一種多殺性巴氏桿菌間接血凝試驗法的建立方法及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及涉及一種多殺性巴氏桿菌間接血凝試驗法的建立方法及其在多殺性巴氏桿菌疫苗效力檢驗中的應用。該方法以多殺性巴氏桿菌莢膜抗原中的多糖含量為依據，通過篩選間接血凝試驗中抗原最佳稀釋度，建立敏感性、重復性好的穩定的多殺性巴氏桿菌間接血凝試驗法，采用該試驗法檢測疫苗免疫動物血清的間接血凝效價，探索血清間接血凝效價與免疫后強毒攻毒保護率之間的平行關系，并應用于多殺性巴氏桿菌疫苗的效力檢驗。
【專利說明】一種多殺性巴氏桿菌間接血凝試驗法的建立方法及其應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于獸用生物制品檢驗【技術領域】，涉及一種多殺性巴氏桿菌間接血凝試驗 法的建立方法及其在多殺性巴氏桿菌疫苗效力檢驗中的應用。
【背景技術】
[0002]多殺性巴氏桿菌(Pasteurella multocida, Pm)是一類能引起多種畜禽、寵物、野 生動物及人類感染的人畜共患病原菌。研究報道，該病原菌廣泛流行于世界各地，無宿主特 異性，可通過相互接觸經呼吸道進行水平和垂直傳播；Davies等2004年報道該菌甚至可以 在不同的宿主間發生種間傳播。在我國，引起畜禽巴氏桿菌病的主要病原是莢膜血清A型 Pm，其次為莢膜血清D型Pm，引起牛巴氏桿菌病的主要病原是莢膜血清B型Pm，莢膜血清B 型也能引起牛發生肺炎。
[0003]在抗生素耐藥性日益嚴重的情況下，對巴氏桿菌病的控制更依賴于多殺性巴氏桿 菌疫苗。到目前為止，我國已有禽、兔、豬和牛的多殺性巴氏桿菌滅活(或活)疫苗，均具有 良好的臨床效果，為畜禽巴氏桿菌病的控制起到了積極的作用。
[0004]但是，現有技術中，疫苗的效力檢驗均為免疫后強毒攻毒的方法，例如，《中華人民 共和國獸用生物制品規程》(2000年版)中關于豬多殺性巴氏桿菌病滅活疫苗制造及檢驗 規程之效力檢驗。其一種方式是用體重1.5?2kg家兔4只，各皮下或肌肉注射疫苗2ml， 21日后，連同條件相同的對照家兔2只，各皮下注射致死量的C44-1強毒菌液或C44-8強 毒菌液(含活菌800?100個)，觀察8日，對照兔全部死亡，免疫兔至少保護2只為合格。 另一種方法是用體重15?30kg的健康易感豬5頭，各皮下注射疫苗5ml，21日后，連同條 件相同的對照豬3頭，各皮下注射致死量的C44-1強毒菌液，觀察10日，對照豬全部死亡， 免疫豬至少保護4頭；或對照豬死亡2頭，免疫豬全部保護為合格。上述兩種方法均存在費 時費力、增加疫苗生產成本、強毒散毒的風險等問題。
[0005]間接血凝試驗(IHA)于上世紀80年代開始應用于多殺性巴氏桿菌抗體的檢測，例 如,毛春生等人采用間接血凝試驗檢測雞血清中多殺性巴氏桿菌抗體(毛春生,盧中華,崔 保安等，中國獸醫科技，1991，21 (7):29?31)。該方法先采用洗下血液瓊脂平板上的融合 生長培養物，置于56°C水浴中熱浸30分鐘，然后離心取上清來制取熱浸莢膜抗原；采用上 述方法洗下培養物，并于細菌懸液超聲波擊打6分鐘，離心取上清來制取超聲波粉碎抗原； 然后，采用取自健康公綿羊的紅細胞，按文獻《獸醫免疫學實驗指導》的方法進行甲醛化、 戊二醛化或甲醛一戊二醛雙醛化，并分別以熱浸莢膜抗原、超聲粉碎抗原致敏之，致敏后以 I: 10000濃度的酸靴化，以0.0lmol pH6.4，I %血清的PBS洗3次，最后配成I %紅細胞懸 液，由此制得IHA抗原。該方法中致敏用抗原仍無參考標準，反應條件不一致。
[0006]因此，目前存在的問題是需要研究建立一種可用于多殺性巴氏桿菌疫苗效力檢驗 的，操作簡單，成本低廉，無強毒散毒的風險，敏感性及重復性好的穩定的多殺性巴氏桿菌 間接血凝試驗方法。
【發明內容】
[0007]本發明所要解決的技術問題是針對現有技術的不足，提供一種多殺性巴氏桿菌間 接血凝試驗法的建立方法及其在多殺性巴氏桿菌疫苗效力檢驗中的應用。該方法以多殺性 巴氏桿菌莢膜抗原中的多糖含量為依據，通過篩選間接血凝試驗中抗原最佳稀釋度，建立 敏感性、重復性好的穩定的多殺性巴氏桿菌間接血凝試驗法,采用該試驗法檢測疫苗免疫 動物血清的間接血凝效價，探索血清間接血凝效價與免疫后強毒攻毒保護率之間的平行關 系，并應用于多殺性巴氏桿菌疫苗的效力檢驗。
[0008]為此，本發明提供了一種多殺性巴氏桿菌間接血凝試驗法的建立方法，包括:
[0009]步驟A:測定多殺性巴氏桿菌莢膜抗原中莢膜多糖的含量；
[0010]步驟B:使用不同莢膜多糖含量的多殺性巴氏桿菌莢膜抗原致敏綿羊紅血球測定 同一血清樣品的IHA效價，并確定最高血清IHA效價所對應的莢膜多糖含量；
[0011]步驟C:基于最高血清IHA效價所對應的莢膜多糖含量確定間接血凝試驗法中抗 原稀釋度，并建立多殺性巴氏桿菌間接血凝試驗法。
[0012]根據本發明，還包括在步驟A之前進行建立初級多殺性巴氏桿菌間接血凝試驗法 的步驟。
[0013]在本發明的一個實施例中，在建立初級多殺性巴氏桿菌間接血凝試驗法的步驟 中，其結果判定終點為100%凝集。間接血凝試驗是在室溫條件下反應60min或在37°C條 件下反應30min。致敏用多殺性巴氏桿菌莢膜抗原，例如，優選為多殺性巴氏桿菌的熱提取 抗原。
[0014]在本發明的一個具體的實施例中，在建立初級多殺性巴氏桿菌間接血凝試驗法的 步驟中，將待測血清樣品進行2倍梯度稀釋，加入使用多殺性巴氏桿菌莢膜抗原致敏的醛 化綿羊紅細胞，室溫反應60min或37°C反應30min，反應后肉眼直接觀察凝集情況，結果判 定終點為100%凝集。
[0015]在建立初級多殺性巴氏桿菌間接血凝試驗法的步驟中，初級多殺性巴氏桿菌間接 血凝試驗優選96孔V型反應板為媒介。所使用的稀釋液優選為含I % BSA的PBS液。綿羊 紅細胞的醛化優選使用戊二醛溶液進行醛化。
[0016]在本發明的一個優選實施例中，在步驟B中，所述最高血清IHA效價所對應的莢膜 多糖含量為100?200 u g/ml。
[0017]根據本發明方法，例如，優選在步驟A中，采用苯酚-硫酸法測定多殺性巴氏桿菌 莢膜抗原中莢膜多糖的含量。所述苯酹-硫酸法的標準品包括葡聚糖、葡萄糖。優選所述 苯酚-硫酸法的標準品為葡萄糖。
[0018]研究發現，巴氏桿菌莢膜主要由多糖組成，其含量為蛋白質含量的15倍以上，因 此，使用不同莢膜多糖含量的多殺性巴氏桿菌莢膜抗原致敏綿羊紅血球測定同一血清樣品 的IHA效價，并確定最高血清IHA效價所對應的莢膜多糖含量，可以篩選間接血凝試驗法中 抗原最佳稀釋度，并在此基礎上建立敏感性、重復性好的穩定的多殺性巴氏桿菌間接血凝 試驗法。
[0019]本發明還提供了一種根據本發明方法所建立的多殺性巴氏桿菌間接血凝試驗法 在多殺性巴氏桿菌疫苗效力檢驗中的應用，包括:
[0020]步驟1:進行不同劑量的動物免疫及攻毒試驗；[0021]步驟2:測定免疫后多殺性巴氏桿菌IHA效價，并建立多殺性巴氏桿菌IHA效價與強毒攻毒保護率之間的平行關系；
[0022]步驟3:基于多殺性巴氏桿菌IHA效價與強毒攻毒保護率之間的平行關系，確定以多殺性巴氏桿菌間接血凝試驗法替代疫苗效力檢驗中的免疫后強毒攻毒的方法；
[0023]其中，免疫后多殺性巴氏桿菌IHA效價采用根據本發明方法所建立的多殺性巴氏桿菌間接血凝試驗法來測定。
[0024]本發明中，在測定多殺性巴氏桿菌莢膜抗原中莢膜多糖含量，以及測定細菌細胞密度時，采用生物分光光度計(6132, Eppendorf，德國)測量OD (光密度)值。
[0025]研究發現，巴氏桿菌莢膜主要由多糖組成，其含量為蛋白質含量的15倍以上，因此，通過篩選間接血凝試驗中抗原最佳稀釋度，可以建立穩定的多殺性巴氏桿菌間接血凝試驗法，檢測疫苗免疫動物血清的間接血凝效價，探索血清間接血凝效價與免疫后強毒攻毒保護率之間的平行關系，并應用于多殺性巴氏桿菌疫苗的效力檢驗。
[0026]根據本發明方法所建立的多殺性巴氏桿菌間接血凝試驗法成本低，操作簡單，且敏感性及可重復性好，反應時間快，在37°C條件下，30min即可判定結果，將該方法應用于多殺性巴氏桿菌疫苗的效力檢驗，省去強毒攻毒的環節，不僅節約成本，而且降低了強毒散毒的生物風險。
[0027]本發明以多殺性巴氏桿菌莢膜抗原中的多糖含量為依據，通過篩選間接血凝試驗中抗原最佳稀釋度，建立敏感性、重復性好的穩定的多殺性巴氏桿菌間接血凝試驗法，采用該試驗法檢測疫苗免疫動物血清的間接血凝效價，探索血清間接血凝效價與免疫后強毒攻毒保護率之間的平行關系，并應用于多殺性巴氏桿菌疫苗的效力檢驗。該方法也同樣適用于其他有莢膜細菌的間接血凝試驗及其疫苗的效力檢驗。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0028]圖1是多糖含量測定的標準曲線。
[0029]圖2是C51-2株多殺性巴氏桿菌0D600值-細菌數回歸方程曲線。
【具體實施方式】
[0030]下面將結合實施例和附圖來詳細說明本發明，這些實施例和附圖僅起說明性作用，并不局限于本發明的應用范圍。
[0031]實施例
[0032]實施例1:初級多殺性巴氏桿菌間接血凝試驗法的建立
[0033]1.材料
[0034](I)培養基:馬丁瓊脂、改良馬丁肉湯
[0035](2)菌株:C51_2(多殺性巴氏桿菌，菌株保藏編號CVCC499)、BS039(支氣管敗血波氏桿菌，菌株保藏編號HNAU0220)、CMCC44149 (大腸埃希氏菌，菌株保藏編號CVCC20725)， 均購于中國獸醫藥品監察所。
[0036](3)實驗動物:1.5~2.0kg的健康易感兔(購自河南康達實驗動物有限公司) 。
[0037](4)試劑
[0038]磷酸二氫鈉(天津市凱通化學試劑有限公司，分析純，20110308);磷酸二氫鉀(成都市科龍化工試劑廠，分析純，20100125);磷酸氫二鈉(成都市科龍化工試劑廠，分析純， 20091031);戊二醛(批號060318，Green bird進口分裝，上海雙向西巴斯科技發展有限 公司)；鞣酸(天津市博迪化工有限公司，分析純，20090127);氯化鈉(天津市永大化學試 劑有限公司，分析純，20100105) ；TSB (BD Df ico)、TSA (BD Dfico);鋁膠佐劑(ALHYDR0GEL, Brenntag Biosector)。
[0039](5)主要儀器
[0040]恒溫搖床(ExcellaE24R, New Brunswick);生物分光光度計(6132, Eppendorf, 德國)；超凈工作臺(SW-CF-2FD，蘇州安泰)。
[0041]2.方法
[0042](I)莢膜抗原的制備
[0043]將C51-2接種于馬丁瓊脂平板，37°C培16?18h，用生理鹽水4?5ml洗下帶有熒 光的菌苔，置小試管中56°C水浴30分鐘后8000r/min離心20分鐘，上清液即為莢膜抗原， EP管分裝后置2?8°C保存，Iml/只，編號為Rl-Ag。
[0044](2)致敏綿羊紅細胞的制備
[0045]①綿羊紅細胞的采集及洗滌
[0046]將新鮮抗凝綿羊血4°C保存穩定后2000rpm離心IOmin,棄上清及白細胞。用0.15M PH7.2的PBS洗滌3?5次，按體積比配成5%的紅細胞懸液，4°C保存備用。
[0047]②紅細胞的醛化和鞣酸化
[0048]將戊二醛用水按體積比配成2.5%的溶液，4°C保存。
[0049]將4°C預冷的紅細胞懸液置于磁力攪拌器，低速攪拌，按5: I的體積比逐滴加 入4°C預冷的戊二醛溶液。然后將紅細胞懸液于恒溫振蕩器30°C 150rpm醛化5h。用 PBS(0.15mol/L, pH7.2)洗3次，配成5%的紅細胞懸液，4°C保存。取5%醛化紅細胞懸液 與等量新配制的鞣酸(I: 20000)混合，置37°C水浴30min，用PBS (0.15mol/L, pH6.4)洗 3次后，恢復到原體積，4°C保存備用。
[0050]③醛化紅細胞自凝性的檢測
[0051]在96孔V型血凝板上任選3孔，分別滴入稀釋液、4倍稀釋的陰性血清及陽性血清 各25 ill，取醛化的紅細胞0.1mL,加稀釋液0.9mL,混勻后滴入25ul，置振蕩器上混勻，蓋上 玻板室溫下放置2h，觀察紅細胞是否凝集。
[0052]④綿羊紅細胞的致敏
[0053]將5%的鞣酸化綿羊紅細胞與等量10倍稀釋的Rl-Ag抗原液混合，37°C水浴致敏 30min,其間不斷輕輕振蕩,3000r/min離心3min,棄上清,用PBS (0.15mol/L、pH7.2)洗3次 后,再用此稀釋液配成I%的致敏紅細胞懸液。
[0054](3)多殺性巴氏桿菌陽性、陰性血清的制備
[0055]將C51-2、BS039和CMCC44149菌株分別接種于TSA固體培養基，37°C培養18?20h 后取單個菌落分別接種于5mlTSB液體培養基中，37°C 180rpm震蕩培養14?16h，取0.1ml 接種于IOOmlTSB液體培養基中進行擴大培養，37°C，200rpm震蕩IOh后取樣做活菌計數，加 A 0.15%甲醛溶液對菌液滅活24h，根據活菌計數結果將滅活菌液濃縮至100億CFU/ml， 加入20%的鋁膠佐劑，混勻后分別為制備多殺性巴氏桿菌(Pm)血清、支氣管敗血波氏桿菌 (Bb)血清、大腸埃希氏桿菌(E.coli)血清用抗原。[0056]取試驗兔8只，隨機分成4組，2只/組，三組分別接種C51-2、BS039和CMCC44149 抗原，另一組接種無菌生理鹽水，2ml/只，背部皮下注射；14天后相同劑量加強免疫一次， 加強免疫后21天分別采集各免疫組試驗兔血清，即分別為Pm血清、Bb血清、E.coli血清和陰性血清。
[0057](4)微量間接血凝試驗(IHA)方法的建立
[0058]①取含I %牛血清白蛋白的PBS (0.15mol/L、pH7.2) 25 于96孔V型間接血凝板孔中，取Pm血清、Bb血清、E.coli血清和陰性血清25 U I分別加于第一排、第二排、第三排、第四排的第I ?L，倍比稀釋至第11孔，第12孔作為空白對照，每孔加25 Ul致敏紅細胞懸液。在微型振蕩器上輕振lmin，使其充分混合，37°C孵育30min或室溫孵育60min后觀察結果。用“_”、“++”、“+++”、“#”表示紅細胞的凝集強度。②判定標準:“#”表示凝集的紅細胞呈薄膜狀均勻鋪滿孔底，強凝集時，凝集皺縮成團。“+++”表示凝集的紅細胞鋪滿孔底， 但中央有少量紅細胞沉降成小圓點。“ ++ ”表示紅細胞沉于孔底中央,周圍仍然有散在的凝集紅細胞。表示紅細胞全部沉在孔底中央，周圍無散在的紅細胞。以出現“#”的血清最高稀釋倍數為該血清的血凝效價。
[0059]3.結果
[0060]間接血凝試驗方法的檢測結果:使用Rl-Ag的10倍稀釋液致敏的綿羊紅血球，對各待檢血清樣品的檢測結果為，37°C作用30min和室溫作用60min后，空白對照孔的血球均完全沉降為一個小圓點，以100%凝集為判定終點，Pm血清的IHA效價為1: 26，Bb血清、 E.coli血清和陰性血清均為陰性(詳見表1)，且37°C作用30min和室溫作用60min后的結果一致，表明該方法具有很好的特異性和穩定性。
[0061]表1:間接血凝試驗方法的檢測結果
[0062]
【權利要求】
1.一種多殺性巴氏桿菌間接血凝試驗法的建立方法,包括:步驟A:測定多殺性巴氏桿菌莢膜抗原中莢膜多糖的含量；步驟B:使用不同莢膜多糖含量的多殺性巴氏桿菌莢膜抗原致敏綿羊紅血球測定同一 血清樣品的IHA效價，并確定最高血清IHA效價所對應的莢膜多糖含量；步驟C:基于最高血清IHA效價所對應的莢膜多糖含量確定間接血凝試驗法中抗原稀 釋度，并建立多殺性巴氏桿菌間接血凝試驗法。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于:還包括在步驟A之前進行建立初級多殺 性巴氏桿菌間接血凝試驗法的步驟。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于:在建立初級多殺性巴氏桿菌間接血凝試 驗法的步驟中，其結果判定終點為100 %凝集。
4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于:間接血凝試驗是在室溫條件下反應60min 或在37 °C條件下反應30min。
5.一種根據權利要求1?4中任意一項所述的方法所建立的多殺性巴氏桿菌間接血凝 試驗法在多殺性巴氏桿菌疫苗效力檢驗中的應用，包括:步驟1:進行不同劑量的動物免疫及攻毒試驗；步驟2:測定免疫后多殺性巴氏桿菌IHA效價，并建立多殺性巴氏桿菌IHA效價與強毒 攻毒保護率之間的平行關系；步驟3:基于多殺性巴氏桿菌IHA效價與強毒攻毒保護率之間的平行關系，確定以多殺 性巴氏桿菌間接血凝試驗法替代疫苗效力檢驗中的免疫后強毒攻毒的方法；其中，免疫后多殺性巴氏桿菌IHA效價采用根據權利要求1所述的方法所建立的多殺 性巴氏桿菌間接血凝試驗法來測定。
【文檔編號】G01N33/569GK103513031SQ201210207835
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2012年6月21日 優先權日:2012年6月21日
【發明者】張許科, 孫進忠, 白朝勇 申請人:普萊柯生物工程股份有限公司