用于評價化妝品的皺紋改善效果的方法
【專利摘要】本發明的課題是，提供能夠對候選化妝品的角質層的皺紋改善能力迅速并且大規模地實施評價的化妝品評價方法。本發明提供了，通過將帶有褶皺的角質層片浸漬在候選化妝品中確認干燥后的褶皺消失狀態、來評價候選化妝品的皺紋改善效果的評價方法，從而解決上述課題。
【專利說明】用于評價化妝品的皺紋改善效果的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及化妝品的評價方法。優選地、本發明涉及用于評價化妝品的皺紋改善效果的方法。
【背景技術】
[0002]隨著年齡增長，作為皮膚的老化現象之一，皺紋也隨之增加，但從美容等的觀點出發，特別是女性、對皺紋的防止和改善的熱情非常高。皺紋大致可分為由于包含角質層的表皮的功能降低而產生的小皺紋、和由于比表皮更深的真皮的功能降低而產生的大皺紋(或表情皺紋)。由于包含角質層的表皮的功能降低而產生的皺紋，主要是由于表皮的水分保持功能受年齡增長、紫外線、低溫、低濕等的影響而降低，從而產生的。另一方面，一般認為，由于真皮的功能降低而產生的皺紋，是由于基質金屬蛋白酶(MMPs)受老化、紫外線、以及機械性壓力的影響而發生增減，導致含有膠原蛋白、彈性蛋白(Elastin)的皮膚的彈力結構狀態崩潰而產生的(專利文獻1、非專利文獻1、2和3)。已經知道了，皮膚上產生的小皺紋的溝變深，會向大皺紋轉變(非專利文獻4)，小皺紋和大皺紋緊密相關。
[0003]在非常干燥的冬季容易產生小皺紋，這是許多人的共識，大家都認為，為了預防和改善小皺紋，用化妝品、特別是化妝水、乳液、軟膏、美容液等進行保濕、并且使用加濕器進行加濕這些很重要。以保濕為目的的化妝品，特別是含有甘油、透明質酸等保濕劑的化妝品一直都在被人們使用著。
[0004]迄今為止已經知道了，使用了干燥表皮的粗糙皮膚模型來篩選能夠提高角質層透明度的候選物質的方法(專利文獻2)、以角質層細胞間脂質的結構變化作為指標來篩選能夠改善或提高皮膚阻擋功能的候選物質的方法(專利文獻3)。但這些方法篩選的是改善角質層透明度或皮膚阻擋功能的候選物質，還沒有關于對改善皺紋的候選物質進行篩選的記載。
[0005]現有技術文獻
[0006]專利文獻
[0007]專利文獻1:日本特開2003 - 201229號
[0008]專利文獻2:日本特開2010 - 172200號
[0009]專利文獻3:日本特開2010 - 175264號
[0010]專利文獻4:日本特開2010 - 119428號
[0011]非專利文獻
[0012]非專利文獻1: Arch Dermatol Res (2002) 294:405 — 410
[0013]非專利文獻2:Cell Motil Cytoskeleton 2000 Jan ；45 (I):1 — 9
[0014]非專利文獻3:Matrix B1l.2001 Nov ；20(7):397 — 406
[0015]非專利文獻4: Skin Research and Technology 2011 ； 17: 135 — 140
【發明內容】
[0016]發明要解決的課題
[0017]大家都希望開發出能夠對角質層上的皺紋進行修復的化妝品，因而需要能夠對候選化妝品的角質層的皺紋改善能力進行迅速并且大規模地實施評價的化妝品的評價方法。
[0018]解決課題的手段
[0019]本發明人對由于包含角質層的表皮的功能降低而產生的小皺紋的產生機理進行了深入研究，結果發現了，由于角質層的功能降低和皮膚下存在的筋肉的運動而產生的非定性的角質層性的皺紋(本說明書中定義為“假性皺紋”)的溝，不能夠通過洗澡、化妝品的保濕等充分地修復，這樣長時間得不到修復就會產生定性的小皺紋(圖1)。具體地說，在角質層上產生的非定性的假性皺紋，是在皮膚中特別硬的角質層上產生的慣性褶，硬的角質層上的溝成為機械應力，定型成為表皮上的溝，由此形成比靜態皺紋深的表皮性的小皺紋。
[0020]小皺紋由包含角質層的表皮的功能降低產生，主要是由于冬季干燥而產生的，這是經驗上已知的。通過對小皺紋使用化妝水、乳液進行充分保濕，能夠修復和改善小皺紋，這是已知的，但是，一旦小皺紋在比角質層更內部的表皮(顆粒層、棘層、基底層)上也定型了，那么即使進行保濕、一時間可以消滅小皺紋，但時間一長，小皺紋就會又出現。如果將這樣在表皮上定型了的小皺紋放置不管，就會成為進而隨著表皮的深部的真皮中的膠原蛋白和彈性蛋白等的結構變化而發展成大皺紋的原因，即使對大皺紋進行保濕也難以修復，這是眾所周知的事實。
[0021]過去對隨著表皮的結構變化而產生的小皺紋，很漠然地認識到，有可通過保濕進行修復的輕度皺紋、和即使進行保濕、也只能一時間使皺紋消失的重度皺紋，但無論如何，對于小皺紋的預防，大家都認為保濕是必要的，但對能夠修復小皺紋的化妝品的評價還不能合適地進行。經本發明人的研究發現了，在隨著表皮的結構變化而產生的皺紋中，能夠通過保濕進行修復的輕度皺紋是僅在角質層上發生結構變化的皺紋(假性皺紋)，而即使進行保濕、也只能期待僅一時間能夠修復的重度皺紋是由于除了在角質層以外、還在包含顆粒層、棘層、基底層的表皮上發生結構變化而產生的皺紋(本說明書中將其定義成“小皺紋”或“定性的小皺紋”。)。
[0022]本說明書中定義的假性皺紋，指的并不是在角質層以外的表皮和真皮中發生結構變化，而是通過皮下筋肉的運動在由于干燥等原因而功能降低了的角質層上產生了慣性褶的狀態。已經知道了，如果將這樣的慣性褶放置不管，則慣性褶就會成為機械應力，在包含角質層的表皮上發生結構變化，轉變成定性的小皺紋。再者，時間一長、小皺紋就會轉變成大紋(非專利文獻4)，因此，在化妝品的開發中發現了，開發出能夠對假性皺紋中的角質層的慣性褶進行修復的化妝品，這對于定性的小皺紋形成的預防、甚至大皺紋形成的預防都很重要。這樣的化妝品能夠解放由假性皺紋產生的機械應力，所以通過在一定長的期間連續使用該化妝品，就能夠對已經在表皮上定型的小皺紋或是在真皮上定型的大皺紋發揮改善效果。
[0023]進而本發明人對假性皺紋進行了深入研究，驚訝地發現了，能夠使用角質層片將假性皺紋模型化。即、角質層片上帶有褶皺的狀態，簡直就是在角質層上通過皮下筋肉運動而產生了慣性褶的狀態的假性皺紋的模型化，能夠合適地修復該褶皺的化妝品就夠合適地修復皺紋、特別是假性皺紋，甚至有助于定性小皺紋和大皺紋的改善。
[0024]因此，本發明人發現了，通過將帶有褶皺的角質層片在候選化妝品中浸潤、干燥，可以測定皺紋改善度，從而發明了候選化妝品的皺紋改善效果的評價方法。
[0025]更具體地說，本發明涉及以下技術方案。
[0026](I).一種候選化妝品的皺紋改善效果的評價方法，包含以下工序:
[0027]對培養角質層片賦予褶皺的工序；
[0028]浸潰在候選化妝品中的工序；
[0029]干燥的工序；以及
[0030]測定培養片的褶皺改善度的工序。
[0031](2).如項目I所述的評價方法，褶皺改善度的測定通過目視進行。
[0032](3).如項目I所述的評價方法，在浸潰在候選化妝品中的工序前和干燥工序后，包含對培養片拍照的工序。
[0033](4).如項目3所述的評價方法，褶皺改善度的測定通過拍攝到的培養片的圖像處理進行。
[0034](5).如項目I?4的任一項所述的評價方法，其特征在于，皺紋改善效果是對假性皺紋的改善效果。
[0035]發明效果
[0036]一直以來，在皺紋的評價中都需要對動物模型或實際的人皮進行試驗，但在個體差異的問題、倫理上的問題、試驗數量方面受到限制，由于本發明可以使用角質層片來評價候選化妝品，所以能夠實現產品開發時的大規模、均質的篩選，能夠使產品開發變得容易。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0037]圖1是顯示人的面部皮膚中的假性皺紋的形成的照片。
[0038]圖2是顯示角質層片皺紋模型中的皺紋改善效果的圖。
[0039]圖3是顯示活體(in vivo)的表情運動前后的皺紋狀態、以及表情運動剛剛過后的模型化妝水涂抹后的皺紋狀態的對比圖。
【具體實施方式】
[0040]作為第一方案，本發明提供了對候選化妝品的皺紋改善效果進行評價的方法。更具體地說，本發明的評價方法包含選自以下工序中的I種以上工序:
[0041]對角質層片賦予褶皺的工序；
[0042]浸潰在候選化妝品中的工序；
[0043]干燥的工序；和
[0044]測定角質層片的褶皺改善度的工序。
[0045]本發明的候選化妝品是指，有可能會對皺紋改善有效果的化妝品。更具體地說，候選化妝品特別是指化妝水、乳液、軟膏、美容液，但是那些不是以皮膚的改善作為直接目的、但有意圖涂抹到皮膚上的所有東西例如，防曬劑、除蟲劑、脫毛劑、生發劑、刮胡劑、刮胡后護理劑等也包括在內。從通過向角質層片中浸潤、干燥而發揮皺紋改善效果的觀點，可以認為，本發明的候選化妝品優選是水性的化妝品，例如化妝水、美容液。
[0046]皺紋改善效果是指，皮膚上形成的皺紋消失。從本發明的觀點來看，優選在角質層上產生的作為慣性褶的假性皺紋的消失或減弱，但并不局限于此，也指隨著含有角質層的表皮的結構變化而產生的小皺紋、和隨著真皮結構變化而產生的大皺紋消失或減弱。
[0047]本發明中，角質層片是指從活體的皮膚調制出的角質層片(調制角質層片)、或經細胞培養而得到的角質層片(下面稱作“培養角質層片”)，但從大規模并且均一地篩選的觀點，優選培養角質層片。
[0048]雖然對調制角質層片的由來并沒有限定，但特別優選是從人皮膚中的角質層獲取的角質層片。更具體地說，也可以是通過外科手段等侵襲性方法獲取的角質層片。
[0049]培養角質層片，是指通過體外(in vitro)培養而得到的角質層的片，包含:從將由人等的皮膚獲取的皮膚組織培養并維持得到的物質中分離出的角質層片、從三維培養皮膚中得到的角質層片，所述三維培養皮膚是在由膠原蛋白、纖維蛋白、聚乳酸等聚合物、或幾丁質、殼聚糖、硫酸軟骨素、透明質酸等多糖類構成的培養支撐體上培養成纖維細胞、或者由干細胞(例如上皮干細胞、胚胎干細胞、誘導多能干細胞)體外(in vitro)分化得到的成纖維細胞而得的。角質層片是使用在控制了鈣離子和鎂離子濃度的生理鹽水中通過蛋白質分解酶進行處理等的方法，從在培養下維持的皮膚組織中分離得到的。作為三維培養皮膚，使用可以從LabCyte EP1-MODEL (株式會社y' \f〗'7 二.工 > 夕二 7丨」>夕'' )商業獲得的人三維培養表皮模型產品。從可商業獲得的三維培養表皮模型產品得到的培養角質層片，由于批次間的差異小，所以可以使用不同批次的來實施本發明的評價方法，但是為了不出現批次間的差異，可以將I個培養角質層片切分成幾片，再用于本發明。
[0050]本發明中，可以用手使角質層片產生褶皺，但是為了產生固定不變的褶皺，可以使用具有折葉部的板，通過將板折到固定不變的角度來賦予褶皺。可以根據預定的褶皺的深度來選擇任意的角度，例如可以選自30°、45°、60°、75°、90°、120°、135°、150°、180。。
[0051]將本發明中的角質層片在化妝品的通常使用溫度范圍內浸潰在候選化妝品中。浸潰溫度可以優選地按照候選化妝品的使用地域的溫度來相應設定，通常是10°C?40°C的范圍、優選為15°C?30°C的范圍、更優選為20°C?30°C的范圍。浸潰時間可以選擇任意的時間，但如果縮短浸潰時間，則可以篩選出皺紋改善能力更高的候選化妝品。作為浸潰時間，可以選擇10秒、15秒、30秒、I分鐘、2分鐘、3分鐘、5分鐘、10分鐘、20分鐘、30分鐘、45分鐘、I小時、1.5小時、2小時、3小時、或更長的時間例如4小時、8小時、12小時、24小時等。在候選化妝品在皮膚上的涂抹是預先確定的情況，涂抹在皮膚上的候選化妝品通常會在較短的時間蒸發，所以要選擇10秒?2分鐘左右的較短的浸潰時間。另一方面，在候選化妝品要以膜貼等形式進行應用的情況，要選擇10分鐘、20分鐘、30分鐘至一晚這樣的更長時間。浸潰，只要是與候選化妝品接觸即可，也可以是通過滴下或涂抹來與候選化妝品接觸的工序。
[0052]作為候選化妝品中可以含有的成分，作為主劑可以包含水、乙醇、甘油、聚乙二醇等醇類，作為保濕劑可以包含甘氨酸、甜菜堿、吡咯烷酮羧酸鈉等氨基酸類、果糖、麥芽糖醇、甘露糖醇、海藻糖等糖類，作為表明活性劑可以包含油酸甘油酯、異硬脂基甘油基醚、植物精油，作為油分可以包含霍霍巴油、山茶油、橄欖油、角鯊烷等，進而作為有效成分可以包含透明質酸、膠原蛋白、神經酰胺、抗壞血酸酸、維他命E等，并且作為賦形劑可以包含檸檬酸鈉、檸檬酸、乳酸鈉，作為防腐劑可以包含苯甲酸鹽、山梨酸等，但不限于這些。也可以含有在通常的化妝品中使用的任一種成分。
[0053]本發明中，通過浸潰而被候選化妝品浸潤了的角質層片，在過了規定的浸潰時間后，要被干燥。干燥工序可以在任意的溫度和濕度下進行，但優選在預測的、候選化妝品通常使用中的溫度和濕度下進行。例如，溫度和濕度根據候選化妝品的銷售地域等而異，但可以分別獨立地、選擇10°C?40°C、優選為15°C?30°C、進而優選為20°C?30°C范圍的溫度，并且選擇30?90%、優選為40?80%、進而優選為50?60%范圍的濕度。從可以縮短篩選時間的觀點，也可以在比預測的、候選化妝品通常使用中的溫度和濕度更高的溫度和/或更低的濕度下進行干燥工序。
[0054]角質層片的褶皺改善度的測定，通過目視評價褶皺的消失程度來進行。可以以使用例如基準溶液例如10%甘油水溶液、在相同條件下經歷了褶皺的賦予工序、浸潰工序、和干燥工序后的褶皺的消失程度作為基準，將與基準同等或與基準相比褶皺更加消失了的、作為具有優異的皺紋改善效果的候選化妝品篩選出來。反之，將與基準相比褶皺沒有消失的、判定成是不具有皺紋改善效果的候選化妝品。這里，作為基準溶液可以選擇任意的溶液，但也可以使用已市售的化妝品、美容液等作為基準溶液。
[0055]褶皺的改善度的測定，也可以通過圖像處理來評價褶皺的消失程度。在這種情況，在褶皺的改善度的測定工序中還可以包含對角質層片拍照的工序、進行二值化處理的工序。通過進行二值化處理，可以將褶皺的消失程度數值化，從對大量候選藥劑進行高通量篩選的觀點，優選通過圖像處理進行評價。
[0056]下面將列舉具體例來對本發明進行更具體說明。再者，本發明并不受這些例子限定。
[0057]實施例
[0058]實施例1:假性皺紋的形成
[0059]讓I名受試人用肥皂洗臉，然后在人工氣候室(溫度22?24°C、濕度10?45%RH)中熟化10?30分鐘，在熟化后對眼角皺紋進行拍照(圖1左)。接著，將緊緊閉眼和睜眼的動作每5秒進行10次，將此作為表情運動。在表情運動后馬上對眼角皺紋進行拍照(圖1右)。如圖1中箭頭所示，在表情運動剛結束時，像是將原本存在的大皺紋拉長了那樣、形成了假性皺紋。
[0060]實施例2:針對褶皺改善的候選藥劑篩選
[0061]從株式會社-7' \f ^ 二 ?工> -7' 二 7* ^ >夕''買入人表皮再構建模型。將其用胰蛋白酶處理，使角質層片在32°C、濕度60%下干燥而得到透明的角質層片。將其折成90度角度，然后再恢復到原來，由此就在角質層片上形成了褶皺。在褶皺部分、角質層透明度降低，將受破壞部位可視化(圖2左面照片)。將帶有褶皺的角質層片作為皮膚在由于表情變化而伸縮后在皮膚表面產生的假性皺紋的模型，將其用于美容法或化妝品的評價中。將帶有褶皺的角質層片在室溫(23°C)下浸潰在模型化妝水(10%甘油、3%乙醇、
0.3%HC060(聚乙二醇(60)氫化硬化蓖麻油醚(日光 > 彡力X株式會社))、0.09%檸檬酸鈉，0.01%檸檬酸)或乙醇中30分鐘，將其在32°C、濕度60%下干燥18小時，然后拍照(圖2)。結果顯示了，模型化妝水對角質層褶皺的修復有效。
[0062]實施例3:通過活體(in vivo)的表情運動進行的皺紋形成、和通過涂抹模型化妝水進行的皺紋改善
[0063]讓I名受試人用肥皂洗臉，然后在人工氣候室(溫度22?24°C、濕度10?45%RH)中熟化10?30分鐘，熟化后馬上依照前述的方法獲取皮膚復制品。接下來在面膜板上獲取進行表情運動(多次進行緊緊閉眼的動作)后的復制品。然后，涂抹模型化妝水，在這10分鐘后，通過前面進行的方法獲取復制品。針對獲取的復制品，使用依照專利文獻4中記載的方法制作的圖像解析軟件進行三維圖像解析，計算出皺紋的面積率。結果如圖3所示。該實驗顯示了，對于由表情運動形成的假性皺紋，在活體的實驗中也顯示出了通過模型化妝水的涂抹等能夠改善皺紋，至于帶有褶皺的角質層片，其將假性皺紋合適地模型化了，通過利用本發明的帶有褶皺的角質層片進行的化妝品或美容法的篩選方法選出的化妝品實際上在活體的實驗中也能夠改善皺紋。
[0064]像這樣，如果是通常、要調查化妝品對皺紋的改善效果，需要進行使幾個人?幾十個人的檢驗人歷時幾個星期使用候選化妝品的檢驗試驗，而通過將帶有褶皺的角質層片作為假性皺紋的模型，能夠簡單且方便地對具有皺紋改善效果的候選化妝品進行一次篩選。
【權利要求】
1.一種候選化妝品的皺紋改善效果的評價方法，包含以下工序: 對培養角質層片賦予褶皺的工序； 浸潰在候選化妝品中的工序； 干燥的工序；以及 測定培養片的褶皺改善度的工序。
2.如權利要求1所述的評價方法，褶皺改善度的測定通過目視進行。
3.如權利要求1所述的評價方法，在浸潰在候選化妝品中的工序前和干燥工序后，包含對培養片拍照的工序。
4.如權利要求3所述的評價方法，褶皺改善度的測定通過拍攝到的培養片的圖像處理進行。
5.如權利要求1?4的任一項所述的評價方法，其特征在于，皺紋改善效果是對假性皺紋的改善效果。
【文檔編號】G01N21/84GK104185785SQ201380015586
【公開日】2014年12月3日 申請日期:2013年3月6日 優先權日:2012年3月27日
【發明者】巖井一郎, 原祐輔 申請人:株式會社資生堂