利用磁納米顆粒富集結合雙色流式細胞術檢測大腸桿菌的方法

專利名稱：利用磁納米顆粒富集結合雙色流式細胞術檢測大腸桿菌的方法
技術領域：
本發明涉及一種大腸桿菌的檢測方法，尤其涉及一種利用生物免疫測定技術檢測 大腸桿菌的方法。
背景技術：
大腸埃希氏菌(E. coli)通常稱為大腸桿菌，是Escherich在1885年發現的，在相 當長的一段時間內，一直被當作正常腸道菌群的組成部分，認為是非致病菌。直到20世紀 中葉，人們才認識到一些特殊血清型的大腸桿菌對人和動物有病原性，尤其對嬰兒和幼畜 (禽)，常引起嚴重腹瀉和敗血癥。大腸桿菌是一種普通的原核生物，屬于細菌，根據不同 的生物學特性，我們可以將具有致病性的大腸桿菌分為五類致病性大腸桿菌(EPEC)、腸 產毒性大腸桿菌(ETEC)、腸侵襲性大腸桿菌(EIEC)、腸出血性大腸桿菌(EHEC)、腸黏附性 大腸桿菌(EAEC)。這幾類大腸桿菌是重要的食源性病原菌，主要通過受污染的食物(飲用 水、肉制品和原料奶等)向人類傳播。迄今為止，全球已發生過多起因感染具有致病性大腸 桿菌(例如E. coli 0157:H7)而集體死亡的事件。因此，快速、靈敏的檢測大腸桿菌(例如 E. coli 0157:H7等)對預防這類事件的再次發生具有非常重大的意義。目前，大腸桿菌的檢測技術主要包括利用單克隆抗體的直接檢測技術以及大腸桿 菌特征性核酸片段的分子生物學檢測技術，常用的直接檢測方法主要有利用單克隆抗體的 ELISA(enzyme linked immune sorbent assay)反應檢測、熒光染料探針標記檢測、化學發 光微陣列檢測、壓電石英晶體傳感檢測等，而分子生物學檢測方法主要有基因探針方法、熒 光實時PCR方法等。相對于分子生物學檢測技術來說，單克隆抗體用于檢測大腸桿菌的直 接檢測技術具有明顯的特異性，并可較大程度地避免假陽性，其作為一種免疫試劑在臨床 和食物標本的快速檢測中具有廣泛的應用前景。但是，利用單克隆抗體直接檢測的一些信 號識別方法(如ELISA方法或熒光染料探針方法)已不能滿足高靈敏檢測的需求，因此，探 求準確、快速、靈敏地檢測大腸桿菌的方法一直為醫學界所關注。磁納米顆粒為一種處于納米級(Inm IOOnm)的磁性材料(Fe的氧化物為主)，其 特質使其具備有量子尺寸效應、表面效應、小尺寸效應及宏觀量子隧道效應等。當磁納米顆 粒粒徑小于其超順磁性臨界尺寸時，粒子進入超順磁狀態，其表面可結合多種生物功能分 子，結合后的磁納米顆粒在微生物檢測、基因治療等醫學領域都有廣泛的應用。流式細胞術(FCM)是利用流式細胞儀對細胞或其他微小生物顆粒的多種物理、生 物學參數同時進行定量分析的技術，它能在單細胞水平辨認細胞形態、大小和熒光特征，具 有檢測速度快、采集數據量大、能同時進行多參數檢測、方法靈活客觀等優良特性，目前已 成為一種重要的細菌檢測手段，并應用于環境、食品以及生物醫學等相關領域。然而，由于 細菌體積微小、各種菌體成份含量相對較低，因此采用流式細胞術來實現對大腸桿菌的快 速、高靈敏檢測既是一種機遇，同時也是一種挑戰。例如，利用傳統熒光染料作為標記物，其 熒光強度已難以滿足高靈敏檢測的需要，需要發展更明亮的熒光標記物。近年來，各種發光納米顆粒，包括量子點、熒光乳膠顆粒以及二氧化硅熒光納米顆粒等，由于具有更高的熒光 強度和更好的光穩定性而成功地應用于生物標記及病原菌檢測等領域，這些發光納米顆粒 標記技術為采用流式細胞術來實現對細菌的高靈敏檢測提供了一種新的思路。然而，在細 菌濃度較低的情況下，要克服假陽性信號等問題，從而達到快速、準確地檢測要求仍然存在 一定困難。因此，如何對低濃度的待測大腸桿菌樣品進行快速、準確、靈敏地檢測，對于本領 域技術人員來說仍然具有重要意義。

發明內容
本發明要解決的技術問題是克服現有技術的不足，提供一種更加快速、準確、靈 敏、且假陽性率低的利用磁納米顆粒富集結合雙色流式細胞術檢測大腸桿菌的方法。為解決上述技術問題，本發明提出的技術方案為一種利用磁納米顆粒富集結合雙 色流式細胞術檢測大腸桿菌的方法，其特征在于首先利用所述磁納米顆粒與待測樣品共 培育并富集，該富集是指所述磁納米顆粒與待測樣品形成的復合物在外加磁場作用下富集 起來，如果待測樣品中含有大腸桿菌，則所述磁納米顆粒將與待測樣品形成大腸桿菌_磁 納米顆粒復合物并富集起來；然后以熒光納米顆粒標記的大腸桿菌抗體與富集后的待測樣 品進行免疫共培育并二次富集，再以核酸染料對二次富集后的待測樣品進行染色，最后采 用多參數流式細胞術和激光共聚焦顯微鏡對染色后的待測樣品進行檢測，根據檢測到的單 位體積中具有熒光雙陽性信號(該熒光雙陽性信號即為所述熒光納米顆粒和染色操作后 得到的核酸染料-細菌核酸復合物所發出的不同顏色的熒光信號)的對象的數量來對待 測樣品中大腸桿菌的檢測結果進行分析和判斷。最后的分析和判斷的具體操作對于本領 域技術人員而是顯而易見的，例如可以對10，000個對象進行統計分析，分析結果以紅色熒 光-綠色熒光的對數雙參數點圖表示，在陽性對照中，結合綠色熒光與紅色熒光信號，如果 熒光雙陽區(UR區)呈現出清晰可辨的群，則可判斷待測樣品中含有大腸桿菌。本發明提出的上述技術方案中，所述磁納米顆粒用于富集待測樣品中的目標菌體 以放大檢測信號，所述熒光納米顆粒標記的羊抗大腸桿菌抗體用于靈敏、特異性地對大腸 桿菌進行免疫熒光染色，而核酸染料用于對細菌進行核酸染色以區分細菌與待測樣品中的 其它顆粒性雜質，該技術方案充分結合了磁納米顆粒的超順磁效應和雙色流式細胞術的靈 敏特異性，整個檢測過程(包括樣品預處理)可在3h 3. 5h完成，能夠真正實現對大腸桿 菌樣品進行快速、準確、靈敏地檢測。上述的利用磁納米顆粒富集結合雙色流式細胞術檢測大腸桿菌的方法中，所述熒 光納米顆粒和所述染色操作后得到的核酸染料_細菌核酸復合物具有不同的熒光最大發 射波長，所述熒光納米顆粒和核酸染料-細菌核酸復合物的熒光最大激發波長、熒光最大 發射波長均優選處于300nm 700nm。上述的利用磁納米顆粒富集結合雙色流式細胞術檢測大腸桿菌的方法中，所述熒 光納米顆粒和核酸染料-細菌核酸復合物的熒光最大發射波長的差值優選不小于45nm。因 為根據我們反復實驗的結果，在該差值以上的兩種最大發射波長能夠產生較好的熒光雙陽 性信號，更有利于后續步驟中借助雙色流式細胞術對檢測結果進行分析和判斷。上述的利用磁納米顆粒富集結合雙色流式細胞術檢測大腸桿菌的方法中，所述磁 納米顆粒同樣可以為帶有激發波長和發射波長的顆粒，但優選為無激發波長和發射波長的
5顆粒，這樣能夠避免對前述的熒光雙陽性信號產生干擾。上述的利用磁納米顆粒富集結合雙色流式細胞術檢測大腸桿菌的方法中，所述磁 納米顆粒優選為二氧化硅包被氨基化磁納米顆粒(該顆粒可直接外購)。上述的利用磁納米顆粒富集結合雙色流式細胞術檢測大腸桿菌的方法中，所述二 氧化硅包被氨基化磁納米顆粒為表面修飾甘露糖的二氧化硅包被氨基化磁納米顆粒，所述 待測樣品在與該表面修飾甘露糖的二氧化硅包被氨基化磁納米顆粒進行共培育以前，先與 刀豆蛋白A進行共培育。事實上，本領域技術人員可以自行選擇磁納米顆粒富集待測樣品 的具體方式，而在本優選的技術方案中，所述待測樣品中的大腸桿菌先與刀豆蛋白A孵育， 刀豆蛋白A可與大腸桿菌表面0抗原結合，再利用甘露糖和凝集素刀豆蛋白A(ConA)特異 性結合這一特點，通過在氨基化磁納米顆粒表面修飾甘露糖即可實現磁納米顆粒對待測樣 品的有效富集。更優選的，上述技術方案中的表面修飾甘露糖的二氧化硅包被氨基化磁納米顆 粒，其制備方法包括以下步驟(1)羧基化甘露糖的制備向去離子水中分別加入甘露糖、一氯醋酸鈉溶液和 NaOH溶液，混合，然后加入磷酸二氫鈉溶液并滴加鹽酸，使混合液中的pH值控制在中性，得 到羧基化甘露糖溶液；(2)磁納米顆粒表面修飾甘露糖取30 35體積的上述羧基化甘露糖溶液，并添 加適量的PB緩沖液、NHS試劑和EDC試劑，恒溫搖床振蕩，再向振蕩后的羧基化甘露糖溶液 中加入未經修飾的二氧化硅包被氨基化磁納米顆粒使該顆粒在羧基化甘露糖溶液中的濃 度達到3X IO5 3. 5X IO5個/mL，恒溫搖床振蕩，富集、去上清液，用PB緩沖液洗滌后再富 集，制得表面修飾甘露糖的二氧化硅包被氨基化磁納米顆粒。上述的各技術方案中，所述檢測對象大腸桿菌主要是指對人體具有致病性的幾類 大腸桿菌，其中優選是指腸出血性大腸桿菌(EHEC)，根據檢測對象的不同，所選用的大腸 桿菌抗體作適應性調整即可，例如大腸桿菌06的檢測可選用兔抗腸致病性大腸桿菌06抗 體；大腸桿菌DH5 α的檢測可選用兔抗大腸桿菌DH5 α多克隆抗體；大腸桿菌Κ12的檢測 可選用鼠抗大腸桿菌Κ12抗體。根據我們反復實驗的結果，本發明的技術方案特別優選適 用于大腸桿菌0157:H7(E. coli 0157:Η7)，相應的大腸桿菌抗體則選用羊抗大腸桿菌抗體 即可。與此相類似的，本發明的技術方案甚至可用于大腸桿菌以外的其他革蘭氏陰性致病 菌的檢測，例如沙門氏菌的檢測對應選用羊抗沙門氏菌特異性抗體，百日咳桿菌對應選用 Bordetellapertussis-百日咳桿菌IgM抗體檢測試劑，霍亂弧菌對應選用小鼠單克隆IgA 抗霍亂弧菌抗體，傷寒桿菌對應選用傷寒桿菌IgM抗體，痢疾桿菌對應選用志賀氏痢疾桿 菌單克隆抗體等。上述的各技術方案中，所述熒光納米顆粒優選為嵌合聯吡啶釕配合物(Ru(BPY)3) 的羧基化二氧化硅熒光納米顆粒；所述核酸染料優選為SYBR Green I。作為對上述技術方案的進一步改進，所述嵌合聯吡啶釕配合物的羧基化二氧化硅 熒光納米顆粒優選是采用以下方法制備得到將環己烷、表面活性劑曲拉通Χ-100和正己 醇(大約為4 1 1的體積比)混合均勻，再加水作分散相，攪拌均勻后形成反相微乳 液，向所述反相微乳液中加入聯吡啶釕配合物的水溶液使聯吡啶釕配合物在反相微乳液中 的濃度為0. 007mol/L 0. 009mol/L，攪拌均勻后加入適量的正硅酸乙酯和氨水，反應完全(例如22h 24h)后加入羧基化試劑，再充分反應(例如22h 24h)后加入無水乙醇破乳， 離心收集納米顆粒，依次用乙醇、水洗滌反應后的納米顆粒，制得嵌合聯吡啶釕配合物的羧 基化二氧化硅熒光納米顆粒。作為對上述技術方案的進一步改進，所述熒光納米顆粒標記的羊抗大腸桿菌抗體 優選是采用以下方法制備得到取0. 9 1體積的熒光納米顆粒離心分散，去上清液后加入 MES緩沖液超聲分散，離心洗滌后再次充分分散在PB緩沖液中，加入適量的NHS試劑和EDC 試劑，恒溫搖床振蕩反應25min 30min，再加入0. 05 0. 06體積的羊抗大腸桿菌抗體并 于恒溫搖床中振蕩反應完全，離心去上清后充分分散在PB緩沖液中，制得熒光納米顆粒標 記的羊抗大腸桿菌抗體。與現有技術相比，本發明的優點在于本發明方法通過將磁納米顆粒和熒光納米顆粒的兩次信號放大作用同時與流式 細胞術能同時進行多參數、快速檢測的特點有機地結合在一起，不僅大大縮短了檢測時間， 而且在很大程度上提高了檢測的準確度，相比于使用普通有機染料作為熒光標記物的傳統 流式細胞術，本發明具有更高的檢測靈敏度；本發明方法在熒光納米顆粒標記的特異性抗體識別的基礎上，增加核酸染料作為 第二步的確證，這不僅極大地減小了熒光納米顆粒團聚所造成的高背景噪聲，同時也減少 了熒光納米顆粒與樣品中顆粒性雜質的非特異性吸附所造成的假陽性信號，相比于采用異 硫氰酸熒光素(FITC)標記的羊抗大腸桿菌抗體作為熒光標記物的單色流式細胞術相比， 本發明顯著地降低了檢測方法中的假陽性率。綜上，本發明的檢測方法可以在很短時間內將較低濃度的目標羊抗大腸桿菌捕獲 并富集，放大檢測信號，真正實現對大腸桿菌進行快速、準確、靈敏地檢測。


圖1為本發明實施例中多參數流式細胞術檢測到的目標菌的流式散點圖；其中，a 圖 f圖分別表示本發明實施例中編號a 編號f的待測樣品的檢測分析結果；各圖中右 上角的百分數表示當用流式細胞術收集10，000個信號時，位于熒光雙陽區域的熒光雙陽 性信號的占比，圖中UR所在的右上部區域即為熒光雙陽區域。圖2為本發明實施例中本發明檢測方法與涂板計數法的檢測結果對比圖，圖2中 橫坐標表示由涂板計數法得到的大腸桿菌濃度的對數值，縱坐標表示由流式細胞儀測得的 大腸桿菌濃度的對數值。圖3為本發明實施例中利用雙色流式細胞術的激光共聚焦顯微鏡進行觀察后的 效果圖；其中，a圖 f圖分別表示本發明實施例中編號a 編號f的待測樣品的檢測分析 結果熒光圖。圖4為本發明實施例中表面修飾甘露糖的二氧化硅包被氨基化磁納米顆粒的透 射電鏡圖。圖5為本發明實施例中熒光納米顆粒標記的羊抗大腸桿菌抗體的透射電鏡圖。圖6為本發明實施例中單個大腸桿菌被圖4、圖5中所示的兩種顆粒捕獲后得到的 大腸桿菌_磁納米顆粒_熒光納米顆粒復合體的透射電鏡圖。圖7為本發明實施例中對比近似技術方案的分析考察及效果對比圖；其中
7
a圖為E. coli 0157:H7經表面修飾甘露糖的二氧化硅包被氨基化磁納米顆粒富 集后，用熒光納米顆粒標記的羊抗大腸桿菌抗體(以下簡稱Ab-FNPs)和SYBR Green I核 酸染料(以下簡稱SYBR Green I)進行雙色標記的檢測結果；b圖為E. coli 0157:H7經表面修飾甘露糖的二氧化硅包被氨基化磁納米顆粒富 集后，用熒光納米顆粒(以下簡稱FNPs)和SYBR Green I進行雙色標記的檢測結果；c圖為E. coli 0157:H7經裸磁納米顆粒富集后，用Ab-FNPs和SYBR Green I進行 雙色標記的檢測結果；d圖為無菌PB緩沖液經表面修飾甘露糖的二氧化硅包被氨基化磁納米顆粒富集 后，用Ab-FNPs和SYBR-I進行雙色標記的檢測結果；e圖為E. coli 0157:H7經表面修飾甘露糖的二氧化硅包被氨基化磁納米顆粒富 集后，用Ab-FNPs進行標記的檢測結果；f圖為E. coli 0157:H7經表面修飾甘露糖的二氧化硅包被氨基化磁納米顆粒富 集后，用FNPs進行標記的檢測結果；g圖為E. coli 0157:H7經裸磁納米顆粒富集后，用Ab-FNPs進行標記的檢測結 果；h圖為無菌PB緩沖液經表面修飾甘露糖的二氧化硅包被氨基化磁納米顆粒富集 后，用Ab-FNPs進行標記的檢測結果。圖8為本發明實施例中基于異硫氰酸熒光素(FITC)標記的傳統流式細胞術獲得 最優信噪比(S/N)的對照圖。圖9為本發明實施例中基于異硫氰酸熒光素(FITC)標記的傳統流式細胞術與涂 板技術法檢測大腸桿菌0157 :H7的效果對照圖。
具體實施例方式實施例本發明的檢測方法在檢測大腸桿菌0157:H7中的應用1、磁納米顆粒捕獲和富集E. coli 0157:H7配制濃度分別為2. 6X106cells/mL、2. 6X105cells/mL、2. 6X104cells/mL、 2. 6X103cells/mL、l. 3X 103cells/mL 的 Ε. coli 0157:H7 菌懸液，將各菌懸液與刀豆蛋白 A 于35°C 37°C溫度下培育lh，離心沖洗兩次；然后取6支體積為IOmL的離心管(編號分 別為a、b、c、d、e、f)，向各管中分別加入以下前述的菌懸液和PB緩沖液配制成梯度濃度的 待測樣品，同時在各離心管中加入100 μ L表面修飾甘露糖的二氧化硅包被氨基化磁納米 顆粒(該磁納米顆粒的透射電鏡圖如圖4所示)，各離心管中的物質成分組成如下所示編號a 10000 μ L ρΗ為7. 4的PB緩沖液和100 μ L表面修飾甘露糖的二氧化硅包 被氨基化磁納米顆粒，作為空白對照；編號b:9900yL ρΗ 為 7. 4 的 PB 緩沖液、100 μ L 1. 3 X 103cells/mL Ε. coli 0157 :H7和100 μ L表面修飾甘露糖的二氧化硅包被氨基化磁納米顆粒，此時目標菌的終濃 度為 1. SXlO'cells/mL ；編號c:9900yL ρΗ 為 7. 4 的 PB 緩沖液、100 μ L2. 6X 103cells/mLE. coli 0157:H7 和100 μ L表面修飾甘露糖的二氧化硅包被氨基化磁納米顆粒，此時目標菌的終濃度為2. BXlO'cells/mL ；編號d :9900μ LpH 為 7. 4 的 PB 緩沖液、ΙΟΟμ L2. 6X104cells/mL Ε. coli 0157:H7 和ΙΟΟμ L表面修飾甘露糖的二氧化硅包被氨基化磁納米顆粒，此時目標菌的終濃度為 2. 6X102cells/mL ；編號e:9900yL pH 為 7. 4 的 PB 緩沖液、100 μ L 2. 6 X 105cells/mL Ε. coli 0157 :H7和100 μ L表面修飾甘露糖的二氧化硅包被氨基化磁納米顆粒，此時目標菌的終濃 度為 2. 6X103cells/mL ；編號f:9900yL pH 為 7. 4 的 PB 緩沖液、100 μ L 2. 6X 106cells/mL Ε. coli 0157 :H7和100 μ L表面修飾甘露糖的二氧化硅包被氨基化磁納米顆粒，此時目標菌的終濃 度為 2. 6X104cells/mL ；將含有梯度濃度待測樣品(空白對照除外)和磁納米顆粒的上述六支離心管放入 350C 37°C、ISOrpm的恒溫搖床中共孵育lh，然后將孵育后的樣品用磁富集器富集4min 5min后，輕輕去掉上清液，再加入ImL PH為7. 4的PB緩沖液沖洗兩次，最后加入100 μ L的 PB緩沖液分散樣品。2、對待測樣品進行免疫熒光染色向步驟1后的上述六個含有梯度濃度待測樣品的離心管中各加入20 μ L熒光納米 顆粒標記的羊抗大腸桿菌抗體(該熒光納米顆粒的透射電鏡圖如圖5所示)，充分混勻后， 放入35°C 37°C、ISOrpm恒溫搖床中共孵育lh，經過磁富集和洗滌，將剩余熒光納米顆粒 及團聚體去掉，得到如圖6所示的大腸桿菌_磁納米顆粒_熒光納米顆粒復合體，由圖6可 以看出，目標大腸桿菌的表面結合有較多的顆粒，這充分證明本實施例中大腸桿菌先被磁 納米顆粒富集起來，并成功被熒光納米顆粒標記。3、對待測樣品進行核酸染色向步驟2后的上述六個含有梯度濃度待測樣品的離心管中各加入5μ L SYBR Green I核酸染料，室溫下染色15min 30min。4、多參數流式細胞術的測定與分析用流式細胞儀和激光共聚焦顯微鏡對上述步驟3后的各待測樣品進行檢測、觀察 和分析，分析結果如圖1、圖2和圖3所示。由圖1中的a圖 f圖可見，當目標菌(即待 測E. coli 0157:H7)的濃度增大時，位于雙陽區域的熒光雙陽性信號的占比是逐漸上升 的。由圖2可見，本發明方法所檢測到的單位體積中具有熒光雙陽性信號的對象的數量與 E. coli 0157:H7的濃度具有較好的線性關系(log Y=L 031ogX-0. 0235)，檢測下限可達 到7cellS/mL。由圖3中的a圖 f圖可見，由于a組待測樣品體系中無目標菌(空白對 照)，因此通過激光共聚焦顯微鏡觀察不到熒光；而b、c、d、e、f組中隨著待測樣品體系中 目標菌濃度的梯度增加，視野中觀察到的目標菌的數目也逐漸增多，這與前述流式細胞術 測得的結果基本趨于一致。相比于近似技術方案的本發明可行性分析考察及效果對比分別考察下述各種近似技術方案的檢測結果并于本發明技術方案的檢測結果做 一比對，以證實本發明技術方案的可行性和優越性方案a :5. OX IO3 E. coli 0157:H7經表面修飾甘露糖的二氧化硅包被氨基化磁納 米顆粒富集后，用Ab-FNPs和SYBR Green I核酸染料進行雙色標記(方案a即為本發明的
9技術方案)；方案b :5. OX IO3 E. coli 0157:H7經表面修飾甘露糖的二氧化硅包被氨基化磁納 米顆粒富集后，用熒光納米顆粒(以下簡稱FNPs)和SYBR Green I核酸染料進行雙色標 記；方案c :5. OXlO3 E. coli 0157:H7經裸磁納米顆粒富集后，用Ab-FNPs和SYBR Green I核酸染料進行雙色標記；方案d 無菌PB緩沖液經表面修飾甘露糖的二氧化硅包被氨基化磁納米顆粒富集 后，用Ab-FNPs和SYBR Green I核酸染料進行雙色標記；方案e :5. OX IO3 E. coli 0157:H7經表面修飾甘露糖的二氧化硅包被氨基化磁納 米顆粒富集后，用Ab-FNPs進行單色標記；方案f :5. OX IO3 E. coli 0157:H7經表面修飾甘露糖的二氧化硅包被氨基化磁納 米顆粒富集后，用FNPs進行單色標記；方案g:5.0X103 Ε. coli 0157H7經裸磁納米顆粒富集后，用Ab-FNPs進行單色 標記；方案h 無菌PB緩沖液經表面修飾甘露糖的二氧化硅包被氨基化磁納米顆粒富集 后，用Ab-FNPs進行單色標記。上述的技術方案a h中，由于沒有采取其他步驟去除體系中過量的磁納米顆粒 和熒光納米顆粒，因此由這些顆粒團聚造成的假陽性信號不能被忽略。我們主要是利用多 參數流式細胞術對上述各方案a h的檢測結果進行考察、對比和分析，分析結論如圖7所 示，其中上述方案a h的檢測結果分別如圖7中的a圖 h圖所示由圖7的a圖可見，被磁富集后的大腸桿菌0157:H7經過雙色標記后，在熒光雙陽 區域(即UR區)有一個明顯的群落，這表明大腸桿菌0157:H7成功被磁納米顆粒富集，且 經過雙色標記后在熒光雙陽區獲得大量的熒光雙陽性信號；由圖7的b圖可見，方案b中的大腸桿菌0157:H7經過磁富集，并用未修飾羊抗大 腸桿菌抗體的熒光納米顆粒和SYBR Green I核酸染料標記后，陽性信號主要出現在綠色熒 光單陽區(即UL區)，這表明大腸桿菌0157:H7可以被表面修飾甘露糖的二氧化硅包被氨 基化磁納米顆粒富集，同時可以被SYBR Green I核酸染料標記，但由于熒光納米顆粒未修 飾羊抗大腸桿菌抗體，因此，方案b中的大腸桿菌0157 :H7沒有特異性結合熒光納米顆粒， 這樣在紅色熒光單陽區(即DR區)中幾乎看不到陽性信號；由圖7的c圖可見，方案c中的大腸桿菌0157:H7經裸磁納米顆粒富集，并用 Ab-FNPs和SYBR Green I核酸染料進行雙色標記后，其在熒光雙陽區域并未出現明顯的信 號群落，在綠色熒光單陽區也未出現明顯的信號，這表明很可能因為裸磁納米顆粒表面未 修飾甘露糖，而致使方案c中的大腸桿菌0157 :H7未被有效富集，大量的目標菌被洗滌脫除 后，自然也就無法成功進行雙色標記，因此在熒光雙陽區域和綠色熒光單陽區無法觀察到 陽性信號；而在紅色熒光單陽區中出現的信號可能是熒光納米顆粒團聚引起假陽性信號；由圖7的d圖可見，方案d中不含大腸桿菌0157 H7，其中的無菌PB緩沖液經表面 修飾甘露糖的二氧化硅包被氨基化磁納米顆粒富集，并用Ab-FNPs和SYBR Green I核酸染 料進行雙色標記后，其在熒光雙陽區域未出現明顯的信號群落，在綠色熒光單陽區也未出 現明顯的信號；這說明由于方案d中未含有目標菌，自然也就無法成功進行富集和雙色標
10記，因此在熒光雙陽區域和綠色熒光單陽區均無法觀察到陽性信號；而在紅色熒光單陽區 中出現的信號可能是熒光納米顆粒團聚引起假陽性信號；圖7的e圖 h圖是磁納米顆粒富集結合熒光納米顆粒標記的單色流式細胞術對 目標菌檢測的考察由圖7的e圖可見，方案e中的大腸桿菌0157:H7經過表面修飾甘露糖的二氧化 硅包被氨基化磁納米顆粒富集和Ab-FNPs進行單色標記后，其檢測信號并不能和其他三個 對照組有效區分開來(如圖7的f圖 h圖)，在其余三個對照組中位于陽性區域(即Rl 區)的信號仍分別占到38. 44% (圖7的f圖)、93· 46% (圖7的g圖)和79. 88% (圖7 的h圖)，這主要是因為其他三個對照組中由于熒光納米顆粒的團聚造成了大量的假陽性 信號。通過上述對比考察，我們可以認定目標菌大腸桿菌0157 H7和刀豆蛋白A孵育后， 可以成功被修飾了甘露糖的磁納米顆粒富集，然后用修飾羊抗大腸桿菌抗體的熒光納米顆 粒和SYBR Green I核酸染料進行雙色標記后，可通過多參數雙色流式細胞術進行有效檢 測。由于磁納米顆粒的特異性富集、熒光納米顆粒的特異性標記及核酸染料實現了免分離， 本發明的方法可有效用于對大腸桿菌的檢測，且本發明避免了因顆粒團聚造成的假陽性信 號，相比其他各種近似方案具有明顯的優勢。相比于現有常規技術方案的效果對比現有常規的技術方案主要是指基于異硫氰酸熒光素(FITC)標記的傳統流式細胞 術檢測大腸桿菌0157:H7的方法。基于異硫氰酸熒光素(FITC)標記的傳統流式細胞術，采用市售異硫氰酸熒光素 (FITC)標記的羊抗大腸桿菌抗體與E. coli 0157:H7純培養物培育并用流式細胞術進行檢 測。首先，優化異硫氰酸熒光素(FITC)標記的抗體濃度以獲得最高的信噪比(S/N)；然后將 不同濃度FITC標記的抗體(終濃度分別為5 μ g/mL、10 μ g/mL、20 μ g/mL、30 μ g/mL)分別 與Ε. coli 0157:H7懸浮液(A)和不含Ε. coli 0157:Η7的陰性對照(B)培育，用A與B平 均綠色熒光強度的比值來計算S/N，計算結果如圖8所示。由圖8可見，當FITC標記的抗體 終濃度為20 μ g/mL時，S/N最高。因此，采用該濃度的抗體結合流式細胞術對1.0 X IO3 1.0X IO7ceIlsAiL梯度濃度的E. coli 0157:H7進行檢測，檢測步驟及結果如下(1)配制濃度為 1. 0X107cells/mL、l. 0X106cells/mL、l. 0X105cells/mL、 1. 0X104cells/mL、l. 0X103cells/mL的目標菌懸液，并取六支體積為1. 5mL的離心管，編 號分別為a、b、c、d、e、f,各離心管中的物質成分組成如下所示編號a:200yL 1. 0X 107cells/mLE. coli 0157:H7 禾口 6 μ L 終濃度為 20 μ g/mL 的 FITC標記的羊抗大腸桿菌抗體；編號b:200yL 1. 0X106cells/mLE. coli 0157:H7 禾口 6 μ L 終濃度為 20 μ g/mL 的 FITC標記的羊抗大腸桿菌抗體；編號c:200yL 1. 0X105cells/mLE. coli 0157:H7 禾口 6 μ L 終濃度為 20 μ g/mL 的 FITC標記的羊抗大腸桿菌抗體；編號d:200yL 1. 0X104cells/mLE. coli 0157:H7 禾口 6 μ L 終濃度為 20 μ g/mL 的 FITC標記的羊抗大腸桿菌抗體；編號e:200yL 1. 0X 103cells/mLE. coli 0157:H7 禾口 6 μ 1 終濃度為 20 μ g/mL 的FITC標記的羊抗大腸桿菌抗體；編號f 200 μ L PB緩沖液和6 μ L終濃度為20 μ g/mL的FITC標記的羊抗大腸桿 菌抗體；(2)在35°C 37°C、180rpm的恒溫搖床中共孵育lh，并對孵育后的樣品進行 流式細胞術的測定和分析，分析結果如圖9所示，由圖9可見，檢測到的單位體積中具有 熒光信號的數量與大腸桿菌的濃度具有較好的線性關系，大腸桿菌0157:H7的檢測限為 2. lX103cellS/mL，可見與使用異硫氰酸熒光素(FITC)標記抗體的傳統流式細胞術相比， 本實施例的靈敏度提高了三個數量級。本發明上述實施例中用到的磁納米顆粒為表面修飾甘露糖的二氧化硅包被氨基 化磁納米顆粒，該顆粒是用以下方法制備得到(1)羧基化甘露糖的制備在25mL的錐形瓶中加入Ig (0. 25g 3g均可)甘露糖、 1. 35mol/L 的一氯醋酸鈉 3. 75mL(3. 7mL 4. OmL 均可)U0mol/L 的 NaOH 0. 5mL (0. 5mL 0. 6mL均可)和去離子水0. 8mL，室溫下攪拌反應7h，然后加入濃度為lmol/L磷酸二氫鈉 ImL,滴加6mol/L和lmol/L的鹽酸調節pH值為7左右；(2)磁納米顆粒表面修飾甘露糖在體積為1.5!^的離心管中加入3(^1^羧基 化甘露糖、100 μ L PH為7.4的？8緩沖液、0.35!^朋3試劑(N-羥基硫代琥珀酰亞胺)和
0.35mg的EDC試劑(1- (3- 二甲氨基丙基)_3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽)，25°C、180rpm恒溫搖 床中反應30min，然后加入IOyL IO6個/mL磁納米顆粒，25°C、180rpm的恒溫搖床中反應 3h 3. 5h，富集、去掉上清液、用PB緩沖液洗滌兩次再富集，制得如圖4所示的表面修飾甘 露糖的二氧化硅包被氨基化磁納米顆粒。由圖4可見，該磁納米顆粒有些團聚，但顆粒形貌 較規則，大小比較均一。本發明上述實施例中用到的熒光納米顆粒為嵌合聯吡啶釕配合物的羧基化二氧 化硅熒光納米顆粒，該熒光納米顆粒是用以下方法制備得到將7. 5mL 7. 6mL的環己烷、
1.6mL 1. 8mL的表面活性劑曲拉通X-100和1. 6mL 1. 8mL的正己醇混合均勻，加入 400 μ L水作為分散相，攪拌均勻后形成反相微乳液，再加入80 μ L 0. lmol/L的聯吡啶釕配 合物的水溶液，攪拌均勻后加入200 μ L的正硅酸乙酯和200 μ L的氨水，反應24h后加入 30 μ L羧基化試劑，繼續反應24h后無水乙醇破乳，離心收集納米顆粒，依次用乙醇、水洗滌 反應后的納米顆粒，制得嵌合聯吡啶釕配合物的羧基化二氧化硅熒光納米顆粒。本發明上述實施例中用到的熒光納米顆粒標記的羊抗大腸桿菌抗體用以下方法 制備得到取ImL熒光納米顆粒12000rpm離心lOmin，去上清液后加入ImL PB緩沖液(MES 緩沖液亦可)超聲分散，離心洗滌兩次，再次充分分散在ImL PB緩沖液中，然后加入3. 5mg 的NHS和3. 5mg的EDC試劑，25 V、180rpm恒溫搖床中反應30min，然后加入50 μ L羊抗大 腸桿菌抗體，并于25°C、180rpm恒溫搖床中反應3 3. 5h，IOOOOrpm離心5min，去上清后 充分分散在ImL PB緩沖液中，制備得到如圖5所示的熒光納米顆粒標記的羊抗大腸桿菌抗 體，儲存于4°C冰箱里備用。由圖5可以看出該顆粒形貌較規則，大小均一，分散性好。
1權利要求
一種利用磁納米顆粒富集結合雙色流式細胞術檢測大腸桿菌的方法，其特征在于首先利用所述磁納米顆粒與待測樣品共培育并富集，該富集是指所述磁納米顆粒與待測樣品形成的復合物在外加磁場作用下富集起來；然后以熒光納米顆粒標記的大腸桿菌抗體與富集后的待測樣品進行免疫共培育并二次富集，再以核酸染料對二次富集后的待測樣品進行染色，最后采用多參數流式細胞術和激光共聚焦顯微鏡對染色后的待測樣品進行檢測和觀察，根據檢測到的具有熒光雙陽性信號的對象的數量來對待測樣品中大腸桿菌的檢測結果進行分析和判斷。
2.根據權利要求1所述的利用磁納米顆粒富集結合雙色流式細胞術檢測大腸桿菌的 方法，其特征在于所述熒光納米顆粒和所述染色操作后得到的核酸染料_細菌核酸復合 物具有不同的熒光最大發射波長，所述熒光納米顆粒和核酸染料-細菌核酸復合物的熒光 最大激發波長、熒光最大發射波長均處于300nm 700nm。
3.根據權利要求2所述的利用磁納米顆粒富集結合雙色流式細胞術檢測大腸桿菌的 方法，其特征在于所述熒光納米顆粒和核酸染料-細菌核酸復合物的熒光最大發射波長 的差值不小于45nm ；所述磁納米顆粒為無激發波長和發射波長的顆粒。
4.根據權利要求3所述的利用磁納米顆粒富集結合雙色流式細胞術檢測大腸桿菌的 方法，其特征在于所述磁納米顆粒為二氧化硅包被氨基化磁納米顆粒。
5.根據權利要求4所述的利用磁納米顆粒富集結合雙色流式細胞術檢測大腸桿菌的 方法，其特征在于所述二氧化硅包被氨基化磁納米顆粒為表面修飾甘露糖的二氧化硅包 被氨基化磁納米顆粒，所述待測樣品在與該表面修飾甘露糖的二氧化硅包被氨基化磁納米 顆粒進行共培育以前，先與刀豆蛋白A進行共培育。
6.根據權利要求5所述的利用磁納米顆粒富集結合雙色流式細胞術檢測大腸桿菌的 方法，其特征在于，所述表面修飾甘露糖的二氧化硅包被氨基化磁納米顆粒的制備方法包 括以下步驟(1)羧基化甘露糖的制備向去離子水中分別加入甘露糖、一氯醋酸鈉溶液和NaOH溶 液，混合，然后加入磷酸二氫鈉溶液并滴加鹽酸，使混合液中的PH值控制在中性，得到羧基 化甘露糖溶液；(2)磁納米顆粒表面修飾甘露糖取30 35體積的上述羧基化甘露糖溶液，并添加適 量的PB緩沖液、NHS試劑和EDC試劑，恒溫搖床振蕩，再向振蕩后的羧基化甘露糖溶液中加 入未經修飾的二氧化硅包被氨基化磁納米顆粒使該顆粒在羧基化甘露糖溶液中的濃度達 到3 X IO5 3. 5 X IO5個/mL，恒溫搖床振蕩，富集、去上清液，用PB緩沖液洗滌后再富集， 制得表面修飾甘露糖的二氧化硅包被氨基化磁納米顆粒。
7.根據權利要求1 6中任一項所述的利用磁納米顆粒富集結合雙色流式細胞術檢測 大腸桿菌的方法，其特征在于所述大腸桿菌為大腸桿菌0157:H7，所述大腸桿菌抗體為羊 抗大腸桿菌抗體。
8.根據權利要求7所述的利用磁納米顆粒富集結合雙色流式細胞術檢測大腸桿菌的 方法，其特征在于所述熒光納米顆粒為嵌合聯吡啶釕配合物的羧基化二氧化硅熒光納米 顆粒；所述核酸染料為SYBR Green I。
9.根據權利要求8所述的利用磁納米顆粒富集結合雙色流式細胞術檢測大腸桿菌的 方法，其特征在于，所述嵌合聯吡啶釕配合物的羧基化二氧化硅熒光納米顆粒是采用以下方法制備得到將環己烷、表面活性劑曲拉通X-100和正己醇混合均勻，再加水作分散相， 攪拌均勻后形成反相微乳液，向所述反相微乳液中加入聯吡啶釕配合物的水溶液使聯吡啶 釕配合物在反相微乳液中的濃度為0. 007mol/L 0. 009mol/L，攪拌均勻后加入適量的正 硅酸乙酯和氨水，反應完全后加入羧基化試劑，再充分反應后加入無水乙醇破乳，離心收集 納米顆粒，依次用乙醇、水洗滌反應后的納米顆粒，制得嵌合聯吡啶釕配合物的羧基化二氧 化硅熒光納米顆粒。
10.根據權利要求9所述的利用磁納米顆粒富集結合雙色流式細胞術檢測大腸桿菌 的方法，其特征在于，所述熒光納米顆粒標記的羊抗大腸桿菌抗體是采用以下方法制備得 到取0. 9 1體積的熒光納米顆粒離心分散，去上清液后加入MES緩沖液超聲分散，離心 洗滌后再次充分分散在PB緩沖液中，加入適量的NHS試劑和EDC試劑，恒溫搖床振蕩反應 25min 30min，再加入0. 05 0. 06體積的羊抗大腸桿菌抗體并于恒溫搖床中振蕩反應完 全，離心去上清后充分分散在PB緩沖液中，制得熒光納米顆粒標記的羊抗大腸桿菌抗體。
全文摘要
本發明涉及一種大腸桿菌的檢測方法，具體公開了利用磁納米顆粒富集結合雙色流式細胞術檢測大腸桿菌的方法，其步驟是首先利用磁納米顆粒與待測樣品共培育并富集，該富集是指所述磁納米顆粒與待測樣品形成的復合物在外加磁場作用下富集起來；然后以熒光納米顆粒標記的大腸桿菌抗體與富集后的待測樣品進行免疫共培育并二次富集，再以核酸染料對二次富集后的待測樣品進行染色，最后采用多參數流式細胞術和激光共聚焦顯微鏡對染色后的待測樣品進行檢測和觀察，根據檢測到的具有熒光雙陽性信號的對象的數量來對待測樣品中大腸桿菌的檢測結果進行分析和判斷。本發明的檢測方法具有快速、準確、靈敏且假陽性率低等優點。
文檔編號G01N15/10GK101907556SQ201010230079
公開日2010年12月8日 申請日期2010年7月19日 優先權日2010年7月19日
發明者何定庚, 何曉曉, 周麗霞, 曹杰, 王柯敏 申請人:湖南大學