專利名稱：用于檢測小鼠組織內Bt殺蟲蛋白的免疫磁小體及其制備方法
技術領域：
本發明涉及一種用于檢測小鼠組織內Bt殺蟲蛋白的免疫磁小體的制備方法。
背景技術：
趨磁細菌是一類具有趨磁性行為的細菌，體內含有由膜包被的納米磁性顆粒-磁小體(Magnetosome)。磁小體為單磁疇晶體，具永磁性，大小為幾十個納米，多數為磁鐵礦 (Fe3O4)性質，少數為硫鐵礦(Fe3S4)性質。通常多個磁小體在菌內排列成鏈，形成一個生物磁羅盤，在地磁場中使趨磁細菌取向，由此簡化它們搜尋適合的微好氧環境以利于生長。與人造的磁納米材料相比，磁小體的一些特點比較明顯，譬如受生物礦化機制的嚴格控制，晶體大小高度均一；顆粒外包裹脂質雙分子膜，顆粒不易聚集，離散性高；實驗表明，磁小體比人造磁顆粒具有更強的剩磁和矯頑力；脂質膜和磁晶體結合牢固，磁小體生物相容性好， 細胞毒性較小，親水作用強，便于與其它分子相連接，等等。隨著眾多轉Bt基因抗蟲作物的商品化和在生產上的大面積推廣使用，其對環境潛在的生態風險性問題引起了人們的廣泛關注。轉Bt基因作物在大田種植過程中它們的植株殘體、根系分泌物和花粉等通過田間耕作不斷地向土壤中釋放的這些外源高度特化了的Bt殺蟲蛋白在進入土壤后的情況如何，是否會在土壤中積累和產生級聯效應，是否對非目標動物造成危害，進而影響土壤生態系統的安全，已成為人們關心的一個重要問題。轉Bt基因作物對于非目標小型動物如鼠類的實際影響問題，國內外研究鮮有報道。目前，廣泛使用的Bt殺蟲蛋白檢測ELISA試劑盒(由美國EnviroLogix公司生產)一般只用于定性研究，在定量檢測應用上有較大誤差，且檢測限只能到Pg級。而專門針對小鼠組織如肝臟、腎臟、胰腺和腸道內的Bt殺蟲蛋白殘留的檢測方法未見報道，故迫切需要開發高效、準確、快速的針對小鼠組織Bt殺蟲蛋白殘留的新型免疫檢測技術和產品。
發明內容
本發明的目的是針對上述現狀，旨在提供一種取材簡單、操作方便；制備方法細致嚴謹，重復性高；所制備的免疫磁小體粒徑小而均勻，品相端正，檢測靈敏度高的用于檢測小鼠組織內Bt殺蟲蛋白的免疫磁小體及其制備方法。本發明目的的實現方式為，用于檢測小鼠組織內Bt殺蟲蛋白的免疫磁小體，由抗 Bt殺蟲蛋白多克隆抗體包被，包被比例為5 X IO9個磁小體/100 μ g抗體，顆粒大小50nm， 最小檢測Bt殺蟲蛋白濃度為lng/ml。用于檢測小鼠組織內Bt殺蟲蛋白的免疫磁小體的制備方法，具體步驟如下(1)將濕重25士0. 5g凍存的趨磁細菌細胞解凍融化后，懸浮于IOOml的IOmM Tris-HCl, pH 8. 0的緩沖液中，超聲振蕩破碎lOmin，超聲振蕩在Branson model 450、 20kHz ； 80W條件下進行，(2)懸浮液離心15min，離心速度為8000轉/g，得到的沉淀用100ml的IOmMTris-HCl, pH 8.0緩沖液重新懸浮后，再次超聲處理；超聲處理在Branson model 450、 20kHz ；80W條件下進行，處理IOmin ；(3)離心后的上清液匯集于燒杯中，置于條形磁鐵上lh，吸去非磁性的液體，磁鐵吸附的磁小體用IOOml的IOmM Tris-HCl.pH 8. 0緩沖液小心懸浮；(4)重復上述步驟至少10次，純化的磁小體用8，OOOXg離心15min收集，沉淀用 IOmM Tris-HCUpH 8. 0緩沖液懸浮，貯存在_80°C，上述純化步驟都在4°C下進行(5)將弗氏佐劑與Bt殺蟲蛋白按體積1 1混合后免疫小鼠，經分離純化得到鼠抗Bt殺蟲蛋白多克隆抗體；(6)將鼠抗Bt殺蟲蛋白多克隆抗體，通過羧基-氨基化學偶聯法偶聯磁小體，得到檢測小鼠組織內Bt殺蟲蛋白的免疫磁小體；步驟(1)所述趨磁細菌是Magnetospirillum magneticum AMB-1，編號 700264。本發明的優點在于本發明的一種用于檢測小鼠組織內Bt殺蟲蛋白的免疫磁小體制備方法，采用趨磁細菌內源性納米磁小體為基質材料，用化學偶聯方法偶聯抗Bt殺蟲蛋白多克隆抗體獲得，取材簡單、操作方便；制備方法細致嚴謹，重復性高；所制備的免疫磁小體粒徑小而均勻，品相端正，檢測靈敏度高，其最小檢測Bt蛋白濃度是lng/ml。
圖1是磁小體JEOL掃描電鏡照片；圖2 Bt殺蟲蛋白抗體Wfestern Blotting檢測分析；圖3是抗血清效價測定；圖4是免疫磁小體(化學發光EIA法)檢測Bt殺蟲蛋白。
具體實施例方式下面用具體實施例說明本發明。1、制備磁小體的具體步驟如下(1)將濕重5g、25g或25. 5g凍存的趨磁細菌細胞解凍融化后，懸浮于IOOml的 IOmM Tris-HCl.pH 8. 0的緩沖液中，超聲振蕩破碎lOmin，超聲振蕩在Branson model 450、 20kHz ；80W 條件下進行，趨磁細菌是 Magnetospirillum magneticum AMB-1，購自 ATCC，編號 700264 ；(2)懸浮液離心 15min(8, 000Xg)，得到的沉淀用 IOOrnl 的 IOmM Tris-HCUpH 8. 0 緩沖液重新懸浮后，再次超聲處理；超聲處理在Branson model 450、20kHz ;80W條件下進行，處理IOmin ；(3)離心后的上清液匯集于燒杯中，置于2. 5cmX 12cm條形磁鐵上lh，吸去非磁性的液體，磁鐵吸附的磁小體用100ml的IOmM Tris-HCUpH 8. 0緩沖液小心懸浮；(4)重復上述步驟至少10次，純化的磁小體用8，000 X g離心15min收集，沉淀用 IOmM Tris-HCUpH 8. 0緩沖液懸浮，貯存在_80°C，上述純化步驟都在4°C下進行制備出的磁小體形態和大小如圖1所示。2、將弗氏佐劑與Bt殺蟲蛋白按體積1 1混合后免疫小鼠，經分離純化得到鼠抗 Bt殺蟲蛋白多克隆抗體的具體步驟如下
(1)將Bt殺蟲蛋白與弗氏佐劑按體積1 1混合后，充分乳化，采用背部多點注射法免疫BALB/c小鼠，每次免疫的抗原量約10 μ g，免疫三次，每次免疫兩周后經尾動脈取血檢測抗體效價；(2)以500 μ g/ml的抗原包被酶標板，100 μ 1/孔，4°C過夜；(3)洗滌后，加入待檢的血清樣品，100 μ 1/孔，37°C 1小時；設陰性對照孔；(4)洗滌后，加入HRP標記的羊抗鼠IgG的抗體試劑，100 μ 1/孔，37°C避光顯色15 分鐘；用2M H2SO4終止反應后，閱讀各孔的A490值，通過分析各孔的A490值，檢測制備的鼠抗Bt殺蟲蛋白多克隆抗體的效價。對制備的Bt殺蟲蛋白抗體做Wfestern Blotting分析，結果見圖2。經ELISA法檢測，抗體能與CrylAb/CrylAc蛋白特異性結合，其相關系數達到顯著水平，效價>1 6000， 結果見圖3。3、由鼠抗Bt殺蟲蛋白多克隆抗體制備免疫磁小體的具體步驟如下(1)用30mM、pH = 5的MES緩沖液在外加磁場作用下清洗納米磁小體，使納米磁小體分散于MES緩沖液中，終濃度為40mg/ml ；(2)取納米磁小體100 μ 1，依次加入50mM EDC、50mM NHS溶液各50 μ 1，室溫震蕩 30min ；(3)在磁感應強度30mT的磁場作用下棄上清液，用MES溶液清洗3次；(4)取1.09mg/ml抗Bt殺蟲蛋白的多克隆抗體100 μ 1，加入已活化的納米磁小體，室溫震蕩30min ；(5)磁性分離，收集上清液，用0. 02M磷酸緩沖液多次洗滌，得到免疫磁小體。步驟⑷所述的Bt殺蟲蛋白由美國Agdia公司訂制生產。4、通過羧基-氨基化學偶聯法偶聯免疫磁小體，得到檢測小鼠組織內Bt殺蟲蛋白的免疫磁小體的具體步驟如下(1)首先用30mM、pH = 5的2_(N_嗎啉)-乙烷磺酸緩沖液在外加磁場作用下清洗免疫磁小體，使免疫磁小體分散于MES緩沖液中，終濃度為40mg/ml ；(2)取100 μ 1免疫磁小體緩沖液，依次加入50m碳化二亞胺、50mN_羥基丁二酰亞胺溶液各50 μ 1，室溫震蕩30min ；(3)在磁場作用下棄上清液，用MES溶液清洗3次；(4)取1.09mg/ml多克隆抗體100μ 1，加入已活化的免疫磁小體，室溫震蕩 30min ；(5)磁性分離，收集上清液，用0.02M磷酸緩沖液多次洗滌，得到檢測小鼠組織內 Bt殺蟲蛋白的免疫磁小體。采用本發明制備的檢測小鼠組織內Bt殺蟲蛋白的免疫磁小體，顆粒大小50nm。經化學發光EIA檢測，Bt抗體蛋白包被的磁小體其發光單位為83kCOimtS/ μ g磁小體；發光強度和Bt蛋白濃度相關性表明，隨著蛋白濃度的不斷增加，發光強度的數值不斷減小，范圍在l-103ng/ml，最小檢測濃度是lng/ml，結果見圖4。通過實際檢測不同小鼠組織內的Bt蛋白含量，其結果見表1。表1利用免疫磁小體測定小鼠組織內Bt殺蟲蛋白含量
權利要求
1.用于檢測小鼠組織內Bt殺蟲蛋白的免疫磁小體，其特征在于由抗Bt殺蟲蛋白多克隆抗體包被，包被比例為5 X IO9個磁小體/100 μ g抗體，顆粒大小50nm，最小檢測Bt殺蟲蛋白濃度為lng/ml。
2.權利要求1所述的用于檢測小鼠組織內Bt殺蟲蛋白的免疫磁小體的制備方法，其特征在于制備磁小體的具體步驟如下(1)將濕重25士0.5g凍存的趨磁細菌細胞解凍融化后，懸浮于IOOml的IOmM Tris-HCl, pH 8. 0的緩沖液中，超聲振蕩破碎lOmin，超聲振蕩在Branson model 450、 20kHz ；80W條件下進行，(2)懸浮液離心15min，離心速度為8000轉/g，得到的沉淀用IOOml的IOmMTris-HCl, pH 8.0緩沖液重新懸浮后，再次超聲處理；超聲處理在Branson model 450、20kHz ;80W條件下進行，處理IOmin ；(3)離心后的上清液匯集于燒杯中，置于條形磁鐵上lh，吸去非磁性的液體，磁鐵吸附的磁小體用IOOrnl的IOmM Tris-HCUpH 8. 0緩沖液小心懸浮；(4)重復上述步驟至少10次，純化的磁小體用8，000X g離心15min收集，沉淀用IOmM Tris-HCUpH 8. 0緩沖液懸浮，貯存在-80°C，上述純化步驟都在4°C下進行(5)將弗氏佐劑與Bt殺蟲蛋白按體積1 1混合后免疫小鼠，經分離純化得到鼠抗Bt 殺蟲蛋白多克隆抗體；(6)將鼠抗Bt殺蟲蛋白多克隆抗體，通過羧基-氨基化學偶聯法偶聯磁小體，得到檢測小鼠組織內Bt殺蟲蛋白的免疫磁小體；步驟(1)所述趨磁細菌是 Magnetospirillum magneticum AMB-1，編號 700264。
3.根據權利要求2所述的用于檢測小鼠組織內Bt殺蟲蛋白的免疫磁小體的制備方法， 其特征在于將弗氏佐劑與Bt殺蟲蛋白按體積1 1混合后免疫小鼠，經分離純化得到鼠抗 Bt殺蟲蛋白多克隆抗體的具體步驟如下(1)將Bt殺蟲蛋白與弗氏佐劑按體積1 1混合后，充分乳化，采用背部多點注射法免疫BALB/c小鼠，每次免疫的抗原量為10 μ g，免疫三次，每次免疫兩周后經尾動脈取血檢測抗體效價；(2)以500μ g/ml的抗原包被酶標板，100 μ 1/孔，4°C過夜；(3)洗滌后，加入待檢的血清樣品，100μ1/孔，37°C 1小時；設陰性對照孔；(4)洗滌后，加入HRP標記的羊抗鼠IgG的抗體試劑，100μ 1/孔，37°C避光顯色15分鐘；用2M 終止反應后，閱讀各孔的A490值，通過分析各孔的A490值，檢測制備的鼠抗 Bt殺蟲蛋白多克隆抗體的效價。
4.根據權利要求1所述的用于檢測小鼠組織內Bt殺蟲蛋白的免疫磁小體的制備方法， 其特征在于由鼠抗Bt殺蟲蛋白多克隆抗體制備免疫磁小體的具體步驟如下(1)用30mM、pH= 5的MES緩沖液在外加磁場作用下清洗納米磁小體，使納米磁小體分散于MES緩沖液中，終濃度為40mg/ml ；(2)取納米磁小體100μ1，依次加入50mM EDC、50mM NHS溶液各50 μ 1，室溫震蕩 30min ；(3)在磁感應強度30mT的磁場作用下棄上清液，用MES溶液清洗3次；(4)取1.09mg/ml抗Bt殺蟲蛋白的多克隆抗體100μ 1，加入已活化的納米磁小體，室溫震蕩30min ；(5)磁性分離，收集上清液，用0. 02M磷酸緩沖液多次洗滌，得到免疫磁小體。
5.根據權利要求1所述的用于檢測小鼠組織內Bt殺蟲蛋白的免疫磁小體的制備方法， 其特征在于通過羧基-氨基化學偶聯法偶聯免疫磁小體，得到檢測小鼠組織內Bt殺蟲蛋白的免疫磁小體的具體步驟如下(1)首先用30mM、pH= 5的2-(N-嗎啉)-乙烷磺酸緩沖液在外加磁場作用下清洗免疫磁小體，使免疫磁小體分散于MES緩沖液中，終濃度為40mg/ml ；(2)取100μ 1免疫磁小體緩沖液，依次加入50m碳化二亞胺、50mN-羥基丁二酰亞胺溶液各50 μ 1，室溫震蕩30min ；(3)在磁場作用下棄上清液，用MES溶液清洗3次；(4)取1.09mg/ml多克隆抗體100 μ 1，加入已活化的免疫磁小體，室溫震蕩30min ；(5)磁性分離，收集上清液，用0.02M磷酸緩沖液多次洗滌，得到檢測小鼠組織內Bt殺蟲蛋白的免疫磁小體。
全文摘要
本發明涉及一種用于檢測小鼠組織內Bt殺蟲蛋白的免疫磁小體及其制備方法。免疫磁小體由抗Bt殺蟲蛋白多克隆抗體包被，顆粒大小50nm；制備方法是通過超聲破碎和磁性吸附，獲得趨磁細菌的純化磁小體，將佐劑溶合Bt殺蟲蛋白后免疫小鼠，經分離純化得到鼠抗Bt殺蟲蛋白多克隆抗體，將抗體通過羧基-氨基化學偶聯法偶聯磁小體，得到檢測小鼠組織內Bt殺蟲蛋白的免疫磁小體。用本發明的免疫磁小體，經化學發光EIA檢測，發光單位為83kcounts/μg磁小體；發光強度和Bt蛋白濃度相關性表明，隨著蛋白濃度的不斷增加，發光強度不斷下降，范圍在1-103ng/ml，最小檢測濃度1ng/ml；用于實際檢測小鼠組織內Bt殺蟲蛋白含量靈敏度較高，結果穩定性強且操作簡單，顯示了良好的應用前景。
文檔編號G01N33/68GK102419370SQ20111022151
公開日2012年4月18日 申請日期2011年8月4日 優先權日2011年8月4日
發明者吳剛, 潘衛東 申請人:武漢理工大學