例19-25所揭示之篩選方法而選擇。為降低現有小鼠抗-人類DVLR1/CLEC5A mAbs之抗原性，根據具體例，以人類免疫 球蛋白Gl (IgGl)取代野生型Fc部分。為進一步廢除Fc與Fc受體之結合并防止補體活化， 可使用人類IgGl之突變Fc片段(L234A、L235E、G237A、及P331Q取代野生型Fc部分以產 生人型化mAbs。為進一步降低抗原性，可以人類序列取代抗體V區域之框架區域。先天性免疫受體之調節劑亦包括由高通量篩選方法所鑒定出之小分子。該高通量 篩選方法典型地提供含有大量潛在治療化合物(例如配體或調節劑化合物)之組合化學品 或肽庫。然后在一個或一個以上檢定分析中篩選該等組合化學品庫或配位體庫，以鑒定出 此等可與所探究之先天性免疫受體結合之庫成員(例如特定的化學品種類或亞類)。如此 鑒定出之化合物可做為習知之引導化合物(lead compound)，或者本身可做為潛在的或實 際的治療劑。組合化學品庫為藉由化學合成或生物合成，或者藉由組合許多化學建構基塊(即 試劑，諸如氨基酸)所產生之在化學上分歧之化合物之集合物。舉例言之，線性組合庫，例 如多肽或肽庫，藉由以對既定化合物長度(即在多肽或肽化合物中氨基酸之數目)而言每種可能的方式，組合一套化學建構基塊而形成。數以百萬計之化合物可經由組混化學建構 基塊而合成。組合化學品庫之制備及篩選為精于相關技術者所熟知。該組合庫包括，但非限于 肽庫(例如美國專利第 5，010，175 號；Furka, 1991，Int. J. Pept. Prot. Res. ,37,487-493 ； 以及Houghton et al. ,991, Nature, 354 :84-88) 亦可使用其它產生化學上分歧之化學 品庫之化學方法。化學上分歧之化學品庫之化學類別之非限定性例子包括肽(PCT公開 號TO 91/019735)，經編碼之肽(PCT公開號WO 93/20242)，隨機生物寡聚物(PCT公開號 W092/00091)，苯并二吖呼類(benzodiazepines)(美國專利第5，288，514號)，分歧異構 物(diversomers)諸如海因類(hydantoins)、苯并二呼類(benzodiaz印ines)及二肽類 (Hobbs et al.，1993，Proc. Natl. Acad. ki. USA，90 :6909-6913)，類乙烯多肽(Hagihara et al.，1992，J. Amer. Chem. Soc.，114 :6568)，具葡萄糖框架(glucose scaffolding)之 非肽類擬肽(Hirschmann et al.，1992，J. Amer. Chem. Soc.，114 :9217-9218)，小型化合 物庫(Chen et al.，1994，J. Amer. Chem. Soc.，116 J661)，寡聚胺基甲酸酯(Cho et al.， 1993，Science，261 :1303)，及 / 或膦酸肽酯(Campbell et al. , 1994, J. Org. Chem. ,59 658)之類似有機合成，核酸庫(例如參見美國專利第5，270，163號，其述及核酸配體(亦 稱為“aptamers”)之產生)，肽-核酸庫(美國專利第5，539，083號)，抗體庫(例如 Vaughn et al. ,1996, Nature Biotechnology,14(3) :309-314)及 PCT/US96/10287)， 碳水化合物庫(例如參見Liang et al.，1996，Science，274-1520-1522)及美國專利第 5，593，853 號)，小型有機分子庫(例如，苯并二呼類，Baum C&EN, Jan. 18，1993，page 33 ； 以及美國專利第5，288, 514號；類異戊二烯類，美國專利第5，569，588號；噻唑啶酮類 (thiazolidinones)及間全氫噻口井酮類(metathiazanones)，美國專利第 5，549，974 號； 吡咯啶類(pyrrolidines)，美國專利第5，525，735號及第5，519，134號；嗎啉類化合物，美 國專利第5，506，337號；以及類似者)。制備組合庫之裝置可從市面購得(例如;357MPS，390MPS，Advanced Chem Tech, Louisville Ky. ；Symphony, Rainin, Woburn, Mass. ；433 AApplied Biosystems, Foster City,Calif. ；9050Plus,Millipore,Bedford,Mass.) 此外，許多組合庫可從市面購得(例 如，ComGenex, Princeton, N. J. ；Asinex, Moscow, Russia ；Tripos, Inc. , St. Louis, Mo.； ChemStar, Ltd. , Moscow, Russia ；3D Pharmaceuticals, Exton, Pa. ；Martek Biosciences, Columbia, Md.，以及類似者)。醫藥組合物本發明亦提供醫藥組合物。在一些具體例中，醫藥組合物包含本發明之融合蛋白 質。在其它具體例中，醫藥組合物包含先天性免疫受體之調節劑(例如對抗先天性免疫受 體諸如DVLR1/CLEC5A之抗體，包括實施例15所例示之抗體)。在該等醫藥組合物中，融合 蛋白質或先天性免疫受體調節劑構成「活性化合物」。在一些具體例中，其將醫藥組合物投 與至病患，以治療或預防以多醣體結合至病患細胞表面之先天性免疫受體為特征之疾病或 失調。在其它具體例中，其系于增加先天性免疫受體之活性對于病患有幫助之情況，將該等 醫藥組合物投與至病患以活化該先天性免疫受體。在另一些具體例中，其將醫藥組合物投 與至病患，以加強多醣體組合物與先天性免疫受體之結合。醫藥組合物除了包含活性化合物之外，較佳復包含至少一種醫藥上可接受之載劑。本文所用之術語「醫藥上可接受之載劑」包括與醫藥投與相容之溶劑、分散體介質、包 衣、抗細菌劑及抗真菌劑、等張劑及吸收延遲劑以及類似物。亦可將輔助的活性化合物納入 組合物中。將醫藥組合物調配成與其意欲的投與途徑兼容。投與途徑之例子包括腸道外投 與，例如靜脈內、皮內、皮下、經口(例如吸入)、穿皮(外用)、穿黏膜及直腸投與。用于腸 道外、皮內或皮下投與之溶液或懸浮液可包括下列成分無菌稀釋液諸如注射用水、鹽水溶 液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶劑；抗細菌劑諸如芐醇或對羥基苯甲酸甲 酯；抗氧化劑諸如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑諸如乙二胺四乙酸；緩沖液諸如乙酸鹽、 檸檬酸鹽或磷酸鹽；以及等張性調整劑諸如氯化鈉或葡萄糖。PH值可用酸或堿諸如鹽酸或 氫氧化鈉調整。腸道外制劑可密封在玻璃或塑料制之安瓿、可拋棄式注射筒或多劑量小瓶 中。本文中所用之術語「病患」系指人類及非人類靈長類(例如猩猩、獼猴、狨猴)，家 畜(例如綿羊、牛、馬、驢子、豬)，寵物(例如狗、貓)，實驗室試驗動物(例如小鼠、兔子、大 鼠、天竺鼠、倉鼠)，圈養之野生動物(例如狐貍、鹿)以及任何可從本發明藥劑獲益之其它 生物。對于可從本文所述之藥劑獲益之動物類型沒有限制。在本發明中最佳之病患為人 類。不論是人類或非人類生物皆可被稱為病患(patient)、個體(individual)、動物、宿主 (host)或接受者(recipient)。適合注射用之醫藥組合物包括無菌水溶液(在可溶于水之情況)或分散體以及 無菌注射溶液或分散液之實時調配制劑用之無菌粉末。就靜脈內投與而言，適當的載劑包 括生理食鹽水、抑菌水、Cremophor EL. TM. (BASF, Parsippany, N. J.)或磷酸鹽緩沖鹽水 (PBS)。在所有情況，組合物必須為無菌以及具有某種程度之流體性，以易于注射。組合物 在制造及貯存條件下應當安定且必須對抗微生物諸如細菌及真菌之污染作用而進行防腐。 載劑可為溶劑或分散體介質，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇及液體聚乙 二醇以及類似物)以及其適當的混合物。適當的流體性例如可以藉由使用涂膜諸如卵磷脂 而維持，在分散體之情況藉由保持所需之粒度而維持以及藉由使用界面活性劑而維持。防 止微生物之作用可藉由各種抗細菌劑及抗真菌劑，例如，對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、酚、抗壞 血酸、乙汞硫柳酸鈉(thimerosal)及類似物而達成。在許多情況，組合物較佳包括等張劑， 例如，糖、多元醇諸如甘露醇及山梨醇、或氯化鈉。可注射組合物之延長吸收可藉由在組合 物中包括延遲吸收之藥劑例如單硬脂酸鋁及明膠而達成。無菌注射溶液可藉由將所需量之活性化合物引進適當的溶劑中，視需要同時引進 上文列舉之成分之一種或組合物，繼而過濾滅菌而制備。一般而言，分散液藉由將活性化合 物引進無菌載劑而制備，該無菌載劑含有基本分散介質及上文列舉者中之所需其它成分。 制備無菌注射溶液所用之無菌粉末之情況，較佳之制備方法為真空干燥及冷凍干燥，其可 從先前經無菌過濾之溶液得到活性成分加上任何其它期望成分之粉末。口服組合物通常包括惰性稀釋劑或可食用之載劑。就口服治療投與之目的而言， 活性化合物可與賦形劑混合并以錠劑、含錠或膠囊劑(例如明膠膠囊劑)之形式使用。口 服組合物亦可用流體載劑制備，以做為漱口水。醫藥兼容性結合劑或佐劑物質可被納入做 為組合物之一部分。錠劑、丸劑、膠囊劑、含錠劑及類似制劑可含有下列成分之任一種或具 有相似性質之化合物黏合劑諸如微晶形纖維素、西黃耆膠或明膠；賦形劑諸如淀粉或半 乳糖；崩散劑諸如藻膠酸、Primogel或玉米淀粉；潤滑劑諸如硬脂酸鎂或^erotes ；滑劑諸如膠體二氧化硅；甜味劑諸如蔗糖或糖精；或調味劑諸如薄荷(P印permint)、水楊酸甲酯 或橙類調味劑。就藉由吸入之投與而言，化合物以氣溶膠噴霧劑(aerosol spray)之形式從含有 適當推進劑(例如氣體諸如二氧化碳)之加壓容器或分配器輸出，或由霧化器(nebulizer) 輸出。全身性投與亦可經由穿過黏膜(transmucosal)或穿皮投與。就穿過黏膜或穿皮 投與而言，在調配物中使用適于透過障壁之滲透劑。此等滲透劑在本技術中為眾所周知，例 如就穿過黏膜投與而言，包括清潔劑、膽鹽及褐霉酸(fusidic acid)衍生物。穿過黏膜投 與可經由使用鼻噴霧劑或栓劑而達成。就穿皮投與而言，活性化合物被調配成本技術所周 知之軟膏、油膏、凝膠或乳霜。該等化合物亦可被制成供直腸輸送用之栓劑(例如使用習用之栓劑基劑諸如可 可油脂及其它甘油酯)或滯留性灌腸劑。在一具體例中，活性化合物藉由使用能保護該化合物使其免于從身體快速清除之 載劑，而制備成例如控制釋放調配物，該控制釋放調配物包括植入物、顯微包膠輸送系統。 可以使用生物可降解、生物兼容性聚合物諸如乙烯-乙酸乙烯酯共聚物、聚酸酐、聚羥乙 酸、膠原、聚原酯(polyortho-ester)及聚乳酸。該等調配物之制法對精于本技術者而言為 顯而易知。該等物質亦可從Alza公司及Nova藥品公司獲得。微脂粒懸浮液(包括具有針對 細胞-特異性抗原之單株抗體而可標定于感染細胞之微脂粒)亦可被用做醫藥上可接受之 載劑。此等微脂粒懸浮液可依照精于本技術者已知之方法制備，例如美國專利第4，522，811 號所述者。將口服或腸道外組合物調配成單位劑型系為有利，因為便于投與及劑量均勻。本 文所稱之「單位劑型」系指適于做為待治療病人之單位劑量之物理上分離之單位；各單位 含有經計算能產生期望治療作用之預定量活性化合物以及所需之醫藥載劑。該等化合物之毒性及治療效力可在細胞培養物或實驗動物中藉由標準醫藥方法 測定，例如測定LD50 (使群體之50%死亡之劑量)以及ED50 (在50%群體中治療有效之劑 量)。毒性作用與治療作用間之劑量比稱為治療指數且系以LD50/ED50比表示。以顯示高 治療指數之化合物為較佳。雖然可以使用顯示毒性副作用之化合物，但應小心設計將該等 化合物標定于受犯組織部位之輸送系統，以使對于未感染細胞之潛在傷害減至最低，藉此 減少副作用。從細胞培養物檢定分析及動物研究得到之數據可用于調配某范圍之劑量以供病 患使用。該等化合物之劑量較佳在包括ED50且引起極微或未引起毒性之循環濃度范圍 內。劑量可在該范圍內，視所用劑型及投與途徑而變化。對于本發明方法所用之任何化合 物而言，治療有效劑量初始可從細胞培養物檢定分析評估。在動物模型中調制能達到包括 IC50(即受試化合物達到癥狀之最大抑制之一半之濃度，該IC50如在細胞培養物中測得 者)之循環血漿濃度范圍的劑量。該數據可被用于更精確地測定在病患中之有用劑量。血 漿濃度例如可藉由高效液相層析測量。如在本文中所定義，本發明之活性化合物之治療有效量可為約0. 001至30毫克/ 公斤體重，較佳約0. 01至25毫克/公斤體重，更佳約0. 1至20毫克/公斤體重，甚至更佳 約1至10毫克/公斤，2至9毫克/公斤，3至8毫克/公斤，4至7毫克/公斤，或者5至6毫克/公斤體重。活性化合物可以每星期1次至每天3次或3次以上之頻率投與，總計投 與約1至10星期，較佳2至8星期，更佳約3至7星期，甚至更佳約4、5或6星期，但非限 于此。精于本技術人士當了解某些因子會影響有效治療病患所需之劑量及給藥時間，該等 因子包括，但不限于，疾病或失調之嚴重度、先前之治療、病患之一般健康狀況或年齡以及 其它存在之疾病。再者，病患以治療有效量之本發明醫藥組合物之治療可包括單一治療或 較佳包括一系列之治療。基因治療及RNAi編碼本發明之融合蛋白質之構筑體可被用作基因治療規程之一部分，以將治療有 效劑量之受體融合蛋白質輸送至病患。在活體中將核酸引進細胞之較佳途徑為藉由使用含 有編碼本發明之融合蛋白質之核酸之病毒載體。以病毒載體感染細胞具有下述優點高比 例之標定細胞可接受核酸。此外，病毒載體中所編碼之分子，例如藉由病毒載體所含之cDNA 所編碼之分子，在攝入病毒載體核酸之細胞中能有效率地表現。反錄病毒(retrovirus vectors)及腺病毒相關性病毒載體可做為在活體中移轉 編碼融合蛋白質之外源核酸分子之重組基因輸送系統。此等載體將核酸有效率地輸送入 細胞中且所移轉之核酸被安定地整合入宿主之染色體DNA中。只制造復制-缺陷型反錄 病毒之特異化細胞系(稱為「套裝細胞」)之開發使反錄病毒在基因治療之利用性上更為 增加，且缺陷型反錄病毒經特征定性而應用于基因治療目的之基因轉移中(該法之評介可 參考Miller，A.D. (1990)Blood 76:271)。復制用缺陷型病毒可被組裝入病毒粒子中，該 病毒粒子可藉由標準技術及使用輔助病毒感染標定細胞。產生重組反錄病毒之規程以及 在試管中或活體中用該等病毒感染細胞之規程可記載于分子生物學之現有規程(Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F. Μ. et al. , (eds. )Greene Publishing Associates, (1989)，Sections 9. 10-9. 14)以及其它標準實驗室手冊中。另一有用的病毒基因輸送系統系使用衍生自腺病毒之載體。可將腺病毒之基因組 加以處理，以致其編碼及表現所探討之基因產物，但在正常溶裂病毒生命循環中之復制能 力則喪失。例如參見 Berkner et al.，BioTechniques 6 :616(1988) ；Rosenfeld et al.， Science 252:431-434(1991)；以及 Rosenfeld et al.，Cell 68:143-155(1992)。衍生自 腺病毒Ad株5型dl3M或腺病毒之其它株之適當腺病毒載體(例如Ad2，Ad3，Ad7等)為 精于本技術者所已知。重組腺病毒在某些情況下為有利，因其不會感染未分裂細胞且可被 用于感染廣泛種類之細胞類型，包括上皮細胞(Rosenfeld et al. , (1992)，如上文所引用 者)。再者，該病毒粒子相對安定及可進行純化及濃縮，且如上述可加以修改，以影響感染力 之范圍。此外，引進之腺病毒DNA(以及其所含之外來DNA)未被整合入宿主細胞之基因組而 保持為游離基因體(印isomal)，藉此可避免引進之DNA整合入宿主基因組(例如反錄DNA) 時于整合位置發生插入性突變所引起之潛在問題。再者，腺病毒基因組攜帶外來DNA之能 力比其它基因輸送用載體大(高達8仟堿基)(Berkner et al.，上文所引用者；Haj-Ahmand et al.，J. Virol. 57 :267 (1986))。在另一具體例中，本發明之非病毒基因輸送系統依賴細胞吞噬途徑(endocytic pathways)而使標定細胞攝入目標核苷酸分子。例示之此型基因輸送系統包括衍生自微脂 粒之系統、聚離胺酸綴合物及人造病毒套膜。在代表性具體例中，編碼本發明之融合蛋白質 之核酸分子可封入表面帶正電之微脂粒[例如親脂質(lipofectins)]中且(視需要)核酸分子可用對抗目標組織之細胞表面抗原之抗體加以標記(Mizuno et al. (1992) No Shinkei Geka20 :547-551 ；PCT公開W091/06309 ；日本專利申請案第1047381號；以及歐洲專利公開 EP-A43075)。編碼本發明融合蛋白質之基因所用之基因輸送系統可藉由許多方法之任一者引 進病患中。舉例言之，基因輸送系統之醫藥制劑可全身性地，例如藉由靜脈注射引進，而在 目標細胞中蛋白質之特異性轉導主要系基于基因輸送載體所提供之特異性轉染、由轉錄調 節序列控制之受體基因表現所造成之細胞型或組織型表現、或其組合。在其它具體例中，重 組基因之初始輸送較為局限，在動物中之引進十分局部化。舉例言之，基因輸送載體可經 由導管(參見美國專利第5，3 ，470號)或經由立體定向注射(例如Chen et al. (1994) PNAS 91 :3(^4-3057)引進。基因治療構筑體之醫藥制劑可主要由在可接受稀釋劑中之基 因輸送系統組成，或者可包含包埋有基因輸送載劑之緩釋基質。在融合蛋白質可由重組細 胞例如反錄病毒載體完整產生之情況，醫藥組合物可包含一種或一種以上會產生融合蛋白 質之細胞。在另一具體例中，使用RNA干擾(RNAi)降低或完全抑制先天性免疫受體之表 現，其中該先天性免疫受體依照本文揭示之方法被鑒定為參與致病過程。RNAi為本技術 所熟知且可藉由使用小型干擾性RNA(siRNA)達成。依照本發明之siRNAs具有達^bps、 25bps、22bps、21bps、20bps、15bps、10bps、5bps或在上述數值附近或之間之任何整數。該 等siRNAs可以例如載體(例如編碼小型發夾狀RNA(shRNA)之載體)所編碼之形式或以 微脂粒核酸復合物投與。脂質核酸復合物(包括標定之微脂粒諸如免疫脂質復合物) 之制備為精于本技術者所熟知(例如參見Crystal，Science270 :404-410 (1995) ；Blaese et al. , Cancer Gene Ther. 2 :291-297 (1995) ；Behr et al. , Bioconjugate Chem. 5 382-389(1994) ；Remy et al.，Bioconjugate Chem. 5 :647-654(1994) ；Gao et al.，Gene Therapy 2:710-722(1995) ；Ahmad et al.，Cancer Res. 52 :4817-4820 (1992)；美國專利 第 4，186，183 號、第 4，217，344 號、第 4，235，871 號、第 4，261，975 號、第 4，485，054 號、第 4，501，728號、第4，774，085號、第4，837，028號及第4，946，787號)。所以，本發明亦提供 包含RNA分子之醫藥組合物，該RNA當投與至病患時，能媒介先天性免疫受體之RNA干擾。根據具體例，本文提供在巨噬細胞中由RNAi所媒介之DVLR1/CLEC5A基因表現下 降(knock down)的非限定性實例。以此方式產生之DVLR1/CLEC5A減活(attenuation)顯 著降低感染登革熱病毒(DV)之巨噬細胞中促發炎性細胞激素之分泌，因而表示RNAi所媒 介之DVLR1/CLEC5A減活在治療登革熱病毒上有用。 減少DVLR1/CLEC5A表現之siRNA或shRNA被特別考慮用于登革熱患者之RNAi-媒 介治療。設計、合成及投與shRNA及siRNA以減少特異性基因表現之方法為本技術所熟知 且記載于，例如，美國專利第7，022，828號。適于與本發明之shRNA構筑體及siRNA分子 一起調配之藥劑之非限定性例子包括與PEG綴合之核酸、與磷脂綴合之核酸、含有親脂部 分之核酸、硫代磷酸酯(phosphorothioates)、P-醣蛋白抑制劑(諸如Pluronic P85)[其 可促進藥物進入各種組織，例如 CNSCJolliet-Riant and Tillement，1999，Fundam. Clin. Pharmacol. ,13,1626)]；生物可降解聚合物，諸如植入后持續釋放輸送用之聚(DL-丙交 酯-乙交酯)微球囊(Emerich，DF et al, 1999, Cell Transplant，8，4758)Alkermes， Inc. Cambridge, Mass.；以及有負載之奈米粒子諸如由聚氰基丙烯酸丁酯制成者，其可將藥物輸送通過血腦障壁且可改變神經元攝取機制(Prog Neuropsychopharmacol Biol I^sychiatry，23，941949，1999)。輸送手段(包括本發明之核酸分子之CNS輸送)之其 它非限定性例子包括下列文獻所述之材料=Boado et al.，1998，J. Pharm. Sci.，87，1308 1315 ；Tyler et al，1999，FEBS Lett.，421，280 284 ；Pardridge et al.，1995，PNAS USA.， 92,55925596 ；Boado,1995, Adv. Drug Delivery Rev. ,15,73107 ；Aldrian-Herrada et al. ，1998， Nucleic Acids Res. ，26，49104916 ；及 Tyler et al. ，1999， PNAS USA·，96， 70537058。所有此等文獻以參考數據方式納入本文。此外，包含表面經修改之微脂粒之組合 物，其中該表面經修改之微脂粒含有聚(乙二醇)脂質，即經PEG修改或長時間循環之微脂 粒或長命微脂粒(stealth liposomes)，亦可與本發明之核酸合用。本發明之核酸分子亦包 含共價連接之具有各種分子量之PEG分子。此等調配物提供在目標組織中增加藥物蓄積之 方法。該類藥物載劑可阻止藥物被單核吞食系統(MPS或REQ調理(opsonization)及清 除，藉此使得經包納之藥物在血液循環中之時間增長及組織暴露增加(Lasic et al. Chem. Rev.1995，95，2601 2627 ；Ishiwata et al.，Chem. Pharm. Bull. 1995，43，10051011)。已 證明該等微脂粒會選擇性地蓄積在腫瘤中，此可能系經由在血管新生化目標組織中之血 管外滲及擷取而產生(Lasic et al.，Science 1995,267,12751276 ；Oku et al.，1995， Biochim. Biophys. Acta, 1238,8690)。長時間循環微脂粒，尤其當與已知會蓄積在MPS組 織中之習知陽離子性微脂粒相較時，會促進DNA及RNA之藥品動力及藥品靜力性質(Liu et al. , J.Biol. Chem. 1995,42,2486424870 ；Choi et al.，國際 PCT
發明者徐翠玲, 翁啟惠, 謝世良, 陳斯婷 申請人:中央研究院