亮氨酰tRNA合成酶的新用途
【專利摘要】本發明涉及亮氨酰tRNA合成酶的新用途，更具體而言，涉及mTORC1介導疾病的預防或治療用試劑的篩選方法，該方法對抑制LRS與RagD或RagD?GTP酶的結合能力的測試試劑進行篩選；以及涉及相對于對照組減小細胞的尺寸的方法，該方法包括抑制細胞內LRS的表達。本發明的方法提供調節細胞尺寸的新方法，此外所述篩選方法能夠用于治療癌等疾病的新型試劑的開發中。
【專利說明】亮氨酰tRNA合成酶的新用途
【技術領域】
[0001]本申請要求2011年09月22日提交的韓國專利申請第10-2011-0095893號的優先權及其權益，在此出于所有目的通過援引將其并入，其等同于在本文完整描述。
[0002]本發明涉及亮氨酰tRNA合成酶的新用途，更具體而言，涉及mTORCl介導疾病的預防或治療用試劑的篩選方法，該方法對抑制LRS與RagD或RagD GTP酶(GTPase)的結合能力的測試試劑進行篩選；以及涉及相對于對照組減小細胞的尺寸的方法，該方法包括抑制細胞內LRS的表達。
【背景技術】
[0003]亮氨酸為三個支鏈氨基酸之一。與其它氨基酸不同，亮氨酸和其它支鏈氨基酸(異亮氨酸及纈氨酸)因支鏈氨基酸轉氨酶的缺陷而不參與肝代謝，對肌肉蛋白質合成產生直接的影響。亮氨酸不僅充當蛋白質合成的基質，而且被認為是有力的調節蛋白質代謝的信號營養素。亮氨酸的口服施用會增加鼠的骨骼肌蛋白質合成的速率(Crozier SJ等，J Nutr.135(2005)，376-382)，若從完全飲食去除亮氨酸則避免了對蛋白質合成的刺激(Stipanuk MH., Nutr Rev.65 (2007)，122-129)。由亮氨酸誘導的蛋白質合成受到由雷帕霉素哺乳動物革巴標(mTOR)、雷帕霉素哺乳動物革巴標的調節相關蛋白(Raptor)、G蛋白β亞基樣蛋白(Gi3L)和富集在腦內的Ras同系物(Rheb)構成的mTOR復合物I (mTORCl)的影響(Bgaskar PT 等，The two TORCs and Akt.Dev Cell、12(2007)，487-502)。mTORCl 將 S6K和4E-BP磷酸化(翻譯過程的速度決定步驟)，引起展示出5’帽結構的mRNA的翻譯起始(Ma XM, Nat Rev Mol Cell Biol.10(2009), 307-318 ；Holz MK等，Celll23 (2005)，569-580頁)。
[0004]mTORCl通過協調數種上游輸入(如生長因子、細胞內能量狀態和氨基酸可及性)來調節翻譯和細胞生長。結節性硬化復合物(TSC) I和TSC2調節Ras樣GTP酶、Rheb的GTP/⑶P交換，從而將生長因子和細胞內能量信號傳遞至mTORCl。與GTP結合時，Rheb與mTORCl相互作用并使其活化(Tee AR等，Curr Biol.13 (2003)，1259-1268)，并且對于mTORCl受所有信號(包括氨基酸可及性)的活化而言可能是必要的。相比之下，TSC1-TSC2對于mTORCl受氨基酸的調節而言是可有可無的，且在缺乏TSC2的細胞中，mTORCl路徑對于氨基酸匱乏敏感，但是對于生長因子脫除(withdrawal)具有抵抗性(Roccio M等，Oncogene.25(2006)，657-664)。
[0005]最近，也作為GTP結合蛋白的Ras家族成員的Rag GTP酶據顯示是mTORCl途徑的氨基酸特異性調節物(Sancak Y等，CellHl (2010)，290-303)。哺乳動物表達4種Rag蛋白(RagA、RagB、RagC和RagD),其形成由RagA或RagB與RagC或RagD構成的異二聚體。如RagA和RagB那樣，RagC和RagD相互極其類似,在功能是冗余的(Schurmann A等，JBiol Chem.270 (1995)，28982-28988)。包含結合有 GTP 的 RagB 的 Rag 異二聚體與 mTORCl相互作用，并且氨基酸通過增進RagB的GTP加載而誘導mTORCl-Rag相互作用，這使其與mTORCl 的Raptors成分直接相互作用(Sancak Y，CellHl (2010)，290-303 ；Kim E，Nat CellBiol.10(2008) ,935-945)。mTORCl路徑受氨基酸的活化與mTORCl從不限定的位置向包含Rab7 的區室的移動有關(Sancak Y 等，Science320 (2008)，1496-1501)，Rab7 是晚期內體和溶酶體的標記物(Bucci C等，Mol Biol Cell，11 (2000)，467-480)。最近的報告顯示，氨基酸誘導mTORCl向RagGTP酶所駐留的溶酶體移動。由MAPKSP1、R0BLD3以及cllorf59基因產物構成的調節復合體與RagGTP酶相互作用并將其募集至溶酶體，這對mTORCl活化至關重要(Sancak Y等，CellHl (2010)，290-303)。但是，尚不知道細胞內亮氨酸如何被感受以進行mTORCl的活化，以及Rag GTP酶的GTP/⑶P循環如何被氨基酸所調節以進行mTORCl的活化。
[0006]氨酰tRNA合成酶(ARS)對于細胞蛋白質合成和活力是必須的酶，其催化特定氨基酸與它們的同源tRNA的連接。酶反應分為2個步驟:為了氨基酸的活化的ATP-PPi交換反應，和 tRNA 的氨酸化(aminoacylation) (Park S 等,Trends Biochem Sc1.30 (2005),569-574)。基于氨基酸序列的比對和結構特性，ARS被分成兩個類別(Eriani G等，Nature347(1990)，203-206 ；Burbaum JJ 等，J Biol Chem.266(1991)，16965-16968)。I 類合成酶共享 2 個共有序列(HIGH(His-1le-Gly-His)和 KMSKS(Lys-Met-Ser-Lys-Ser)基序)，這些共有序列形成核苷酸結合性羅斯曼折疊(Rossman fold) (Arnez JG等，TrendsBiochem sc1.22 (1997)，211-216)。相比之下，II類合成酶不包含羅斯曼折疊，但共享極其不同的催化結構域(Cusack S 等，Nucl Acids Res.19 (1991)，3489-3498)。亮氨酸 tRNA合成酶(LRS)是I類酶，其由HIGH和KMSKS基序所表征(Cusack S等，EMBO J.19(2000)，2351-2361)。在結構上，LRS由二部羅斯曼折疊的催化結構域組成，該二部羅斯曼折疊具有稱為CPl的大插入結構域(tRNA結合性反密碼子結構域)和C末端擴展結構域(Cusack S等，EMBO J.19 (2000) ,2351-2361)。在高等真核細胞中，LRS作為ARS復合體的成分存在，該ARS復合體由9個不同的tRNA合成酶和3個非酶成分(pl8/AIMP3、p38/AIMP2以及p43/AIMP1)構成(Lee SW 等，J Cell Sc1.117 (2004), 3725-3734 ；Park S 等，Trends BiochemSc1.30(2005),569-574 ；Park SG 等，Proc Natl Acad Sci USA105 (2008)，11043-11049)。據顯示，LRS的C末端結構域對于與ARS復合體的其它成分的相互作用很重要(Ling C等，JBiol Chem.280 (2005)，34755-3463)。在該復合體的成分中，各個不同的成分參與各種各樣的細胞信號傳導過程(Lee YN等，Immunity20 (2004), 145-151 ；Park S 等，Trends BiochemSc1.30(2005), 569-574 ；Park SG 等，Proc Natl Acad Sci USA105(2008)，11043-11049)。例如，谷氨酰-脯氨酰tRNA合成酶(EPRS)通過形成干擾素Y激活的翻譯抑制子(GAIT)復合體而抑制靶標炎性mRNA的翻譯(Sampath P等，Cell.119 (2004)，195-208)。賴氨酰tRNA合成酶(LRS)和其產物Ap4A通過調節基因表達而在免疫響應中起到信號傳導調節物的作用(Lee YN 等,Immunity20 (2004), 145-151 ；Yannay-Cohen N 等，Mol Cell34 (2009),603-611)。甲硫氨酰tRNA合成酶(MRS)和谷氨酰氨酰tRNA合成酶(QRS)分別參與rRNA生物發生(Ko YG等，J Cell Bioll49 (2000), 567-574)和抗凋亡性信號調節(Ko YG等，JBiol Chem276 (2001) ,6030-6036)。此外，據報道，胞質LRS有可能牽涉肺癌生長(Shin SH等，Exp Mol Med.40 (2008)，229-236)，且線粒體LRS可能與糖尿病相關(’t Hart LM等，Diabetes.54(2005)，1892-1895 ;Li R.等，MolCell Biol.30 (2010)，2147-2154)。
【發明內容】
[0007]發明要解決的課題
[0008]本發明人對LRS的不同于其對于蛋白質合成的催化功能的非典型功能進行了研究。在該研究中，發明人發現LRS是mTORCl相關蛋白并且對于由氨基酸誘導的mTORCl活化起到至關重要的作用。另外，對LRS的亮氨酸結合能力的消除會使mTORCl路徑對于氨基酸去敏化(desensitized)。在mTORCl的成分中，發明人發現LRS以氨基酸依賴性方式與Rag GTP酶直接相互作用，并且充當Rag GTP酶的GTP酶活化蛋白(GAT)而使mTORCl活化，由此完成了本發明。
[0009]因此，本發明的目的在于提供一種篩選用于預防和治療mTORCl介導的疾病的試劑的方法，所述方法包括以下步驟:
[0010](a)使LRS (亮氨酰tRNA合成酶)和RagD在有測試試劑或無測試試劑的條件下接觸；
[0011](b)對有測試試劑時LRS和RagD間的結合親和力與無測試試劑時LRS和RagD間的結合親和力進行比較；和
[0012](C)測定LRS和RagD間的結合親和力的變化。
[0013]本發明的另一目的在于提供一種相對于對照組減小細胞的尺寸的方法，所述方法包括抑制細胞內LRS的表達。
[0014]本發明的另一目的在于提供一種篩選用于預防和治療mTORCl介導的疾病的試劑的方法，所述方法包括以下步驟:
[0015](a)使LRS (亮氨酰tRNA合成酶)和RagD在有測試試劑或在無測試試劑的條件下接觸；
[0016](b)對有測試試劑時LRS和RagD間的結合親和力與無測試試劑時LRS和RagD間的結合親和力進行比較；和
[0017](C)鑒定出抑制LRS和RagD間的結合親和力的測試試劑。
[0018]用于解決課題的方案
[0019]為了達到上述目的，本發明提供一種篩選用于預防和治療mTORCl介導的疾病的試劑的方法，所述方法包括以下步驟:
[0020](a)使LRS (亮氨酰tRNA合成酶)和RagD在有測試試劑或無測試試劑的條件下接觸；
[0021](b)對有測試試劑時LRS和RagD間的結合親和力與無測試試劑時LRS和RagD間的結合親和力進行比較；和
[0022](c)測定LRS和RagD間的結合親和力的變化。
[0023]為了達到本發明的另一目的，本發明提供一種相對于對照組減小細胞的尺寸的方法，所述方法包括抑制細胞內LRS的表達。
[0024]為了達到本發明的另一目的，本發明提供一種篩選用于預防和治療mTORCl介導的疾病的試劑的方法，所述方法包括以下步驟:
[0025](a)使LRS (亮氨酰tRNA合成酶)和RagD在有測試試劑或在無測試試劑的條件下接觸；
[0026](b)對有測試試劑時LRS和RagD間的結合親和力與無測試試劑時LRS和RagD間的結合親和力進行比較；和[0027](c)鑒定出抑制LRS和RagD間的結合親和力的測試試劑。
[0028]下面，詳細說明本發明。
[0029]本發明首次查明，亮氨酰tRNA合成酶(LRS)在氨基酸誘導的mTORCl活化方面起著關鍵作用。即，發明人查明，本發明的LRS以氨基酸依賴性方式與Rag GTP酶(其為向mTORCl的信號傳導的介導物)直接結合，并且充當Rag GTP酶的GTP酶活化蛋白(GAP)以使mTORCl活化。
[0030]本發明人確認，亮氨酰tRNA合成酶(LRS)在由氨基酸誘導的mTORCl的活化中起到關鍵作用，LRS感知細胞內的亮氨酸濃度，并介導由亮氨酸誘導的mTORCl的活化。更具體而言，發明人確認，LRS以氨基酸依賴性方式與Rag GTP酶(其為向mTORCl的信號傳導的介導物)直接結合，并且充當Rag GTP酶的GTP酶活化蛋白(GAP)以使mTORCl活化。
[0031]定義
[0032]只要沒有其它定義，則本說明書中使用的所有科技用語具有與本領域技術人員通常理解的相同的含義。下述參考文獻為本領域技術人員提供了本發明中使用的許多術語的一般性定義:Singleton 等，DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR B10L0TY(第二版，1994) ；THE CAMBRIDGE DICTIONARY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY (Walker 編著，1988)；和 Hale&Marham，THE HARPER COLINS DICTIONARY OF BIOLOGY。另外，提供下述定義以幫助讀者實施本發明。
[0033]如本發明所用，“表達”是指由在細胞中形成蛋白質或核酸。
[0034]如本發明所用，“宿主細胞”是指包含通過任意手段(例如電穿孔、磷酸鈣沉淀、顯微注射、轉化和/或病毒感染等)導入細胞內的異源性DNA的原核或真核細胞。
[0035]在本文中，術語“多肽”與術語“多種多肽”或“(一種或多種)蛋白質”互換性地使用，并且是指例如通常見于自然界中的蛋白質那樣的氨基酸殘基的聚合物。
[0036]術語“LRS多肽”是指稱作亮氨酰tRNA合成酶的多肽。上述LRS多肽可以是具有SEQ NO:1 (Genbank登記號NP_064502.9)的氨基酸序列的多肽。并且本發明的LRS包含其功能等價物。
[0037]上述功能等價物是指具有至少70%氨基酸序列同源性(即同一性)、優選至少80 %、更優選至少90%的氨基酸序列同源性(例如，70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%,77%,78%,79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%的氨基酸序列同源性)的多肽，其與SEQ NO:1的多肽顯示出基本相同的生理活性。此處，“基本相同的生理活性”是指:與RagD結合，并充當Rag GTP酶的GTP酶激活蛋白(GAP)以使T0RC1活化。上述功能等價物可以包括例如因SEQ NO:1中某些氨基酸的添加、取代或缺失而生成的肽。上述之中，氨基酸的取代優選為保守取代。天然存在的氨基酸的保守取代的示例如下:脂肪族氨基酸(Gly、Ala、Pro)、疏水性氨基酸(Ile、Leu、Val)、芳香族氨基酸(Pyr、Tyr、Trp)、酸性氨基酸(Asp、Glu)、堿性氨基酸(His、Lys> Arg、Gin、Asn)和含硫氨基酸(Cys> Met)。此外，功能等價物還包括本發明的LRS的氨基酸序列的一部分缺失的變體。氨基酸的缺失或取代優選位于不與本發明的多肽的生理活性直接相關的區域。并且氨基酸的缺失優選位于不直接參與LRS的生理活性的部分。另外，功能等價物還包括在LRS的氨基酸序列的兩端末或序列內添加了若干個氨基酸的變體。此外，本發明的功能等價物還包括在維持本發明的多肽的基本骨架和其生理活性的同時對本發明的多肽的部分化學結構進行了修飾的多肽衍生物。例如，這種修飾的實例包括用于使本發明的多肽的穩定性、儲藏性、揮發性或溶解度等改變的結構修飾。
[0038]序列同一性或同源性在本文中如下定義:在進行序列比對并在必要時導入空位(gap)以獲得最大百分比序列同一性后，候選序列中與LRS的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)相同的的氨基酸殘基的百分比，并且不考慮保守取代作為序列同一性的部分。此外，LRS的氨基酸序列的N-末端、C-末端或內部的延伸、缺失或插入不應認為會對序列同一性或同源性產生影響。因此，序列同一性可以通過通常用于對兩個多肽的氨基酸位置的相似性進行比較的標準方法來確定。利用如BLAST或FASTA等計算機程序，可以對兩個多肽進行比對以便對其各自的氨基酸進行最佳地匹配(沿著一個或兩個序列的全長序列，或沿著一個或兩個序列的預先確定的部分)。上述程序提供默認開放罰分(default opening penalty)和默認空位罰分(default gap penalty),以及能夠與計算機程序一起共同使用的如PAM250 (標準記分矩陣；參見 Dayhoff 等，Atlas of Protein Sequence and Structure,第 5 卷，增刊3,1978)等記分矩陣。例如，百分比同一性可以如下計算。將同一性匹配的總數乘以100，然后除以以下兩者的總和:匹配跨度(matched span)內的更長的序列的長度，和為了比對兩個序列而導入所述更長序列內的空位數。
[0039]本發明的多肽可以分離自天然材料，或者可以通過基因工程的方法制備。例如，根據常規方法構建了編碼LRS或其功能等價物的DNA分子(例如，在LRS的情況下為SEQ ID N0:2(Genbank 登記號 ΝΜ_020117.9)，在 RagD 的情況下為 SEQ ID NO: 3 (Genbank登記號NM_021244.4))。DNA分子可以通過使用適當的引物進行PCR而合成。作為另一選擇，也可以利用通過本領域所公知的標準方法，例如使用自動DNA合成儀(可商購自Biosearch或Applied Biosystems)來合成DNA分子。所構建的DNA分子被插入下述載體并用所得的重組表達載體來轉化宿主細胞，所述載體包含至少一個表達控制序列(例如啟動子、增強子)，該表達調節序列與DNA序列可操作地連結從而控制所述DNA分子的表達。將轉化的細胞在適合上述DNA序列表達的培養基和條件下進行培養，并從培養基收集由所述DNA序列表達的基本純的多肽。純多肽的收集可以利用本領域所公知的方法(例如色譜)進行。在這方面，術語“基本純的多肽”是指基本不含源自宿主細胞的其它任何蛋白質的本發明的多肽。對于合成本發明的多肽的基因工程學方法，讀者可以參考下述文獻:Maniatis 等，Molecular Cloning ；A laboratory Manual, Cold Spring Harborlaboratory, 1982 ;Sambrook 等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Cold SpringHarbor Press、N.Y.,第二版(1998)和第三版(2000) ；Gene Expression Technology,Method in Enzymology, Genetics and Molecular Biology, Method in Enzymology,Guthrie&Fink(編著)，Academic Press, San Diego, Calif, 1991 ;和 Hitzeman 等，J.Biol.Chem.,255:12073-12080,1990。
[0040]本發明的多肽可以通過本領域所公知的任何技術來容易地進行化學合成(Creighton, Proteins: Structures and Molecular Principles, ff.H.Freemanand C0.,NY, 1983)。作為典型技術，包括但不限于液相或固相合成、片段縮合、F-MOC或T-BOC化學法(Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins,Williams等編著，CRC Press,Boca Raton Florida, 1997 ；A Practical Approach,Atherton 和 Sheppard編著，IRL Press, Oxford,英國，1989)。
[0041]術語“核酸”、“DNA序列”或“多核苷酸”是指處于單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，并且只要沒有其它限制，還包括以與天然存在的核苷酸類似的方式雜交到核酸中的已知天然核苷酸類似物。
[0042]術語“編碼LRS或功能等價物的多核苷酸”可以為編碼下述多肽的核酸:具有SEQID NO:1的氨基酸序列的多肽，或與該多肽具有至少70%的氨基酸序列同源性的多肽。上述核酸包括DNA、cDNA或RNA。多核苷酸可以具有編碼以下氨基酸序列的核苷酸序列:SEQID NO:1的氨基酸序列，或與其具有至少70%的氨基酸序列同源性的氨基酸序列。優選地，多核苷酸包含SEQ ID N0:2的核苷酸序列。上述核酸可以分離自天然來源或者通過本領域已知的基因工程方法進行制造。
[0043]術語“類似物”在本文中用于指下述分子:該物質與參照分子在結構上類似，但是其已通過用替代性取代基替換了參照分子的特定取代基而以靶向和受控方式進行了修飾。與參照分子比較時，本領域技術人員可預期，類似物會展示出相同、類似或者提高的功用性。為鑒定具有改善的性狀(例如對于靶分子的更高的結合親和力)的已知化合物的變體而進行類似物的合成和篩選是藥物化學領域所公知的方法。
[0044]術語“同源性”在涉及蛋白和/或蛋白序列時是指其天然或人工地源自共同的祖蛋白或蛋白序列。類似地，當核酸和/或核酸序列天然或人工地源自共同的祖核酸或核酸序列時，其是同源的。
[0045]如本文所用，“接觸”具有其通常含義，是指使2種以上的試劑(例如2種多肽)組合，或者使試劑和細胞(例如蛋白質和細胞)結合。接觸可以在體外發生，例如，在試管或其它容器中使2種以上的試劑組合，或者使測試試劑和細胞或細胞溶解物組合。此外，接觸也可以在細胞中或原位發生，例如，使編碼2種多肽的重組多核苷酸在細胞內共表達，由此使所述2種多肽在細胞或細胞溶解物中接觸。
[0046]術語“試劑”或“測試試劑”包括任意的物質、分子、元素、化合物、實體或這些的組合。其包括例如蛋白質、多肽、有機小分子、多糖類、多核苷酸等，但不限定于此。其可以為天然產物、合成化合物或化學化合物或2種以上物質的組合。只要沒有特別指定，術語“試劑”、“物質”和“化合物”能夠互換地使用。
[0047]更具體地，能夠利用本發明的方法鑒定的測試試劑包括:多肽、β_轉角模擬物(beta-turn mimetics)、多糖類、磷脂、激素、前列腺素、類固醇、芳香族化合物、雜環化合物、苯并二氮卓、低聚N-取代甘氨酸、低聚氨基甲酸酯、多肽、糖類、脂肪酸、類固醇、嘌呤、嘧啶或它們的衍生物、結構類似物或組合。某些測試試劑可以是合成分子，而其它可以是天然分子。上述測試試劑可以從包括合成或天然化合物的文庫的各種來源獲得。對于能夠利用分步方式合成的多種化合物類型，可以生成組合文庫。大的化合物組合文庫的可以通過 TO95/12608、W095/12608、W093/06121、W094/08051、W095/395503 和 W095/30642 中所述的編碼合成文庫(ESL)法來構建。肽文庫也可以通過噬菌體展示法(參見例如，Devlin,W091/18980)來產生。細菌、真菌、植物和動物提取物形式的天然化合物文庫可以由商業來源獲得，或者可以在現場收集。為了制造結構類似物，可以對已知的藥物學試劑進行定向或隨機的化學修飾，如酰基化、烷基化、酯化、酰胺化。
[0048]上述測試試劑可以是天然存在的蛋白質或其片段。這樣的測試試劑可以獲自天然來源，例如細胞或組織裂解物。多肽試劑文庫也可以由商購的cDNA文庫制備或者利用常規方法生成。測試試劑也可以為肽，例如具有約5個至30個氨基酸、優選約5個至20個氨基酸、進而優選約7個至15個氨基酸的肽。上述肽可以是天然存在的蛋白質、無規肽或“偏性(biased) ”無規肽的消化物。
[0049]測試試劑可以為“核酸”。核酸測試試劑可以是天然存在的核酸、無規核酸、或“偏性”無規核酸。例如，如上文關于蛋白所述，可以類似地使用原核或真核基因組的消化物。
[0050]在某些優選方法中，測試試劑可以為小分子(例如分子量不超過約1，000的分子)。優選地，高通量檢測被適用于篩選此類小分子。此類篩選可以利用許多檢測，例如 Shultz (1998)Bioorg.Med.Chem.Lett.,8:2409-2414 ;Weller (1997)Mo1.Drivers.,3:61-70 ;Fernandes (1998)Curr.0pin.Chem.Biol., 2:597-603 ；和Sittampalam(1997)Curr.0pin.Chem.Biol.,1:384-91 中所述。
[0051]本發明的測試試劑篩選方法的文庫可以基于對LRS或片段或其類似物的結構研究來進行準備。這樣的結構研究使得可以鑒定出能夠與LRS結合的測試試劑。
[0052]LRS的三維結構可以以各種方式(例如晶體結構和分子建模)進行研究。利用X射線結晶學的蛋白質結構研究方法在文獻中是眾所周知的。參見Physical Bio-Chemistry,Van Holde,K.E.(P rentice-HalI, New Jerseyl971),第221-239頁 jPPhysical Chemistrywith Applications to the Life Sciences, D.Eisengerg&D.C.Crothers(BenjaminCummings,Menlo Parkl979)。LRS的結構的計算機建模提供了用于設計LRS篩選用測試試劑的另一種手段。分子的建模方法已描述于文獻中，例如，標題為“System and method formolecular modeling utilizing a sensitivity factor，，的美國專利第 5，612，894 號和標題為 “Molecular modeling method and system” 的美國專利第 5，583，973 號。另外,蛋白質結構也可以由中子衍射和核磁共振(NMR)來確定，參見例如，Physical Chemistry,第4版，]\100代，￥.]\ (Prentice-HalI, New Jerseyl972);和匪1? of Proteins and NucleicAcids, K.Wuthrich(ffiIey-1nterscience, New Yorkl986)。
[0053]下面，詳細說明本發明。
[0054]本發明提供一種篩選用于預防和治療mTORCl介導的疾病的試劑的方法，所述方法包括以下步驟:
[0055](a)使LRS和RagD與測試試劑一起或在無測試試劑的條件下接觸；
[0056](b)對有測試試劑時LRS和RagD間的結合親和力與無測試試劑時LRS和RagD間的結合親和力進行比較；和
[0057](c)測定LRS和RagD間的結合親和力的變化。
[0058]本發明中，Rag蛋白質屬于Ras小GTP酶的Rag亞家族，存在RagA、RagB> RagC>RagD這四種Rag。其中，A和B是酵母的Gtrlp GTP酶的直系同源物(ortholog)，C和D是酵母的Gtr2p GTP酶的直系同源物。RagD與A或B結合形成二聚體，介導氨基酸對mTORCl途徑的活化(Trends in Biochemical Sciences, 33:565-568，2008)。優選地，Rag 可以為RagD。
[0059]已知mTOR(雷帕霉素的哺乳動物靶標)與癌、移植物排斥、自身免疫疾病、糖尿病、肥胖癥、心血管疾病、神經系統異常、老化等疾病有關(Drug DiscoverryToday, 12:112-124,2007)。因此，本發明的mTOR介導疾病可以為癌、自身免疫疾病、糖尿病、肥胖癥、心血管疾病。
[0060]具體地說，癌包括但不限于黑色素瘤、白血病、結腸癌、肺癌、肝癌、胃癌、食道癌、胰腺癌、膽囊癌、腎癌、膀胱癌、前列腺癌、睪丸癌、宮頸癌、子宮內膜癌、絨毛膜癌、卵巢癌、乳腺癌、甲狀腺癌、腦腫瘤、頭頸部癌、皮膚癌、淋巴瘤，并且其還包括B細胞贅生物(如前體B細胞贅生物)、T細胞和NK細胞贅生物(如前體T細胞贅生物)及霍奇金淋巴瘤(霍奇金病)(如經典霍奇金淋巴瘤)。
[0061]可以利用本領域所公知的各種生物化學和分子生物學技術或檢測來實施本發明。此類技術描述于 Sambrook 等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Cold SpringHarbor Press, N.Y.,第二版(1989)和第三版(2000);和 Ausubel 等，Current Protocolsin Molecular Biology, John ffiley&Sons, Inc., New York(1987-1999)。
[0062]優選的是，首先檢測測試試劑的調節LRS的生物化學活性的能力(第一檢測步驟)。具體地說，在第一步驟中，通過檢測在測試試劑的存在下分離的LRS的生物活性，從而鑒定調節所述多肽的生物活性的調節劑。更優選地，本發明可以包括:
[0063](a)在測試試劑的存在下使LRS與測試試劑接觸；和
[0064](b)測定LRS的活性，選擇出改變LRS的活性的測試試劑。
[0065]更優選地，本發明可以包括:
[0066](a)使LRS (亮氨酰tRNA合成酶)和RagD與測試試劑一起或在無測試試劑的條件下接觸；
[0067](b)對有測試試劑或沒有測試試劑時LRS和RagD間的結合親和力進行測定；
[0068](c)對有測試試劑時LRS和RagD間的結合親和力與無測試試劑時LRS和RagD間的結合親和力進行比較；和
[0069](d)對有測試試劑時LRS和RagD間的結合親和力與無測試試劑時LRS和RagD間的結合親和力的變化進行測定。
[0070]在第一步驟中，可以檢測對于LRS的各種生物活性的調節。例如，可以檢測測試試劑的調節LRS表達水平的活性(例如轉錄或翻譯)。也可以檢測測試試劑在調節LRS的細胞內水平或穩定性方面的活性(例如翻譯后的修飾或水解)。
[0071]通過第一檢測步驟鑒定出使LRS的生物活性增加的調節制劑，然后使其在LRS的存在下進行進一步測試，以檢測其是否具有與Rag(更確切為RagD (或RagD GTP酶)結合的能力(第二試驗步驟)。
[0072]上述第一步驟和第二步驟中均可以使用完整LRS和亞基或其片段、類似物或功能衍生物。這些檢測中能夠使用的片段通常保有LRS的一種或多種生物學活性。包含上述片段或類似物的融合蛋白也可以在測試試劑的篩選中使用。LRS的功能衍生物具有氨基酸缺失和/或插入和/或取代，同時保有一種或多種生物活性，因而也能夠用于本發明的篩選方法的實施中。
[0073]可以使用各種公知技術來鑒定出調節LRS的測試試劑。優選的是，測試試劑可以通過基于細胞的檢測系統進行篩選。例如，在典型的基于細胞的檢測中(即第二篩選步驟中)，在測試試劑的存在下測定報告基因活性(即酶活性)，然后將其與不存在測試試劑時的報告基因的活性進行比較。報告基因能夠編碼本領域所公知的任意可檢測多肽(響應或報告多肽)，例如能夠通過熒光或磷光檢測出的多肽、能夠通過其具有的酶活性而檢測出的多肽。可檢測的響應多肽例如為熒光素酶、α -葡萄糖醛酸酶、α -半乳糖苷酶、氯霉素乙酰轉移酶、綠色熒光蛋白、增強型綠色熒光蛋白和人分泌的堿性磷酸酶。
[0074]在基于細胞的檢測中，測試試劑(例如肽或多肽)可以由也存在于宿主細胞內的不同載體表達。某些方法中，測試試劑的文庫可以由上述載體的文庫(例如cDNA文庫；參見下文實施例)編碼。上述文庫可以利用本領域所公知的方法進行制造(參見例如，SambiOOk等和Ausubel等，見上文)，或者可以由各種商業來源獲得。
[0075]除了上述基于細胞的檢測以外，還可以利用不基于細胞的方法進行篩選。這些方法例如包括遷移率變動DNA結合檢測、甲基化和尿嘧啶干擾檢測、DNA酶和羥基自由基足跡分析、熒光偏振和紫外線交聯或化學交聯劑。一般性綜述參見例如上文的Ausubel等(第12章，DNA-Protein Interactions)。一種用于分離共結合蛋白(包括核酸和DNA/RNA結合蛋白)的技術包括對紫外線交聯或化學交聯劑的利用(包括例如，可切割交聯劑二硫代雙(琥珀酰亞氨基丙酸酯)和3，3’ - 二硫代雙(磺基琥珀酰亞氨基丙酸酯))；參見例如，McLaughlin, Am.J.Hum.Genet., 59:561-569，1996 ；Tang, Biochemistry, 35:8216-8225，1996 ；Lingner, Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.,93:10712, 1996 ;和 Chodosh, Mol.Cell.Biol.,6:4723-4733, 1986。
[0076]第一檢測步驟:調節LRS的測試試劑的篩詵(可詵)
[0077]許多檢測系統能夠適用于篩選用于LRS的調節物的測試試劑。如上所述，篩選可以利用體外檢測系統或基于細胞的檢測系統。該篩選步驟中，可以針對與LRS的結合、LRS的細胞水平變化、或LRS的其它生物活性的調節對測試試劑進行篩選。
[0078]I)與LRS結合的測試試劑的篩選
[0079]在第一篩選步驟中，可以測定LRS與測試試劑的結合。例如，其可以通過標記的體外蛋白-蛋白結合檢測、電泳遷移率變動檢測、蛋白結合的免疫檢測和功能性檢測(磷酸化檢測等)等各種方法進行檢測。參見例如，美國專利第4，366，241 號、4，376，110 號、4，517，288 號和 4，837，168 號；和 Bevan 等，Trends inBiotechnology, 13:115-122，1995 ；Ecker 等，Bio/Technology, 13:351-360，1995 ；和Hodgson, Bio/Technology, 10:973-980, 1992。測試試劑可以通過檢測出與LRS的直接結合來鑒定，例如通過針對LRS的抗體的與LRS的共免疫沉淀。此外，測試試劑可以通過檢測出表示LRS與測試試劑結合的信號(例如熒光猝滅)來鑒定。
[0080]競爭檢測提供用于鑒定與LRS特異性結合的測試試劑的合適形式。在這些形式中，通過與已知會結合LRS的化合物的競爭來篩選測試試劑。已知的結合化合物可以是合成化合物。此外，其也可以是特異性識別LRS多肽的抗體，例如，針對LRS的單克隆抗體。如果測試試劑抑制了已知與LRS結合的化合物的結合，則該測試試劑也與LRS結合。
[0081]已知有許多類型的競爭檢測，例如:固相直接或間接放射免疫檢測(RIA)、固相直接或間接酶免疫檢測(EIA)、夾心競爭檢測(參見Stahli等，Methods inEnzymology, 9:242-2453，1983)；固相直接生物素-親和素 EIA (參見 Kirkland 等，J.1mmunol., 137:3619, 1986);固相直接標記檢測、固相直接標記夾心檢測(參見Harlow和 Lane, “Antibodies, A Laboratory Manual，，，Cold Spring Harbor Press, 1988);利用125I標記的固相直接標記RIA (參見Morel等，Mol..Immun0.，25(1) ;7_15，1988);固相直接生物素-親和素EIA(參見Cheung等，Virology, 176:546-552，1990);和直接標記的RIA(MoIdenhauer 等，Scand.J.TmmunoT,., 32 ;77_82，1990)。一般而言，此類檢測涉及利用細胞或結合于固體表面的純化多肽，其攜帶有未經標記的測試試劑和經標記的參照化合物。通過確定在測試試劑的存在下與固體表面或細胞結合的標記的量來測定競爭性抑制。通常測試試劑過量存在。通過競爭檢測鑒定出的調節劑包括與參照化合物結合于相同表位的試劑，和為了產生空間位阻而與充分接近參照化合物所結合的表位的相鄰表位結合的試齊U。通常在競爭試劑過量存在時，對照化合物對于共同的靶多肽的特異性結合被抑制至少50%或 75%。
[0082]上述篩選檢測可以為不溶性或可溶性形式。不溶性檢測的一例為在固相基質上將LRS或其片段固體化。之后，用足以使測試試劑能夠結合的時間間隔使固相基質與測試試劑接觸。在從固相基質洗滌除去任何未結合的物質之后，結合于固相的試劑的存在使得能夠對該試劑進行鑒定。上述方法可以包括從固相基質洗脫結合的制劑并由此將該試劑分離的步驟。作為另一選擇，除使LRS固定化外，可使測試試劑與固相基質結合然后添加LRS。
[0083]可溶性檢測包括如上所述的組合文庫篩選方法中的一些。在可溶性檢測形式下，測試試劑或LRS均不與固體支持物(solid support)結合。LRS或其片段對于測試試劑的結合例如可以通過LRS和/或測試試劑的熒光的變化來確定。熒光可以為固有的，或者可以通過用熒光團標記任一成分來賦予。
[0084]在一些結合檢測中，LRS、測試試劑或第三分子(例如針對LRS的抗體)可以作為標記的實體提供(即，可以共價地附接或連接至可檢測的標記或基團或交聯性基團)，以便輔助在給定的情境下對多肽的鑒定、檢測和定量。這些可檢測基團可以包括可檢測多肽基團，例如可檢測的酶或抗體表位。作為另一選擇，上述可檢測基團可以選自各種其它可檢測基團或標記，例如，放射性標記(例如1251、32P、35S)或者化學發光基團或熒光基團。同樣地，上述可檢測基團可以為底物、輔因子、抑制劑或親和配體。
[0085]2)調節LRS的其它生物活性的試劑的篩選
[0086]測試試劑與LRS的結合表示該試劑可以為LRS的調節劑。此外，這也表明所述試劑能夠調節Rag(優選為RagD或RagD GTP酶)的生物活性。因此，可以進一步測試與LRS結合的測試試劑的調節層粘連蛋白受體活性的能力。
[0087]作為另一選擇，可以對與LRS結合的測試試劑進行進一步檢驗以確定其對于LRS的活性。這樣的活性的存在、性質和程度可以通過活性檢測來進行測試。上述活性檢測可以確認與LRS結合的測試試劑實際上具有對LRS的調節活性。更通常而言，此類活性檢測可以獨立地用于鑒定調節LRS的活性的測試試劑(即，無需首先檢測其與LRS結合的能力)。一般地，上述方法涉及:在存在或不存在LRS的生物學活性測試所必需的其它分子或試劑的情況下，向含有LRS的樣品中添加測試試劑，并測定LRS的生物活性的變化。除了篩選調節LRS的酶活性或其它生物活性的試劑的檢測以外，上述活性檢測還包括針對LRS的表達或細胞水平的變化的體外篩選和體內篩選。
[0088]第二測試步驟:通討Rag調節mTORCl活件的制劑的篩詵
[0089]一旦經鑒定調節劑與LRS結合和/或調節LRS的生物活性(包括細胞水平)，則可以對測試該調節劑的通過Rag調節mTORCl的活性的能力，或者進一步測試其是否存在預防或治療如癌等mTORCl介導疾病的能力。一般在LRS的存在下測試上述調節劑的調節。在利用基于細胞的篩選系統的情況下，LRS可以由已被導入宿主細胞的表達載體表達。作為另一選擇，LRS也可在篩選系統中由宿主細胞內源性供給。
[0090]同時，本發明提供一種與對照組相比減小細胞的尺寸的方法，所述方法包括抑制細胞內LRS的表達。
[0091]已知mTORCl 調節細胞的尺寸(Fingar DC, Salama S，Tsou C, Harlow E, BlenisJ.Mammalian cell size is controlled by mTOR and its downstream targets S6Kland4EBPl/eIF4E.Genes Dev.16(2002), 1472-1487 頁)。根據本發明人鑒定出的 LRS 與 mTORCl的關聯性，本發明人確認到對LRS的表達的抑制導致細胞尺寸的減小。結果，確認到抑制了LRS的細胞與對照組細胞相比尺寸更小(圖2e上部、圖2f)。
[0092]通過本領域的各種公知方法來調節對細胞內LRS表達的抑制。對LRS的表達的抑制可以通過下述方式進行控制，但不限定于此:用包含可操作性連接于啟動子的多核苷酸的載體來轉化細胞，所述多核苷酸編碼LRS的反義RNA或干擾RNA。
[0093]“啟動子”是指在特定的宿主細胞中調節可操作地連接于啟動子的核酸序列的表達的DNA序列，而術語“可操作性連接”是指一個核酸片段與其它核酸片段連接，從而其功能或表達受到所述其它核酸片段的影響。另外，啟動子還可以包含:用于控制轉錄的任意的操縱子序列、編碼合適的mRNA核糖體結合位點的序列、和控制轉錄和翻譯的結束的序列。啟動子可以是組成性誘導靶基因的表達的組成型啟動子，或在特定位點和特定時間誘導靶基因的表達的誘導型啟動子。
[0094]本發明的細胞可以為具備mTORCl介導的信號傳導系統的細胞。
[0095]此外，本發明提供一種篩選用于預防和治療mTORCl介導疾病的試劑的方法，所述方法包括以下步驟:
[0096](a)使LRS (亮氨酰tRNA合成酶)和RagD在有測試試劑或無測試試劑的條件下接觸；
[0097](b)對有測試試劑時LRS和RagD間的結合親和力與無測試試劑時LRS和RagD間的結合親和力進行比較；和
[0098](c)鑒定出抑制LRS和RagD間的結合親和力的測試試劑。
[0099]更優選地，本發明可以包括:
[0100](a)使LRS (亮氨酰tRNA合成酶)和RagD在有測試試劑或無測試試劑的條件下接觸；
[0101](b)對有測試試劑或無測試試劑時LRS和RagD間的結合親和力進行測定；
[0102](c)對有測試試劑時LRS和RagD間的結合親和力與無測試試劑時LRS和RagD間的結合親和力進行比較；和
[0103](d)鑒定出抑制LRS和RagD間的結合親和力的測試試劑。
[0104]如上所述，篩選方法可以利用包括標記的體外蛋白-蛋白結合檢測(體外下拉檢測)、EMSA(電泳遷移率變動檢測)、蛋白結合的免疫檢測、功能性檢測(磷酸化檢測等)、酵母雙雜交(yeast-2hybrid)檢測、非免疫性免疫沉淀檢測、免疫沉淀/蛋白印跡檢測和免疫共定位檢測等的本領域公知的各種方法進行。
[0105]例如，酵母雙雜交檢測可以利用表達LRS和RagD或這些蛋白的部分或同系物的酵母來實施，所述LRS和RagD或其部分或同系物與細菌阻遏因子Lexa或酵母GAL4的DNA結合結構域和酵母GAL4蛋白的反式激活結構域分別融合(Kim, M，J.等，Nat, Gent.，34:339-336，2003)。LRS和RagD的結合重建了反式激活因子，后者在具有與LexA蛋白或GAL4的DNA結合結構域結合的調節序列的啟動子的控制下誘導報告基因的表達。
[0106]如上所述，報告基因可以是編碼可檢測多肽的本領域公知的任何基因。例如，可以使用氯霉素乙酰轉移酶(CAT)、熒光素酶、β -半乳糖苷酶、β -葡萄糖苷酶、堿性磷酸酶、綠色熒光蛋白(GFP)等。若LRS和RagD或這些蛋白質的一部分或同系物的結合水平被測試試劑刺激或提高，則報告基因的表達與正常條件下的表達相比增加。相反地，若結合水平被測試試劑抑制或減低，則報告基因不表達，或者與正常條件下相比其表達更少。
[0107]此外，還可選擇編碼能夠使酵母生長的蛋白的報告基因(即，當該報告基因不表達時，酵母的生長受抑制)。例如，報告基因可以是編碼參與氨基酸或含氮堿基的生物合成通路的酶的營養缺陷型基因(例如，如ADE3、HIS3等酵母基因或來自其它物種的等同基因)。若在該體系中表達的LRS和RagD或這些蛋白的部分或同系物間的相互作用被測試試劑抑制或減弱，則報告基因不被表達。
[0108]因此，在上述條件下酵母的生長停止或變緩。由報告基因表達所引起的這種效果可以通過裸眼或通過裝置(例如顯微鏡)來進行觀察。
[0109]下面將對本發明的附圖進行說明。
[0110]圖1示出亮氨酰-tRNA合成酶(LRS)為mTOR關聯蛋白。(a)LRS的亞細胞分級(subcellular fractionation)。各個級分用抗LRS、抗IRS、抗MRS和抗mTOR抗體進行免疫印跡。YYl和LAMP2分別用作細胞核和細胞內膜標記物。Nuc，細胞核；PM，質膜；EM，內膜；Cyt，胞質。(b) HeLa細胞中的LRS的免疫熒光染色。將HeLa細胞與抗LRS、抗鈣聯蛋白(ER標記物)、抗GM130 (高爾基體標記物)、抗LAMP2 (溶酶體標記物)或抗EEAl (核內體標記物)抗體反應，并分別通過alexa488綴合二抗和alexa504綴合二抗而可視化。(c) LRS的溶酶體定位。對293T細胞進行I小時氨基酸饑餓處理，并用氨基酸再激發5分鐘。利用溶酶體分離試劑盒(Sigma-Aldrich)將細胞分級。溶酶體蛋白用抗mTOR、抗Raptor、抗LRS、抗LAMPl抗體進行了免疫印跡。(d)將293T細胞溶解物用抗mTOR抗體進行免疫沉淀，通過免疫印跡測定了共沉淀的LRS和Raptor。使用山羊IgG、抗mTOR抗體加上封閉表位肽和抗肌動蛋白抗體作為陰性對照。(e) 293T細胞被對照質粒(EV)、myc標記的LRS或MRS轉染。細胞溶解物用抗myc抗體免疫沉淀，共沉淀的mTOR和Raptor通過免疫印跡進行測定。(f)HeLa細胞內mTOR與LRS的共定位(co-localization)。細胞與抗LRS、抗MRS、抗IRS和抗mTOR抗體反應,并分別利用alexa488綴合二抗和alexa594綴合二抗可視化。(g)HeLa細胞內的Raptor和LRS的共定位。細胞與抗LRS、抗MRS、抗IRS和抗Raptor抗體反應,并分別利用alex488綴合二抗和alex594綴合二抗可視化。
[0111]圖2示出LRS對于mTORCl活化和溶酶體定位、細胞尺寸、自吞噬的效果。(a) 293T細胞被6種LRS siRNA轉染48小時，通過免疫印跡測定了氨基酸依賴性S6K磷酸化。
(b)293T細胞被對照、mTOR、LRS、IRS,MRS或VRS siRNA轉染48小時，并通過免疫印跡測定了氨基酸依賴行S6K磷酸化。(c) 293T細胞被對照、LRS、IRS,MRS或VRS siRNA轉染48小時，并通過免疫印跡測定了亮氨酸依賴性S6K磷酸化。(d)293T被對照或LRS siRNA轉染48小時，對細胞進行I小時氨基酸饑餓處理并用氨基酸再激發5分鐘。細胞用溶酶體分離試劑盒(Sigma-Aldrich)進行分級。溶酶體蛋白用抗mTOR、抗Raptor、抗LRS和抗LAMP2抗體進行了免疫印跡。(e)用對照、LRS、IRS、VRS或MRS siRNA轉染的細胞的細胞尺寸分布。(f)將來自(e)的細胞尺寸分布(Gl細胞的FSC)定量(η = 3，并且ρ〈0.0001)。(g) LC3切割對LRS下調的影響。293T細胞用指定的siRNA轉化48小時，進行2小時亮氨酸饑餓處理。制備細胞溶解物，通過采用抗LC3抗體的免疫印跡來測定LC3-1和LC3-1I。自吞噬誘導由LC3II/LC3I的比例表示。(h)用指定的siRNA和EGFP-LC3的共轉染后，對細胞進行2小時亮氨酸和血清饑餓處理。監測斑點(puncta)中的EGFP-LC3累積。(i)來自(f)的EGFP-LC3斑點的定量分析。對于每個樣品分析至少8個細胞。數據表示平均值土S.D.。與對照siRNA轉染的細胞相比，LRS siRNA及mTOR siRNA轉染的細胞在統計學上顯示出LC3斑點/細胞的的顯著增加(分別為P = 0.0005和p〈0.0001)。
[0112]圖3示出LRS和RagD GTP酶的直接相互作用。(a)將純化的GST-LRS與來自用HA標記的 RagA、RagB, RagC, RagD, Rhebl、G β L、Raptor 或 mTOR 轉染的 293T 細胞的蛋白提取物一起溫育，通過采用抗HA抗體的免疫印跡來測定HA標記的蛋白的共沉淀。輸入(input)為10%所用蛋白提取物的量。(b)293T細胞在表達載體中被指定的cDNA轉染。細胞溶解物和HA標記的免疫沉淀物利用抗myc或HA抗體通過免疫印跡進行分析。WCL是指全細胞溶解物。(C)HA標記的RagD和myc標記的LRS、IRS、MRS或EPRS的共轉染之后，利用抗HA抗體將細胞溶解物免疫沉淀，并通過利用抗myc抗體的免疫印跡來測定共沉淀的myc標記蛋白。
(d)293T細胞在表達載體中被指定的cDNA轉染。制備細胞溶解物，細胞溶解物和myc標記的免疫沉淀物利用抗FLAG、抗myc或抗HA抗體通過免疫印跡來進行分析。(e) 293T細胞被對照或myc-RagD/HA-RagB轉染。利用抗myc抗體使細胞溶解物免疫沉淀，并利用抗HA、抗LRS或抗Raptor抗體通過免疫印跡來分析myc標記的免疫沉淀物。(f)將RagDGTP酶的各個功能結構域作為GST融合蛋白表達。將GST-RagD蛋白與myc標記的LRS —起溫育，myc標記的共沉淀物利用抗myc抗體通過免疫印跡來測定。(g)在將FLAG標記的LRS和HA標記的RagB以及myc標記的WT或突變RagD共轉染之后，細胞溶解物利用抗myc抗體進行免疫沉淀，共沉淀的LRS和RagB利用抗FLAG和抗HA抗體通過免疫印跡來進行測定。(h)將LRS的各個C-末端片段作為GST融合蛋白表達。純化的GST-LRS蛋白與HARagD轉染的細胞溶解物一起溫育，HA-RagD的共沉淀物利用抗HA抗體通過免疫印跡來進行測定。(i)HA標記的RagD和myc標記的WT或突變LRS共轉染之后，細胞溶解物利用抗HA抗體進行免疫沉淀，共沉淀的LRS利用抗myc抗體通過免疫印跡來進行測定。
[0113]圖4示出LRS與RagD和Raptor以氨基酸依賴性方式形成分子復合體。(a)LRS與RagD和Raptor的受氨基酸刺激的相互作用。對293T細胞進行I小時氨基酸饑餓處理，并用氨基酸再激發5分鐘。利用抗Raptor抗體使細胞溶解物免疫沉淀，并利用抗LRS和抗RagD抗體通過免疫印跡來測定共沉淀的LRS和RagD。(b) 293T細胞在表達載體中用指定的cDNA轉染。對細胞進行I小時亮氨酸饑餓處理，并用亮氨酸再刺激5分鐘。細胞溶解物和myc標記的免疫沉淀物利用抗FLAG和抗myc抗體通過免疫印跡來進行分析。(c) 293T細胞在表達載體中用指定的cDNA轉染。對細胞進行氨基酸饑餓處理I小時，并用氨基酸再刺激5分鐘。細胞溶解物和HA標記的免疫沉淀物利用抗myc、抗FLAG和抗HA抗體通過免疫印跡來進行分析。(d) LRS對于RagD和Raptor的復合體形成是必需的。將293T細胞用對照或LRS siRNA轉染48小時。對細胞進行氨基酸饑餓處理I小時，用氨基酸再刺激5分鐘。細胞溶解物利用抗Raptor抗體進行了免疫沉淀，沉淀物利用抗LRS和抗RagD抗體通過免疫印跡來進行分析。
[0114]圖5示出LRS充當mTORCl信號傳導的亮氨酸受體。(a)幾個物種的亮氨酰tRNA合成酶的N-末端區的主要序列比對。對于ATP結合重要的Ia類保守HIGH基序用灰色框表示。(b)通過使用4 μ M tRNALeu和50nM酶，通過LRS WT和突變體(F50A/Y52A、F50A以及Y52A)進行亮氨酰化。(c)將293T細胞用LRS WT或F50A/Y52A突變體轉染24小時，然后進行氨基酸饑餓處理I小時，用氨基酸再刺激5分鐘。亮氨酸依賴性S6K磷酸化通過免疫印跡進行測定。(d)在myc標記的WT LRS或突變LRS與HA-RagD/myc-RagB共轉染之后，細胞溶解物利用抗HA抗體進行了免疫沉淀，共沉淀的LRS利用抗myc抗體通過免疫印跡來進行測定。(e)293T細胞在表達載體中用指定的cDNA轉染。細胞溶解物利用抗HA抗體進行免疫沉淀，共沉淀的LRS和Raptor利用抗myc抗體通過免疫印跡進行測定。
[0115]圖6示出依賴于RagD的核苷酸結合狀態的方式的LRS和RagD的相互作用。響應于(a)氨基酸或(b)亮氨酸的饑餓處理和刺激的S6K的磷酸化受到所指定的蛋白的表達的影響。使293T細胞進行(a)氨基酸或(b)亮氨酸饑餓處理I小時并用氨基酸或亮氨酸刺激5分鐘，從所述293T細胞制備細胞溶解物。(c)將純化的GST或GST-LRS蛋白在⑶P β S或GTP Y S的存在下與HA-RagD轉染的細胞溶解物一起溫育。共沉淀的RagD利用抗HA抗體通過免疫印跡進行測定。(d)將純化的GST或GST-LRS蛋白與myc標記的RagD WT、S77L(⑶P)或Q121L(GT0)轉染的細胞溶解物一起溫育。共沉淀的RagD利用抗myc抗體通過免疫印跡進行測定。(e)在myc標記的WT RagD或突變RagD與FLAG標記的LRS的共轉染之后，細胞溶解物利用抗myc抗體進行了免疫沉淀，共沉淀的LRS和RagD利用抗FLAG和抗myc抗體通過免疫印跡進行了測定。(f)293T細胞在表達載體中用指定的cDNA轉染。制備細胞溶解物，并將細胞溶解物和myc標記的免疫沉淀物利用抗FLAG或抗myc抗體通過免疫印跡進行分析。(g)將293T細胞在表達載體中用指定的cDNA轉染。制備細胞溶解物，將細胞溶解物和myc標記的免疫沉淀物利用抗FLAG、抗HA或抗myc抗體通過免疫印跡進行分析。
[0116]圖7示出LRS充當RagD的GTP酶激活蛋白。(a)將指定量的His標記的LRS (759?1176位氨基酸)片段在37°C與0.15 μ M RagD溫育20分鐘。誤差線表示平均S.D.(η =3)。(b)將His標記的LRS片段(0.3 μ M)與RagD溫育指定時間。誤差線表示平均S.D.(η= 3)。(c)推定的LRS GAP基序與幾個物種的ADF-核糖基化因子-GAP (ARF-GAP)的序列比對。保守的殘基為黑色。h,疏水性；s,Gly或Ala ;x,任意殘基；hs,智人；rn,褐家鼠；dm,果蠅；sc，釀酒酵母；ss，野豬。(d) LRS WT和突變體對RagD的GTP水解的影響。將純化的LRSWT (759?1176位氨基酸)片段或突變體(H844A，R845A)片段在37°C與RagD —起溫育20分鐘。誤差線表示平均S.D.(η = 3)。(e)將293T細胞用LRS WT或GAP突變體(H844A，R845A)轉染24小時，然后進行氨基酸饑餓處理I小時，并用氨基酸再刺激5分鐘。亮氨酸依賴性S6K磷酸化通過免疫印跡進行了測定。(f)圖示表示的LRS在mTORCl的氨基酸信號傳導中的作用。
[0117]圖8顯示了 LRS的溶酶體定位的時間推移共聚焦活細胞成像。將293T細胞用EGFP-LRS (a)或EGFP對照(b)表達載體轉染36小時，然后用LysoTracker RedDND-99 (Molecular Probes)染色30分鐘。對細胞進行亮氨酸饑餓處理50分鐘，并用0.8mM亮氨酸再刺激12分鐘。在亮氨酸饑餓處理期間，以10分鐘間隔監測細胞，然后在用亮氨酸再刺激后以I分鐘間隔進行監測。(c)定量分析顯示出亮氨酸依賴性的LRS溶酶體定位。[0118]圖9示出LRS敲低(knockdown)對于受亮氨酸或亮氨酸類似物刺激的S6K磷酸化所產生的影響。(a)亮氨酸類似物對于亮氨酸刺激的S6K磷酸化所產生的影響。對293T細胞進行亮氨酸饑餓處理I小時，并與0.8mM或8mM的亮氨醇或亮氨酰胺進行預溫育。5分鐘后，添加0.8mM亮氨酸。溫育5分鐘后，收集細胞并通過免疫印跡測定S6K磷酸化。(b)對HeLa細胞進行I小時亮氨酸饑餓處理，并與0.8mM或8mM的亮氨醇或亮氨酰胺預溫育。5分鐘后，添加0.8mM亮氨酸。溫育5分鐘后，收集細胞，并通過免疫印跡測定S6K磷酸化。
(c)將293T細胞用對照或LRS siRNA轉染48小時，通過免疫印跡測定受亮氨酸或亮氨酸類似物刺激的S6K磷酸化。L-亮氨酸和亮氨酰胺的濃度為0.8mM, D-亮氨酸、正亮氨酸和亮氨醇的濃度為8mM。(d)將HeLa細胞用對照或LRS siRNA轉染48小時，通過免疫印跡測定受亮氨酸或亮氨酸類似物刺激的S6K磷酸化。L-亮氨酸和亮氨酰胺的濃度為0.8mM,D-亮氨酸、正亮氨酸和亮氨醇的濃度為8mM。
[0119]圖10示出LRS以不依賴tRNA的方式參與mTORCl的活化。(a)tRNA對于體外LRS-RagD結合的影響。在存在亮氨酸(0.1mM) ,ATP (0.1mM)和?ΚΝΑ^(25 μ g)的組合時，將293T細胞溶解物與純化的GST或GST融合LRS溫育。沉淀的RagD通過利用抗RagD抗體進行免疫印跡而確定。(b)幾個物種的亮氨酰tRNA合成酶的主要序列比對。對tRNA結合重要的Ia類保守KMSKS基序以黑色框示。(c)進行了通過LRS K716A/K719A突變體的亮氨酰化和ATP-PPi交換活動。(d)K716A/K719A突變體對于RagD結合所產生的影響。將293T細胞用myc標記的LRS WT或突變體和HA標記的RagD轉染24小時。細胞溶解物用抗HA抗體進行免疫沉淀，共沉淀的LRS和RagD利用抗myc和抗myc抗體進行免疫印跡來確定。
(e)將293T細胞用指定的cDNA轉染24小時，通過免疫印跡確認了亮氨酸依賴的S6K磷酸化。
[0120]圖11示出亮氨酸以劑量依賴性方式使mTORCl活化。(a)以指定濃度的亮氨酸對293T細胞進行5分鐘處理。通過免疫印跡確認了亮氨酸依賴性的S6K磷酸化。(b)對(a)中的P-S6K條帶的定量。對于mTORCl的亮氨酸刺激的EC5tl為約80mM。(c) WTLRS的亮氨酰化和ATP-PPi交換活動的動力學參數。
[0121]圖12示出氨基酸刺激對于RagD的GTP/⑶P狀態的影響。使myc-RagD的野生型和突變體形式轉染到293T細胞內，將所述細胞用32P磷酸標記。將myc-RagD免疫沉淀，洗脫出結合的核苷酸并用TLC進行分析。EV是指對照空載體。
[0122]圖13是測定LRS和Rag間結合親和力的ELISA檢測結果。(a)ELISA結果示出RagD蛋白與LRS-(1-1176)以劑量依賴性方式結合(96孔板用LRS-(1-1176)(碳酸鹽緩沖液中500ng/ml)涂布；GST為陰性對照；RagD蛋白以GST-RagD形式使用；一抗是抗GST抗體(z-5，l:100稀釋)；二抗是HRP綴合的抗兔抗體(1:5000稀釋))。(b)對于以LRS-(1-1176)涂布的96孔板上的對照(GST)、RagD和RagD+LRS-(759-1176)的結合親和力的比較結果。LRS-(759-1176)減少了以LRS-(1-1176)涂布的板上的RagD的結合親和力。
[0123]有益效果
[0124]本發明涉及LRS的新用途，并提供了篩選用于預防和治療mTORCl介導疾病的試劑的方法以及相對于對照組減小細胞尺寸的方法。因此，所述篩選方法能夠用于如癌等疾病的新型治療劑的開發。【專利附圖】
【附圖說明】
[0125]圖1示出亮氨酰tRNA合成酶(LRS)為mTOR關聯蛋白。
[0126]圖2示出LRS對于mTORCl活化和溶酶體定位、細胞尺寸、自吞噬的效果。
[0127]圖3示出LRS和RagD GTP酶的直接相互作用。
[0128]圖4示出LRS與RagD和Raptor以氨基酸依賴性方式形成分子復合體。
[0129]圖5示出LRS充當mTORCl信號傳導的亮氨酸受體。
[0130]圖6示出依賴于RagD的核苷酸結合狀態的方式的LRS和RagD的相互作用。
[0131]圖7示出LRS充當RagD的GTP酶激活蛋白。
[0132]圖8顯示了 LRS的溶酶體定位的時間推移共聚焦活細胞成像。
[0133]圖9示出LRS敲低對于受亮氨酸或亮氨酸類似物刺激的S6K磷酸化的影響。
[0134]圖10示出LRS以不依賴tRNA的方式參與mTORCl活化。
[0135]圖11示出亮氨酸以劑量依賴性方式使mTORCl活化。
[0136]圖12示出氨基酸刺激對于RagD的GTP/⑶P狀態的影響。
[0137]圖13是測定LRS和Rag間結合親和力的ELISA檢測結果。
【具體實施方式】
[0138]〈方法〉
[0139]1.細胞培養和試劑
[0140]HEK293T細胞和HeLa細胞在含有10 %的胎牛血清和抗生素的DMEM(Hyclone)中進行生長。CH0-tSHl細胞由Mike Clemens博士饋贈。CH0_tSHl細胞于34°C在補充了9 % (v/v)胎牛血清、100mg/ml鏈霉素硫酸鹽以及100單位/ml青霉素G的Dulbecco改良Eagle培養基/Ham F12營養混合物(Sigma)中生長。tSHl細胞系含有在34°C為活性但在39.5°C為非活性(defective)的溫度敏感性亮氨酰tRNA合成酶。氨基酸缺乏和追加實驗利用DMEM(+AA)和包含25mM葡萄糖、ImM丙酮酸鈉、I XMEM維生素(Invitrogen)的DPBS(-AA)來實施。L-亮氨酸、D-亮氨酸、L-亮氨酰胺、亮氨醇、正亮氨酸(Sigma Aldrich)用PBS [pH7.6]溶解，以0.8mM或8mM的濃度進行處理。[32P]焦磷酸鹽(80.70mCi/mL)由PerkinElmer Life Sciences 獲得。[3H]亮氨酸由 American Radiolabeled Chemicals 獲得。RagC 和 RagD siRNA 由 Invitrogen 獲得。
[0141]2.細胞的氨基酸或亮氨酸饑餓處理和刺激
[0142]為將亮氨酸耗盡，細胞用無亮氨酸DMEM洗滌2次，在無亮氨酸DMEM中溫育60分鐘，用52mg/ml亮氨酸刺激5分鐘至60分鐘。為了進行氨基酸饑餓處理，將細胞用含有25mM葡萄糖、ImM丙酮酸鈉、I XMEM維生素的DPBS洗滌并在其中溫育60分鐘，然后替代為DMEM并在其中培養5分鐘至60分鐘。
[0143]3.抗體和質粒
[0144]抗體由下述來源獲得:抗mTOR封閉肽、針對mTOR(用于IP)、HA、c_MYC、核纖層蛋白A的抗體以及HRP標記的抗小鼠、抗兔二抗獲自Santa Cruz Biotechbology ;針對磷酸化T389S6K1、磷酸化 S473Akt/PKB、磷酸化 T308Akt、S6K1、Akt、LC3、RagC、RagD 抗體來自 CellSignaling Technology ;針對 LAMP2 (H4B4)、mTOR(Y391)、Raptor 的抗體來自 Abcam(用于Western);針對 Raptor、mTOR、FLAG 的抗體來自 Invitrogen (用于 Western、IF、IP);針對mTOR、克隆體2ID8.2的小鼠單克隆抗體來自Millipore (用于Western) ；LysoTracker RedDND-99來自Molecular Probe ;單克隆小鼠抗I丐聯蛋白抗體來自BD Pharmigen ;由D_H.Kim博士(明尼蘇達大學)和E.J.Kim博士(大邱加圖立大學)慷慨提供的包括RagA、RagB,RagC,RagD,mTOR,Raptor,GbL,RhebI 的 HA 標記的 mTORCl 成分構建體。包括 LRS、IRS,MRS以及EPRS在內的所有其它DNA構建體為實驗室儲備物。轉染利用Gen印orter系統(GeneTherapysystem)進行。
[0145]4.細胞溶解物的制造和免疫沉淀
[0146]將細胞溶解于含有I % Triton X_100、40mM HEPES (pH7.4)、2mM EDTA、IOmM焦磷酸鹽、IOmM甘油磷酸鹽以及蛋白酶抑制劑混合物的分解緩沖液中，將溶解物以13，OOOrpm離心30分鐘。之后，通過SDS-PAGE將20 μ g提取的蛋白分級。為了進行免疫沉淀，將細胞溶解(50mM Tris-HCL (pH7.4) UOmM NaClUmM EDTA、0.5mM EGTAUmM MgCl2、0.1% CHAPS 和0.5% TritonX-100、lmM苯甲基磺酰氟)，向溶解物添加一抗，于4°C旋轉溫育2小時。然后添加蛋白質瓊脂糖G-瓊脂糖凝膠的50%漿料，并繼續培養額外4小時。用冰冷的溶解緩沖液洗滌3次后，沉淀物用SDS樣品緩沖液溶解，用SDS-PAGE分離。
[0147]5.免疫熒光染色
[0148]將細胞置于蓋玻片上，用100%丙酮于_20°C固定5分鐘。在含有2%BSA的PBS封閉緩沖液中溫育后，將細胞與一抗(1:100)溫育2小時，并在含有2% BSA和10%胎牛血清的封閉緩沖液中與Alexa488綴合二抗或Alexa595綴合二抗(1:1,000)溫育I小時。用DAPI將細胞核染色。用PBS洗滌后，將細胞固定，通過共聚焦激光掃描顯微鏡(Nikon AIR)進行觀察。
[0149]6.LRS 和 RagD 的突變
[0150]LRS和RagD的點突變通過利用QuickChange試劑盒(Stratagene)的定點突變產生，突變體通過DNA測序進行確認。
[0151]7.亞細胞分級
[0152]接種細胞并培養至70%融合(confluence)。將細胞用無氨基酸培養基洗滌3次，添加正常培養基5分鐘。之后按照制造者的說明，利用溶酶體分離試劑盒(SIGMA-ALDRICH)提取溶酶體級分。簡言之，向細胞添加提取緩沖液，利用Dounce均質器以20次沖程(stroke)使細胞破裂。將樣品以IOOOg離心10分鐘后，將上清液以20，OOOg再離心20分鐘。細胞團(pellet)在提取緩沖液中再分散(溶酶體級分)。
[0153]8.時間推移活細胞成像
[0154]利用共聚焦激光掃描顯微鏡(Nikon AIR)進行細胞成像。所有圖像通過CFI PlanApochromat VC物鏡(60X/1.400il)利用數碼變焦以512X 512的分辨率拍攝。所有圖像儲存為ND或JPG2000文件，其為Nikon AlRsi共聚焦顯微鏡的標準格式。
[0155]9.圖像分析
[0156]將細胞圖像用于定量分析。該過程利用尼康成像軟件NIS-element AR64位3.00版進行。利用NIS-element軟件將圖像文件格式從ND或JPG2000文件轉換為ICS或TIFF格式。溶酶體共定位的定量分析通過NIS-element軟件利用“時間測定(Time measurement) ”工具進行以得到“強度區(Region Of Intensity) ”(ROI)。根據LysoTracker的定位確定ROI后，其它成分的定位利用已確定的ROI進行測定。相對熒光單位(RFU)針對ROI的初始強度進行標準化，之后利用OriginPr07.5作圖。為了進行共定位的定量分析，還利用了ImageJ共定位搜尋器插件。對于每個共同標記(co-labeling)對多于10個細胞獲得重疊系數，共定位的指數對應于重疊系數(R)*100的平均值土S.D0綠色與紅色信號間的比例為0.8 至 1.2。
[0157]10.體外下拉檢測
[0158]將重組LRS或RagD片段蛋白作為GST融合蛋白表達，通過谷胱甘肽瓊脂糖凝膠純化。利用體外結合檢測來測試RagD片段和myc-LRS過表達的細胞溶解物間的相互作用，或LRS片段和HA-RagD過表達的細胞溶解物間的相互作用。結合檢測在含有IOmM NaClUmMMgCl2UmM EDTA、0.5mM EGTA 和 0.5% TritonX-1OO 的 25mM Tris-HCl 緩沖液(ρΗ7.4)中實施。
[0159]11.細胞的尺寸的測定
[0160]利用前向散射單元(FSC)測定未固定的細胞的細胞尺寸。將293Τ細胞平板接種，用PBS洗滌I次，并重懸于含有0.1%血清、5mM EDTA、5ng/ml碘化丙啶(PI ；Sigma)的PBS中。利用FACS分析(FACS 口徑；Becton Dickinson)分析樣品的細胞尺寸(FSC)。測定Gl期細胞的FSC的平均值。
[0161]12.ATP-PPi 交換檢測
[0162]ATT-PPi 交換反應在含有 2mM[32P]焦磷酸(PPi) (80.70mCi/mL)、50mMHEPES-KOH(pH7.6)、2mM MgCl2、8mM KF、4mM ATP、各種濃度的亮氨酸以及 25nM 的 LRS 的反應混合物中進行。用酶初始化反應，并在37°C的加熱塊(heat block)中進行。在不同的時間點取得等分試樣(10 μ I)，利用Iml猝滅緩沖液(50mM NaPPi,3.5% HC104、2%活性炭)停止反應。通過Whatman GF/A過濾器過濾活性炭懸浮液,用5ml水洗漆4次,并用10mll00%乙醇沖洗。對過濾器上的活性炭粉進行干燥，并利用閃爍計數器(Beckman Coulter)對合成的[32P] ATP計數。
[0163]13.亮氨酰化檢測
[0164]亮氨酰化檢測在含有ImM精胺、50mM HEPES-K0H(ρΗ7.6)、25mM KCl、5mM MgCl2、4mMATP、2mg/ml 牛肝 tRNAleu、各種濃度的[3H] Leu (60Ci/mmol)以及 IOnM ?IOOnM 的 LRS 的緩沖液中進行。用酶初始化反應，并在37°C的加熱塊中進行。在不同的時間點取得等分試樣(10 μ I)，用預先浸有5%三氯乙酸(TCA)的Whatman過濾墊中止。將過濾墊分別用冷的5%TCA以10分鐘洗滌3次，用冷的100%乙醇洗滌I次。然后將洗滌后的墊干燥。放射性用閃爍計數器(Beckman Coulter)定量。
[0165]14.體外GTP酶檢測
[0166]根據制造公司說明，利用GTP酶檢測試劑盒(Innova Biosciences)在最終體積為200ml的含有0.1%胎牛血清白蛋白的檢測緩沖液(20mM哌嗪-N，N9-雙(2-乙磺酸)、20mMHEPES、5mM MgCl2、125mM NaCl、5mM KCl, pH7.0,0.5mM GTP)中進行 GTP 酶分析。
[0167]15.體內GTP酶檢測
[0168]將293T細胞用無磷酸鹽的DMEM洗滌，在ImM無磷酸鹽的DMEM中溫育60分鐘。之后，在IOOiiCi的[32P]憐酸鹽/ml中培養8小時。在標記后，將細胞在冰上用預先冷卻的溶解緩沖液(0.5% NP-40,50mM Tris [ρΗ7.5]、IOOmM NaClUOmM MgCl2、ImM 二硫蘇糖醇(DTT)、ImM苯甲基磺酰氟、10 μ g/ml亮肽素、10 μ g/ml抑肽酶)溶解30分鐘。之后，將溶解物于4°C以12，OOOXg離心15分鐘。將上清液(160 μ I)轉移至新的試管中，為了抑制GAP活性而添加16 μ I NaCl (500mM)。然后將myc-RagD于4°C用抗myc_抗體和蛋白質-G瓊脂糖凝膠珠進行I小時免疫沉淀。于4°C用洗滌緩沖液l(50mM Tris [pH8.0]、500mM NaCl、5mM MgCl2UmM DTT.0.5% TritonX-100)將珠洗滌3次，進而于4°C用洗滌緩沖液2 (50mMTris [pH8.0]U00mM NaCl、5mM MgCl2UmM DTT.0.1% TritonX-100)洗滌 3 次。于 68°C用20 μ I洗脫緩沖液(2mM EDTA、0.2%十二烷基硫酸鈉、ImM⑶P、ImM GTP)將myc-RagD結合的核苷酸洗脫10分鐘。將洗脫的核苷酸涂敷至聚乙烯亞胺纖維素板(Baker-flex)，用
0.75M KH2PO4[pH3.4]溶液進行顯影。通過磷光影像分析儀將GTP和⑶P可視化并定量。
[0169]16.RT-PCR
[0170]利用RNA提取試劑盒(RNeasy Mini)從培養的細胞提取RNA。總RNA(Img)與ImldNTP (各2.5mM)、ImM隨機六聚體(5mM)以及200單位MMLV逆轉錄酶一起在20ml反應液中進行逆轉錄。對cDNA溶液進行1:4稀釋后，將Iml用于PCR反應(Takara)。
[0171]正義RagC:5’ -TCGGCTACGGCGTGGAGGAG-3’ (SEQ ID NO:: 19)；
[0172]反義RagC:5’ -CGCCCCCCGGACCACAGCCA-3’ (SEQ ID NO::20)；
[0173]正義RagD:5’ -TGAGCTGGTGGGGCTAGCGG-3’ (SEQ ID NO::21)；
[0174]反義RagD:5’ -GGGTCACTGAAGTCCAGAACTC-3’ (SEQ ID NO::22)。
[0175]17.用于測定LRS和RagD間的結合親和力的ELISA檢測
[0176]為了檢驗LRS和RagD蛋白是否相互結合，制備了 SEQ ID NO:1至8所表示的引物。
[0177][表1]用于LRS片段合成的引物組
[0178]
【權利要求】
1.一種篩選用于預防和治療mTORCl介導的疾病的試劑的方法，所述方法包括以下步驟:(a)使LRS(亮氨酰tRNA合成酶)和RagD在有測試試劑或無所述測試試劑的條件下接觸； (b)對有所述測試試劑時LRS和RagD間的結合親和力與無所述測試試劑時LRS和RagD間的結合親和力進行比較；和 (c)測定LRS和RagD間的結合親和力的變化。
2.如權利要求1所述的方法，所述mTORCl介導的疾病選自由癌、自身免疫疾病、糖尿病、肥胖癥和心血管疾病組成的組。
3.一種相對于對照細胞或正常細胞減小細胞的尺寸的方法，所述方法包括抑制LRS的表達的步驟。
4.如權利要求3所述的方法，所述抑制通過用表達載體將細胞轉化來進行，所述表達載體包含啟動子和與該啟動子可操作地連結的LRS的反義RNA或干擾RNA。
5.一種篩選用于預防和治療mTORCl介導的疾病的試劑的方法，所述方法包括以下步驟: (a)使LRS(亮氨酰tRNA合成酶)和RagD在有測試試劑或無所述測試試劑的條件下接觸； (b)對有所述測試試劑時LRS和RagD間的結合親和力與無所述測試試劑時LRS和RagD間的結合親和力進行比較；和 (c)鑒定出抑制LRS和RagD間的結合親和力的測試試劑。
6.如權利要求5所述的方法，所述mTORCl介導的疾病選自由癌、自身免疫疾病、糖尿病、肥胖癥和心血管疾病組成的組。
【文檔編號】G01N33/15GK103959058SQ201280056503
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2012年9月24日 優先權日:2011年9月22日
【發明者】金圣勛, 韓政旼 申請人:醫藥生命融合研究團