快速檢測豬乙型腦炎抗體試紙條及其制備方法

專利名稱：快速檢測豬乙型腦炎抗體試紙條及其制備方法
技術領域：
本發明屬于豬乙型腦炎檢測技術領域，尤其是一種快速檢測豬乙型腦炎抗體試紙條及其制備方法。
背景技術：
日本乙型腦炎(Japanese encephalitis B, JE),又稱流行性乙型腦炎、乙型腦炎，簡稱乙腦，是由日本乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)引起的一種人畜共患的蚊媒傳播的自然疫源性傳染病。該病對人類危害巨大，是人類中樞神經系統最常見的蟲媒病之一，可導致患者死亡并常留下嚴重的神經后遺癥。在動物中，豬是JE的主要傳染源，對JEV有擴增作用，JEV感染一般呈豬-蚊-人的鏈狀。JE可以引起懷孕母豬流產、死產或弱仔，公豬睪丸炎以及仔豬出現神經癥狀，給養豬業造成較大的經濟損失。JEV廣泛分布于亞洲各國，近年來其流行分布范圍有不斷擴大的趨勢，原先無JE的澳大利亞等國已經出現病例。我國是JE發病人數最多的國家，占世界總發病數的80%以上。由于JE流行范圍廣、人獸共患、危害嚴重，世界衛生組織(WHO)將其列為需要重點控制的傳染病，也是我國醫學乙類法定傳染病。國際獸醫局(OIE)規定JE為必須報告的動物疫病，屬二類動物疫病。JEV屬于黃病毒科黃病毒屬成員，基因組為正鏈單股RNA病毒,基因組長度約為Ilkb (10976bp)，整個基因組只含一個開放閱讀框。該多蛋白前體經蛋白酶切割加工，產生3個結構蛋白:核衣殼蛋白(C)、膜蛋白(PrM / M)、囊膜糖蛋白(E)。E蛋白基因大小為1500bp,由其編碼的E蛋白是病毒粒子表面最重要的結構蛋白，其表面的抗原決定簇，具有血凝活性和中和活性。E蛋白與病毒的毒力、保護性免疫、宿主范圍、組織嗜性、膜融合、血凝反應和血清特異性有關。傳統診斷JEV的血清學方法有血清中和試驗(SNT)、血凝抑制試驗(HI)、補體結合試驗(CT)、間接免疫熒光試驗(IFA)等，目前較常用有乳膠凝集試驗(LAT)、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)等。這些檢測方法存在耗時長、專業性強等缺點，操作需要專門的技術人員和儀器設備，不適合基層使用。因此，建立一種快速、直觀、簡便、適合基層使用的JEV診斷方法對養豬生產單位具有重要的意義。免疫膠體金技術(ImmuneColloidal gold technique, ICG)是 20 世紀 80 年代繼熒光標記、放射性同位素標記和酶標記三大標記技術后發展起來的一種新型固相標記免疫測定技術。其原理是以膠體金為標記物，利用抗原抗體特異性反應，通過帶顏色的膠體金顆粒來放大免疫反應系統，使反應結果在固相載體上直接顯示出來，用于檢測被檢樣品中的抗原或抗體。該方法具有特異性強、敏感性高、快速便捷、無需要特殊儀器設備、結果讀取判斷直觀等優點，已成為當前動物疫病檢測中廣泛采用的免疫學檢測方法之一。

發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種特異性強、敏感性高、操作簡單便捷的快速檢測豬乙型腦炎抗體(JEV抗體)試紙條及其制備方法，以幫助進行JE血清學診斷與血清流行病學調查以及JE感染或免疫后血清抗體的檢測。本發明所要解決的技術問題通過以下技術方案來實現:快速檢測豬乙型腦炎抗體試紙條，由吸水紙、硝酸纖維素膜、玻璃纖維素膜、樣品墊、支持物組成，硝酸纖維素膜含有由JEV E蛋白包被而成的檢測線和由羊抗JEV抗體包被而成的對照線，玻璃纖維素膜結合有膠體金標記的JEV E蛋白。用于包被檢測線的JEV E蛋白濃度為1.56mg/mL，用于包被對照線的羊抗JEV抗體濃度為2mg/mL。玻璃纖維素膜、硝酸纖維素膜和吸水紙按照以下次序相連接并附著在支持物上面，玻璃纖維素膜與靠近硝酸纖維素膜檢測線的一端相連接，吸水紙與靠近硝酸纖維素膜對照線的一端相連接；樣品墊附著在玻璃纖維素膜上，樣品墊的一端與硝酸纖維素膜相連接。硝酸纖維素膜上的檢測線和對照線的直接間隔為3 5mm，4mm最佳。支持物要求具有一定硬度，便于將樣品墊、膠體金墊、硝酸纖維素膜、吸水紙負載于其上，能夠達到支持和負載的目的即可。支持物首選塑料板(PVC)，也可以選擇鋁板、硬紙板作為支持物。上述快速檢測豬乙型腦炎抗體試紙條的制備方法，包括以下步驟:<1>JEV E蛋白的制備可按照常規基因工程手段進行，如E基因重組質粒誘導表達蛋白，以親和層析法對重組蛋白進行純化，谷胱甘肽還原法進行復性，經透析、濃縮及紫外分光度計測定后備用；<2>羊抗JEV抗體的制備用豬JE弱毒疫苗接種免疫陰性羊2頭，每隔2周加強免疫一次，共免疫3次,每次免疫的劑量分別為I頭份、2頭份、4頭份,最后一次免疫15天后采集血液，分離血清，純化后獲得羊抗JEV多抗；<3>硝酸纖維素膜的制備將濃度為1.56mg/mL的JEV E蛋白和濃度為2mg/mL的羊抗JEV抗體依次間隔4mm噴在硝酸纖維素膜上，分別作為檢測線和對照線，將包被好的硝酸纖維素膜干燥后備用；<4>玻璃纖維素膜的制備JEV E蛋白最適標記pH值為9.0，JEV E蛋白與膠體金溶液的配比為15.6 u g/mL ;用噴膜機將膠體金標記的JEV E蛋白復合物噴涂在玻璃纖維素膜，備用；〈5>將硝酸纖維素膜、玻璃纖維素膜、樣品墊、吸水紙按照以下次序粘貼在支持物上；將玻璃纖維膜(膠體金墊)連接在靠近硝酸纖維素膜檢測線的一端，邊緣附著在硝酸纖維素膜上；樣品墊附著在玻璃纖維膜上，與硝酸纖維素膜相連；吸水紙連接于硝酸纖維素膜的另一端，與靠近硝酸纖維素膜對照線的一端相連接。上述快速檢測豬乙型腦炎抗體試紙條的制備方法，還包括以下步驟:<6>將粘好硝酸纖維素膜、玻璃纖維素膜、樣品墊、吸水紙后的材料切成60_長、4_寬的試紙條，即為制備好的檢測JEV抗體的膠體金試紙條，方可使用。為便于長期保存，將試紙條裝入含有干燥劑的錫箔袋中。本發明采用膠體金標記純化的JEV E蛋白作為診斷抗原，應用酶聯免疫反應原理和膜層析技術制成了檢測JEV抗體的快速檢測豬乙型腦炎抗體試紙條。與乳膠凝集試驗、酶聯免疫吸附試驗、血清中和試驗、間接免疫熒光試驗相比，本發明的膠體金試紙條具有明顯的優勢:安全性好，不需要培養病毒，避免了操作帶來的病毒擴散的發生；基因工程表達純化的抗原成分穩定均一，易于制備，操作簡便省力，重復性好；試紙條可以大批量制備，工藝簡單，生產成本低廉；使用方便，無需特殊的實驗設備及器材，不需要專業培訓，只要滴加豬血清樣品后靜置15分鐘即可直觀、準確地判斷結果，易于推廣，尤其適合于基層現場檢測和流行病學調查。應用本發明的膠體金試紙條可以檢測JEV疫苗免疫豬的抗體，對豬場JEV免疫效果進行評價；也可以檢測感染豬血清中的JEV抗體，用于豬乙腦的輔助診斷，從而到達快速檢測、及時控制疫情的目的。本發明快速檢測豬乙型腦炎抗體試紙條檢測JEV抗體的方法:(I)操作方法將待檢樣品和試紙條在室溫條件下放置一定時間，使其恢復至室溫；將試紙條從包裝袋中取出后平放在試驗臺上；在橢圓形加樣空中加入2-3滴(IOOii L)待檢豬血清樣品；室溫靜置10-15分鐘后判定結果。(2)判定標準陽性:對照線(Control line)和檢測線(Test line)均出現一條紫紅色條帶,說明檢測樣品含有豬乙型腦炎抗體；檢測線顏色淺，說明抗體含量越低，判為弱陽性；檢測線顏色深，說明抗體含量越高，判為陽性或強陽性。陰性:對照線出現紫紅色條帶，而檢測線不顯色，說明檢測樣品無豬乙型腦炎抗體。無效:只要對照線不出現紫紅色條帶，說明本試紙條已失效。


圖1是本發明快速檢測豬乙型腦炎抗體試紙條的主視圖。圖2是本發明快速檢測豬乙型腦炎抗體試紙條的側視圖。圖中:1吸水紙，2硝酸纖維素膜，3含有膠體金標記的JEV E蛋白抗原，4樣品墊，5支持物，6包被JEV E蛋白抗原的檢測線，7包被羊抗JEV抗體的對照線。
具體實施例方式以下結合實施例進一步說明本發明的快速檢測豬乙型腦炎抗體試紙條及其制備方法。實施例1快速檢測豬乙型腦炎抗體試紙條I JEV E蛋白抗原的制備1.1主要材料、試劑及儀器質粒pET-32a_E、大腸桿菌BL21 (DE3) PlySs為廣西獸醫研究所病毒研究室制備保存；IPTG購自美國Promega公司；N1-NTA蛋白純化樹脂為QIAGEN公司產品；檸檬酸三鈉(C6H5Na3O7 *2H20)、氯金酸(AuCI3HCI *4H20)、牛血清白蛋白(BSA)均為美國Sigma公司產品；硝酸纖維素膜(NC)、玻璃纖維濾紙及吸水材料膜均為Millipore公司產品；試紙條底板，上海醫藥工業研究院產品；BioJet XYZ3000型點膜儀、CM4000試紙條切刀為美國BioDot公司產品；DV730核酸蛋白分析儀為Beckman Coulter公司產品；常用化學試劑均為國產分析純化學試劑。1.2 JEV E蛋白的誘導純化將分離到的JEV廣西地方毒株LC株的E基因截斷片段插入原核表達載體pET-32a，構建重組質粒pET-32a-E，將該重組質粒轉化大腸桿菌BL21 (DE3)PlySs, IPTG誘導表達融合蛋白，隨后以親和層析法對重組蛋白進行純化，并以谷胱甘肽還原法進行復性，經透析、濃縮及紫外分光度計測定，獲得純化重組蛋白，作為金標免疫層析法檢測用抗原。2制備羊抗JEV高免血清用豬JEV弱毒疫苗接種免疫陰性羊2頭，每隔2周加強免疫一次，共免疫3次，每次免疫的劑量分別為I頭份、2頭份、4頭份，最后一次免疫15天后采集血液，分離血清，純化后獲得羊抗乙腦多抗。3膠體金的制備采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金溶膠:取1%氯金酸ImL加超純水至IOOmL,配制為0.lg/L氯金酸溶液，置于帶冷凝裝置的燒瓶中加熱至沸騰，快速加入新鮮配制的IOg/L的檸檬酸三鈉溶液2.5mL并攪拌均勻，繼續煮沸直至溶液變為酒紅色。經紫外分光光度計測其520nm處吸收峰，得到直徑約為15nm左右的膠體金顆粒，冷卻后置于棕色瓶中，4°C冰箱保存。4膠體金標記抗原的制備及純化膠體金的標記:將待標記抗原倍比稀釋，分別取100 U L加入ImL膠體金中，IOmin后加入10%NaCl 100111，41:靜止111。取膠體金顏色沒有發生改變的最高稀釋倍數為準，在此基礎上加30%為最佳標記抗原量。取一定量制備好的膠體金用0.2mol/L K2CO3調至PH9.0，按最佳標記量加入表達抗原，室溫作用20min，加入Tris-HCl (pH8.0,20mmol/L)配制的BSA使終濃度為1%，4°C放置2h。金標抗原的純化:將金標抗原3000r/min離心30min，取上清以20000r/min4°C離心60min，棄去上清液，沉淀用pH8.5的TBS溶液溶解，即得到包被了蛋白質的金溶膠，即金標抗原，4 0C保存。5試紙條的裝配(I)硝酸纖維素膜的制備:將濃度為1.56mg/mL JEV E蛋白和濃度為2mg/mL羊抗乙腦抗體依次間隔4mm噴在硝酸纖維素膜上，分別作為檢測線和對照線，將包被好的硝酸纖維素膜干燥后備用；(2)玻璃纖維素膜的制備JEV E蛋白最適標記pH值為9.0，JEV E蛋白與膠體金溶液的配比為15.6 u g/mL ;用噴膜機將膠體金標記的JEV E蛋白復合物噴涂在玻璃纖維素膜，備用；(3)將硝酸纖維素膜、玻璃纖維素膜、樣品墊、吸水紙按照以下次序粘貼在支持物上；將玻璃纖維膜(膠體金墊)連接在靠近硝酸纖維素膜檢測線的一端，邊緣附著在硝酸纖維素膜上；樣品墊附著在玻璃纖維膜上，與硝酸纖維素膜相連；吸水紙連接于硝酸纖維素膜的另一端，與靠近硝酸纖維素膜對照線的一端相連接。(4)將粘好硝酸纖維素膜、玻璃纖維素膜、樣品墊、吸水紙后的材料切成60_長、4_寬的試紙條，即為制備好的檢測JEV抗體的膠體金試紙條(如圖1和2)，方可使用。為便于長期保存，將試紙條裝入含有干燥劑的錫箔袋中。試驗例I
I材料來源陽性參考血清:豬瘟病毒(CSFV)陽性血清、細小病毒(PPV)陽性血清、藍耳病毒(PRRSV)陽性血清、圓環病毒(PCV)陽性血清、偽狂犬病毒(PRV)陽性血清及乙腦病毒(JEV)標準陽性血清、標準陰性血清均購自武漢科前動物生物制品有限責任公司。待檢血清:試驗用豬血清樣品采自廣西區內規模場或散養戶，JEV疫苗免疫背景均詳細記錄。對照試劑盒:豬JEV抗體乳膠凝集(LAT)和ELISA試劑盒，均由武漢科前動物生物制品有限責任公司生產，批號為110803、120301。2應用本發明快速檢測豬乙型腦炎抗體試紙條的檢測方法及結果判定取50 UL的待檢血清加入到樣品墊，使溶液從樣品墊一端向吸水紙一端移動。5-10min后，顯現肉眼可見的紅色條帶時，即可判讀結果。陽性:對照線和檢測線均出現一條紫紅色條帶，說明檢測樣品含有豬JEV抗體。陰性:對照線出現紫紅色條帶，而檢測線不顯色，說明檢測樣品無豬JEV抗體；無效:只要對照線不出現紫紅色條帶，說明本試紙條已失效。3本發明快速檢測豬乙型腦炎抗體試紙條特異性試驗用試紙條將豬瘟病毒(CSFV)陽性血清、細小病毒(PPV)陽性血清、藍耳病毒(PRRSV)陽性血清、圓環病毒陽性血清(PCV)、偽狂犬病毒(PRV)陽性血清JEV各取50 y L分別滴于加樣孔中進行反應，結果檢測線均不出現紅色條帶；而用JEV標準陽性血清反應，在檢測線出現紅色條帶。證明膠體金試紙條具有良好的特異性與相關病毒的陽性血清無交叉反應。4本發明快速檢測豬乙型腦炎抗體試紙條敏感性試驗取JEV 陽性血清按 1:10、1:20、1:40、1: O、1:160、1:320、1:640、1:1280 進行倍比稀釋，分別取50 y L滴加膠體金加樣孔中，觀察結果；同時用武漢科前動物生物制品有限責任公司生產的JEV ELISA和LAT抗體檢測試劑盒檢測相同稀釋度的JEV陽性血清，以檢驗膠體金試紙條的敏感性。結果膠體金試紙條能檢出JEV陽性血清最大稀釋度為1:40，LAT能檢出JEV陽性血清最大稀釋度為1:40，ELISA試劑盒能檢出JEV陽性血清最大稀釋度為1:320 ;說明JEV膠體金試紙條的敏感性與LAT相當，較ELISA的敏感性稍低。5本發明快速檢測豬乙型腦炎抗體試紙條保存期試驗將膠體金試紙條室溫放置保存15個月，每月取出10條膠體金試紙條進行檢測，觀察結果。結果顯示，室溫放置保存15個月的試紙條，其效果沒有明顯的變化，所以其保存期為室溫至少可以保存10個月以上。6本發明快速檢測豬乙型腦炎抗體試紙條的臨床應用及與平行比對試驗應用本發明豬JEV抗體膠體金檢測試紙條對采集的963份豬血清進行檢測，同時用武漢科前動物生物制品有限責任公司生產的JEV LAT和ELISA抗體檢測試劑盒進行平行檢測，將上述三種檢測結果進行比較，以檢測膠體金試紙條與JEV LAT和ELISA抗體檢測試劑盒檢測結果的符合率。通過對臨床963份血清樣品進行檢測，膠體金試紙條檢出陽性樣品689份，陽性率71.55% (689/963)，陰性樣品274份，陰性率28.45%(274/963) ；LAT試劑盒檢出陽性樣品669份，陽性率69.47%(669/963)；陰性樣品294份，陰性率30.53%(294/963)；ELISA試劑盒檢出陽性樣品624份，陽性率64.80%(624/963)，陰性樣品339份，陰性率35.20%(339/963)。其中，膠體金試紙條與LAT均檢測為陽性的樣品656份，均檢測為陰性的樣品262份，膠體金試紙條與LAT結果符合率為95.33% ;膠體金試紙條與ELISA均檢測為陽性的樣品595份，均檢測為陰性的樣品241份，膠體金試紙條與ELISA結果符合率為86.81%。
權利要求
1.一種快速檢測豬乙型腦炎抗體試紙條，由吸水紙、硝酸纖維素膜、玻璃纖維素膜、樣品墊、支持物組成，其特征在于:所述硝酸纖維素膜含有由JEV E蛋白包被而成的檢測線和由羊抗JEV抗體包被而成的對照線，所述玻璃纖維素膜結合有膠體金標記的JEV E蛋白。
2.根據權利要求1所述的快速檢測豬乙型腦炎抗體試紙條，其特征在于:用于包被檢測線的JEV E蛋白濃度為1.56mg/mL，用于包被對照線的羊抗JEV抗體濃度為2mg/mL。
3.根據權利要求1所述的快速檢測豬乙型腦炎抗體試紙條，其特征在于:所述玻璃纖維素膜、硝酸纖維素膜和吸水紙按照以下次序相連接并附著在支持物上面，玻璃纖維素膜與靠近硝酸纖維素膜檢測線的一端相連接，吸水紙與靠近硝酸纖維素膜對照線的一端相連接；樣品墊附著在玻璃纖維素膜上，樣品墊的一端與硝酸纖維素膜相連接。
4.根據權利要求3所述的快速檢測豬乙型腦炎抗體試紙條，其特征在于:所述硝酸纖維素膜上的檢測線和對照線的直接間隔為3 5mm。
5.根據權利要求3所述的快速檢測豬乙型腦炎抗體試紙條，其特征在于:所述支持物是塑料板、硬紙板或鋁板。
6.根據權利要求1所述快速檢測豬乙型腦炎抗體試紙條的制備方法，其特征在于包括以下步驟: <1>JEV E蛋白的制備E基因重組質粒誘導表達蛋白，以親和層析法對重組蛋白進行純化，谷胱甘肽還原法進行復性，經透析、濃縮及紫外分光度計測定后備用； 〈2>羊抗JEV抗體的制備用豬JE弱毒疫苗接種免疫陰性羊2頭，每隔2周加強免疫一次，共免疫3次，每次免疫的劑量分別為I頭份、2頭份、4頭份，最后一次免疫15天后采集血液，分離血清，純化后獲得羊抗JEV多抗； <3>硝酸纖維素膜的制備將濃度為1.56mg/mL的JEV E蛋白和濃度為2mg/mL的羊抗JEV抗體依次間隔4mm噴在硝酸纖維素膜上，分別作為檢測線和對照線，將包被好的硝酸纖維素膜干燥后備用； <4>玻璃纖維素膜的制備JEV E蛋白最適標記pH值為9.0，JEV E蛋白與膠體金溶液的配比為15.6 u g/mL ;用噴膜機將膠體金標記的JEV E蛋白復合物噴涂在玻璃纖維素膜，備用; <5>將硝酸纖維素膜、玻璃纖維素膜、樣品墊、吸水紙按照以下次序粘貼在支持物上；將玻璃纖維膜連接在靠近硝酸纖維素膜檢測線的一端，邊緣附著在硝酸纖維素膜上；樣品墊附著在玻璃纖維膜上，與硝酸纖維素膜相連；吸水紙連接于硝酸纖維素膜的另一端，與靠近硝酸纖維素膜對照線的一端相連接。
7.根據權利要求1所述快速檢測豬乙型腦炎抗體試紙條的制備方法，其特征在于還包括以下步驟: <6>將粘好硝酸纖維素膜、玻璃纖維素膜、樣品墊、吸水紙后的材料切成60_長、4_寬的試紙條。
全文摘要
本發明公開了一種快速檢測豬乙型腦炎抗體試紙條及其制備方法，該試紙條由吸水紙、硝酸纖維素膜、玻璃纖維素膜、樣品墊、支持物組成，硝酸纖維素膜含有由JEV E蛋白包被而成的檢測線和由羊抗JEV抗體包被而成的對照線，玻璃纖維素膜結合有膠體金標記的JEV E蛋白。本發明應用膜層析間接夾心法，可以檢測乙腦免疫豬或感染豬血清中特異性抗體。應用本發明試紙條檢測豬乙腦抗體，操作簡單、方便、快速，不需要特殊的儀器設備，不需要專業培訓，結果清晰易辨，易于推廣，特別適合于基層現場檢測和流行病學調查，對豬乙腦的診斷有重要的輔助作用。
文檔編號G01N33/569GK103116022SQ20131002410
公開日2013年5月22日 申請日期2013年1月23日 優先權日2013年1月23日
發明者秦毅斌, 李斌, 趙武, 梁家幸, 何穎, 梁保忠, 蘇乾蓮, 閉炳芬, 陳忠偉, 段群棚, 盧冰霞 申請人:廣西壯族自治區獸醫研究所