專利名稱：一種植物體內鐵元素染色方法
技術領域：
:本發明屬于植物生物技術領域，具體涉及一種植物體內鐵元素染色方法。
背景技術：
:普魯士藍(Perls)染色法是一種古老而又敏感的顯示鐵的染色方法。反應原理是組織內的高價鐵與亞鐵氰化鉀反應生成不可溶的藍色沉淀(普魯士藍)。因為它操作簡單，成本低，特異性好，現為實驗室最常用的顯示生物體內鐵分布的方法(Meguro, Asanoet al.2007)。目前，在植物鐵代謝的研究中，顯示鐵分布的方法是在切片的基礎上再加上Perls 染色(Green and Rogers2004, Roschzttardtz, Conejero et al.2009, Zhang, Xu etal.2012)。這種方法不但不能從整體上顯示植物體內的鐵的分布，而且試驗周期長(大約一周)，費時，費力。水合氯醛試液，為常用優良的化學透明劑，它能迅速滲透入組織，還可以使干燥收縮的細胞迅速復原，并能溶解大多數細胞內含物，使細胞清晰透明。水合氯醛透明劑能否用在Perls鐵染色中，來替代費時費力的切片，還沒有研究報道
發明內容
:本發明的目的是彌補傳統的切片+Perls鐵染色方法的不足，提供一種簡單、快速、成本低的從整體上顯示植物體內鐵分布的植物體內鐵元素染色方法。本發明的植物體內鐵元素染色方法，其特征在于，包括以下步驟:將植物材料分割成小塊，將其浸入Perls染色液中染色，染色后的植物材料小塊用去離子水漂洗，漂洗后植物材料小塊置于水合氯醛試液中，直至植物材料小塊完全透明為止，取出植物材料小塊即得到鐵元素染色好的材料。鐵元素染色好的材料就可以置于載玻片上，也可以直接用水合氯醛試液+鐵元素染色好的材料制成臨時裝片，在顯微鏡下觀察，含鐵的組織被染成藍色(普魯士藍)。所述的水合氯醛試液屬于本領域技術人員常用的化學透明劑，其配制方法為:取水合氯醛50g，加水15ml和甘油10ml，溶解即為水合氯醛試液，備用。所述的Perls染色液屬于本領域技術人員常用的染色液，其配方為:(A) 4%鹽酸:取2ml濃鹽酸溶于50ml去離子水中；(B) 4%亞鐵氰化鉀:2g亞鐵氰化鉀溶于50ml去離子水中。每次染色前，將A液和B液等量混合，成熟15分鐘后，方可用于染色。所述的小塊，優選為2X2X2mm3的小塊，染色時長為30min，去離子水漂洗的次數為3次。漂洗后植物材料小塊置于水合氯醛試液中，直至植物材料小塊完全透明為止，在此過程中，可以更換一次水合氯醛試液。上述植物體內鐵元素染色方法的步驟中，1.所用的試劑最好用分析純，所使用的水是超純水或去離子水，所使用容器必須要純凈，操作全程最好配戴手套并避免與反應液體接觸，不要接觸金屬，這樣可以保證結果的可靠性；2.最好選用已知的陽性染色作為對照染色；3.Perls染色液一定要現用現配，超過I小時或溶液呈現微談綠色，說明該溶液失效了 ；4.Perls染色液中染色時注意觀察，可根據染色的深淺延長或縮短時間，這屬于本領域的常規知識。本發明將普魯士藍Perls鐵染色法和水合氯醛透明法有機的結合起來，在盡量保持植物材料完整的情況下，在整體上顯示其植物體內鐵的分布，其具有周期短:切片法一般需要一周的時間才能得到結果，而本方法可以在一天內得到結果；操作簡單，不需要昂貴設備的優點。
:圖1是實施例1的擬南芥種子經本發明方法染色后的染色圖；圖2是實施例1的擬南芥種子經本發明方法染色后的胚的染色圖；圖3是實施例2的水稻胚經本發明方法染色后的染色圖；圖4是實施例3的擬南芥的成熟種子經Perls-DAB染色法染色后橫切面的染色圖；圖5是實施例3的擬南芥的成熟種子經Perls-DAB染色法染色后縱切面的染色圖；圖6是實施例4的擬南芥花蕾經本發明方法染色后的染色圖。
具體實施方式
:以下實施例是對本發明的進一步說明，而不是對本發明的限制。水合氯醛試液，其配制方法為:取水合氯醛50g，加水15ml和甘油10ml，溶解即為水合氯醛試液，備用。Perls染色液，其配方為:(A) 4%鹽酸:取2ml濃鹽酸溶于50ml去離子水中；(B) 4%亞鐵氰化鉀:2g亞鐵氰化鉀溶于50ml去離子水中。每次染色前，將A液和B液等量混合，成熟15分鐘后，方可用于染色。實施例1:擬南芥種子中鐵染色及顯微鏡觀察(I)為了利于Perls染色液的滲透，用鋒利的刀片，將擬南芥的種皮切掉一部分。(2)將步驟(I)中處理的種子浸入新鮮配制Perls染色液中，染色30分鐘；Perls染色液的配制:4%亞鐵氰化鉀和4%鹽酸等量混合，成熟15分鐘后備用；(3)去離子水漂洗3次；(4)將漂洗后的種子置于水合氯醛試液中，透明8個小時以上，或者過夜，至種子完全透明為止；水合氯醛試液的配制:水合氯醛50g，水15ml和甘油10ml，溶解即得；(5)吸取適量的水合氯醛試液透明劑連同步驟(4)處理后的種子滴在載玻片上，蓋上蓋玻片，不要壓。將采用上述方法得到的片子在普通顯微鏡下觀察，照相。含鐵的組織被染成藍色(普魯士藍)，結果如圖1所示。稍微用力壓片，將胚從種皮中釋放出來，重新觀察照相，結果如圖2所示。本實施例能在整體上顯示擬南芥種子中鐵的分布，具有周期短、操作簡單、不需要昂貴設備的優點。
實施例2:水稻胚中鐵染色及顯微鏡觀察(I)用鋒利的刀片和解剖針，將胚從水稻種子中解剖出來(2)將解剖出來的胚浸入新鮮配制的Perls染色液中，染色30分鐘；Perls染色液的配制:4%亞鐵氰化鉀和4%鹽酸等量混合，成熟15分鐘后備用；(3)去離子水漂洗3次；(4)將漂洗后的胚置于水合氯醛試液中，透明8個小時以上，或者過夜，直至胚完全透明；水合氯醛試液的配制:水合氯醛50g，水15ml和甘油10ml，溶解即得；(5)將步驟(4)處理后的胚置于載玻片上，用鋒利的刀片把胚一切為2，蓋上蓋玻片，稍微用力壓一下。將采用上述方法得到的片子在普通顯微鏡下觀察，照相。含鐵的組織被染成藍色(普魯士藍)，結果如圖3所示。本實施例能在整體上顯示水稻胚中鐵的分布，具有周期短、操作簡單、不需要昂貴設備的優點。實施例3:對比試驗選取若干擬南芥的成熟種子，隨機分為兩份，一份經本發明的植物體內鐵元素染色方法進行染色，具體步驟見實施例1。一份經切片加Perls-DAB染色法，具體步驟如下:(I)將擬南芥種子，放入10%中性福爾馬林中(0.0lM PBS, PH=7.4)固定IOh以上，用0.0lMPBS漂洗3次，每次30分鐘；
(2)系列酒精脫水，每級l_2h ;(3)T0透明劑透明3次，每次2h ; (4)透蠟，碎蠟和TO透明劑1: 1，40度過夜，60度，換兩次純蠟，每次4h ; (5)石蠟包埋，美國AO切片機切片，厚6_8um，40度烘片過夜；(6)脫蠟和復水:T0透明劑2次，TO透明劑和無水乙醇1: 1，每次5分鐘，100%, 100%, 95%, 85%, 70%, 50%, 30%, 15%, ddH20系列酒精復水，每級5分鐘；(7)將切片浸入新鮮配制的Perls染色液中(4%亞鐵氰化鉀和4%鹽酸等量混合，成熟15分鐘)孵育30分鐘；
(8)去離子水漂洗3次；(9)DAB染液(武漢，博士德)，染30分鐘。封片觀察照相。結果如圖4和圖5所示，由圖4和圖5可見,用Perls-DAB染色法鐵元素顯色的位置與實施例1中按照本發明的方法進行鐵元素染色后的結果一致(圖1)，由此說明，本發明的方法是可靠，可行的。表1:兩種方法的指標對比
權利要求
1.一種植物體內鐵元素染色方法，其特征在于，包括以下步驟:將植物材料分割成小塊，將其浸入PerlS染色液中染色，染色后的植物材料小塊用去離子水漂洗，漂洗后植物材料小塊置于水合氯醛試液中，直至植物材料小塊完全透明為止，取出植物材料小塊即得到鐵元素染色好的材料。
2.根據權利要求1所述的植物體內鐵元素染色方法，其特征在于，所述的小塊為2X2X2mm3的小塊，染色時長為30min，去離子水漂洗的次數為3次。
3.根據權利要求1所述的植物體內鐵元素染色方法，其特征在于，漂洗后植物材料小塊置于水合氯醛試液中，直至植物材料小塊完全透明為止，在此過程中，更換一次水合氯醛試液。
全文摘要
本發明公開了一種植物體內鐵元素染色方法。它是將植物材料分割成小塊，將其浸入Perls染色液中染色，染色后的植物材料小塊用去離子水漂洗，漂洗后植物材料小塊置于水合氯醛試液中，直至植物材料小塊完全透明為止，取出植物材料小塊即得到鐵元素染色好的材料。本發明將普魯士藍Perls鐵染色法和水合氯醛透明法有機的結合起來，在盡量保持植物材料完整的情況下，在整體上顯示其植物體內鐵的分布，其具有周期短切片法一般需要一周的時間才能得到結果，而本方法可以在一天內得到結果；操作簡單，不需要昂貴設備的優點。
文檔編號G01N1/30GK103207104SQ201310108059
公開日2013年7月17日 申請日期2013年3月29日 優先權日2013年3月29日
發明者葉宏, 劉培衛, 秦璐, 王美歡, 梁雪嬌 申請人:中國科學院華南植物園