鳥苷發酵過程紅外指紋圖譜的構建方法
【專利摘要】本發明涉及鳥苷發酵過程紅外指紋圖譜的構建方法，屬于生物發酵檢測【技術領域】。該方法包括鳥苷發酵液樣品采集和制備、光譜采集、鳥苷發酵液紅外吸收特征峰位置的確定、鳥苷發酵前、中、后期指紋圖譜的構建和指紋圖譜的驗證五大步驟。通過本發明構建鳥苷發酵不同時間段的紅外指紋圖譜，實現了利用紅外指紋圖譜方便快捷的監控鳥苷發酵過程，建立紅外指紋圖譜監測鳥苷發酵過程的新方法，為生物發酵過程的優化控制開辟更為便捷的新途徑。
【專利說明】鳥苷發酵過程紅外指紋圖譜的構建方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物發酵檢測【技術領域】，具體涉及鳥苷發酵過程紅外指紋圖譜的構建方法。
【背景技術】
[0002]指紋圖譜是法醫學上的一個概念，最早來源于19世紀末、20世紀初的犯罪學和法醫學。由于指紋具有人各不同，終生不變，觸物留痕，可以認定人身的特點，指紋鑒定結論在偵察和審判中起著重要作用，被稱為“物證之首”、“證據之王”。紅外指紋圖譜鑒別技術將光譜測量技術、計算機技術、化學計量學技術與基礎測試技術有機結合，參照已知產品的組成或性質的信息，采用化學計量學技術提取出樣品紅外光譜的指紋特征，確定樣品的特征指紋圖譜或進一步建立判定模型，從而通過圖譜比較或模型識別實現樣品的鑒別或進一步判斷待測樣品是否合格的一種分析方法。該技術結合了指紋圖譜概念和紅外光譜分析技術，分析范圍幾乎可覆蓋所有的有機化合物和混合物。這一技術具有樣品無損、制樣檢測快速、準確、重復性好等優點，在幾分鐘內即可完成樣品的檢測。與常規的化學方法分析發酵液成分相比較，具有快速簡便的特點，可同時監測培養過程中多組分濃度的變化，優化培養基的組成和發酵過程的進程。
[0003]目前，紅外指紋圖譜在中藥質控領域卓見成效，它可準確且又可量化地對藥材進行真偽鑒別和質量評價。清華大學分析中心在紅外指紋圖譜質控中藥領域的成績斐然，該中心已經先后測試了 280種對照藥材，20種偽品藥材，4種不同產地的藥材，400多種中藥配方顆粒等，獲得共計2000多張紅外光譜、二階導數譜和幾百張二維相關紅外譜。孫素琴等所著《中藥二維相關紅外光譜鑒定圖集》一書在國外也產生了非常大的影響，已傳入美國、英國、新加坡、馬來西亞等國。另外，紅外指紋圖譜在飼料添加劑和食品應用也引起了越來越多的重視。中科院飼料所張萍研究員帶領的研究團隊成功開發出飼料添加劑產品紅外指紋圖譜鑒別技術。2007年，北京市食品安全監控中心與清華大學開展紅外指紋圖譜等前沿技術在食品安全監控中的應用研究，將“紅外指紋”圖譜技術正式應用到食品安全監控中。紅外指紋圖譜在中藥、食品、飼料添加劑領域的應用，開辟了相應領域質量監控技術的新篇.1V.早。
[0004]20世紀90年代以來，紅外光譜分析技術在發酵液檢測方面的應用得到越來越多的關注。Zeaiter等利用近紅外檢測葡萄酒發酵過程中溫度變化產生的影響，Georgina等利用近紅外與偏最小二乘法相結合監測啤酒發酵過程的生物量和化學變化。彭幫柱等采用分階段處理結合人工神經網絡法對不同發酵階段的糖度檢測。邱江等用偏最小二乘法建立了培養液的紅外光譜數據與常規離線化學分析結果的相關關系，成功地用于糖化酶發酵過程培養液中總糖、還原糖和氨氮的預測。陳雷等用聲光可調(AOTF)-近紅外(NIR)光譜技術對發酵液中發酵菌的含量進行檢測。劉賢等采用近紅外光譜技術，結合偏最小二乘回歸法，研究了 142個不同種類的秸桿青貯飼料樣品的pH值和發酵產物(乳酸、乙酸、丙酸、丁酸和氨態氮)。張夢霖等利用近紅外光譜技術對廢水厭氧發酵處理過程進行分析監測，建立了厭氧發酵過程中蔗糖和揮發性脂肪酸濃度的預測模型、實現了準確地測定厭氧發酵過程中液相中各組分的濃度變化，為厭氧發酵過程的在線監測提供了新的思路。國內外紅外光譜技術在發酵過程檢測中的研究，為本課題順利開展提供思想和技術方法上的有利支撐。
[0005]鳥苷發酵過程是一個實時、非線性、多變量輸入輸出和隨機性的動態過程，發酵過程中發酵液組成復雜，組分和含量具有時變性，至今為止鳥苷發酵過程的監測控制主要依賴操作繁瑣、費時費力的化學分析檢測。如何快捷檢測鳥苷發酵過程，了解鳥苷發酵的動態，優化控制鳥苷發酵過程，一直以來是鳥苷發酵工作者研究的主要領域。紅外光譜分析技術是一門發展迅猛的高新技術，不僅廣泛應用于化學組成和結構的定性定量鑒別，而且在發酵過程的檢測中日益顯示出特有的優勢。許多發酵過程都嘗試著使用紅外光譜分析技術進行檢測。但是，目前紅外光譜技術在發酵領域的使用多為發酵液中某一和幾個組分的檢測，很難真正意義上監測控制生物發酵過程，因此如何克服現有技術的不足是目前分析化學【技術領域】亟需解決的問題。
【發明內容】
[0006]本發明的目的是為了解決現有技術的不足，提供鳥苷發酵過程紅外指紋圖譜的構建方法。
[0007]本發明構建鳥苷發酵不同時間段的紅外指紋圖譜，實現利用紅外指紋圖譜方便快捷的監控鳥苷發酵過程，建立紅外指紋圖譜監測鳥苷發酵過程的新方法，為生物發酵過程的優化控制開辟更為便捷的新途徑。
[0008]本發明采用的技術方案如下:
[0009]鳥苷發酵過程紅外指紋圖譜的構建方法，包括如下步驟:
[0010]步驟(I)，發酵液樣品采集和制備:
[0011]I)菌種活化
[0012]取平板上的單菌落劃線接種于活化斜面，36_38°C恒溫靜置培養12_14h ；
[0013]2)種子培養
[0014]接兩環生長良好的活化斜面菌種放入裝有種子培養基的搖瓶中，紗布封口，置于往復式搖床上，36-37°C振蕩培養12-18h，得到種子液；
[0015]3)鳥苷發酵
[0016]將上述種子液以10%的接種量接入裝有發酵培養基的三角瓶中，置于往復式搖床上或發酵罐中，36-37 °C，培養72h，獲得發酵液；
[0017]4)采集
[0018]將10批次的鳥苷發酵每隔9h從三個平行樣品中分別采集3份發酵液樣品，其中0-27h所采樣品為發酵前期樣品、27-45h的樣品為發酵中期樣品，45-72h的樣品為發酵后期樣品；
[0019]步驟(2)，發酵液鳥苷含量的測定:
[0020]發酵液中鳥苷含量采用常用的高效液相色譜法定量測定；
[0021]步驟(3)，光譜采集:
[0022]利用紅外光譜儀采集光譜，以空氣為參比，對步驟(I)得到的發酵前、中、后期樣品的發酵液分別重復掃描次數5次，取平均光譜；
[0023]步驟(4)，鳥苷發酵液紅外吸收特征峰位置的確定:
[0024]利用純水、鳥苷標準品及發酵上層清液為對照，確定發酵液紅外特征峰的位置；
[0025]步驟(5)，鳥苷發酵前、中、后期指紋圖譜的構建:
[0026]以鳥苷發酵液特征峰為主要研究對象，根據步驟(2)測定的發酵液中的鳥苷含量，研究鳥苷發酵前、中、后期紅外吸收圖譜特征，構建指紋圖譜；
[0027]步驟(6)，指紋圖譜的驗證:
[0028]10批次搖床及5批次發酵罐驗證指紋圖譜可靠性。
[0029]本發明技術方案中步驟(I)中所述的種子培養時，接兩環生長良好的活化斜面菌種放入裝有15mL種子培養基的250mL搖瓶中。
[0030]本發明技術方案中步驟(I)中種子培養時，紗布封口的紗布層數為8層。
[0031]本發明技術方案中步驟(I)中種子培養和鳥苷發酵時，往復式搖床的沖程76mm，速度為108r/min。
[0032]本發明技術方案中步驟(I)中鳥苷發酵時，將上述種子液以10%的接種量接入裝有20ml發酵培養基的500ml三角瓶中。
[0033]本發明技術方案中步驟(I)中10批次為往復式搖床和發酵罐發酵各5批。
[0034]本發明技術方案中所述的發酵罐發酵的發酵罐為10L，發酵條件為溫度36°C，轉速600轉/分，ρΗ6.5，填料系數0.7，溶氧30-40%。
[0035]本發明技術方案中所述的紅外光譜儀為德國BRUKER Tensor 27紅外光譜儀。
[0036]本發明技術方案中所述的紅外光譜的波長范圍為4000-600CHT1。
[0037]本發明技術方案中所述的鳥苷發酵每隔9h從三個平行樣品中分別采集Iml的3份發酵液樣品。
[0038]本發明技術方案中所述的發酵上層清液為相應的發酵液離心后所得。
[0039]本發明與現有技術相比，其有益效果為:本發明構建鳥苷發酵不同時間段的紅外指紋圖譜，實現利用紅外指紋圖譜方便快捷的監控鳥苷發酵過程，建立紅外指紋圖譜監測鳥苷發酵過程的新方法，為生物發酵過程的優化控制開辟更為便捷的新途徑；(2)本發明構建的紅外指紋圖譜對于鳥苷產量測定具有重要的意義。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0040]圖1是純水、發酵64h發酵液、發酵64h發酵液的上清液紅外吸收光譜；
[0041]圖2是鳥苷標準品的紅外吸收光譜圖；
[0042]圖3是發酵0_27h發酵液紅外吸收光譜比較圖；
[0043]圖4是發酵27_45h發酵液紅外吸收光譜比較圖；
[0044]圖5是發酵45_72h發酵液紅外吸收光譜比較圖。
【具體實施方式】
[0045]下面結合實施例對本發明作進一步的詳細描述。
[0046]本發明實施例采用的材料、儀器、試劑和培養基的具體說明如下:
[0047]1.1 材料
[0048]鳥苷產生菌(Bacillus subtilis)(保存于河南科技學院發酵工程實驗室)
[0049]1.2 儀器
[0050]
TENSOR 27型紅外光譜儀德國BRUKER
生化培養箱(SPX-250)上海躍進醫療器械廠
[0051]
落地往復搖床太倉市科教器材廠
臺式高速離心機上海安亭科學儀器廠
電子天平上海精科天平
精密天平上海精科天平
隔水式電熱恒溫培養箱上海躍進醫療器械廠
三角瓶、移液管、培養皿、量筒天津玻璃器械廠
SW-CJ-2FD型單人雙面超凈工作臺蘇州凈化設備有限公司
HVE-50高壓滅菌鍋日本
電熱恒溫鼓風干燥箱上海躍進醫療器械廠
電熱恒溫水溫箱北京永光明醫療儀器廠
[0052]1.3主要試劑
[0053]鳥苷標準品中科院上海生化所東風生化技術公司
[0054]1.4培養基
[0055](I)斜面和平板培養基(質量百分數)
[0056]葡萄糖0.5，酵母膏1，蛋白胨1，L-谷氨酸鈉0.5，NaCl 0.5，瓊脂2.0，余量為去離子水，pH 7.0 ;滅菌條件:121°C，20min。
[0057](2)種子培養基(質量百分數)
[0058]葡萄糖2，酵母膏I，蛋白胨I，玉米漿I，L-谷氨酸鈉0.25，NaCl 0.25，尿素0.2，余量為去離子水，pH 7.0。滅菌條件:118°C,20min。
[0059](3)發酵培養基(質量百分數)
[0060]葡萄糖12，酵母粉 1.6，L-谷氨酸鈉 1，(NH4)2SO4 1.5，KH2PO4 0.2，MgSO4 0.4，CaCO3 2，豆餅水解液5ml/100ml，余量為去離子水，pH 7.0。滅菌條件:除CaCO3外，其余的為115°C，15min。CaCO3的滅菌條件為121°C，20min，接種前加入。
[0061]實施例1
[0062]鳥苷發酵過程紅外指紋圖譜的構建方法，包括如下步驟:
[0063]步驟(I)，發酵液樣品采集和制備:
[0064]I)菌種活化
[0065]取平板上的單菌落劃線接種于活化斜面，36°C恒溫靜置培養12h ；
[0066]2)種子培養
[0067]接兩環生長良好的活化斜面菌種放入裝有15mL種子培養基的250mL搖瓶中，8層紗布封口，置于往復式搖床上，沖程76mm，速度為108r/min，36°C振蕩培養12h，得到種子液；
[0068]3)鳥苷發酵
[0069]將上述種子液以10%的接種量接入裝有20ml發酵培養基的500ml三角瓶中，置于往復式搖床上，沖程76mm，速度為108r/min，36°C，培養72h，獲得發酵液；
[0070]4)采集
[0071]將10批次往復式搖床發酵的鳥苷發酵每隔9h從三個平行樣品中分別采集Iml的3份發酵液樣品，其中0-27h所采樣品為發酵前期樣品、27-45h的樣品為發酵中期樣品，45-72h的樣品為發酵后期樣品；
[0072]步驟(2)，發酵液鳥苷含量的測定:
[0073]發酵液中鳥苷含量采用目前工廠常用的高效液相色譜法定量測定；
[0074]步驟(3)，光譜采集:
[0075]利用德國BRUKER Tensor 27紅外光譜儀采集光譜，以空氣為參比，對步驟(I)得到的發酵前、中、后期樣品的發酵液及其上層清液分別重復掃描次數5次，取平均光譜；其中，紅外光譜的波長范圍為4000-600(^1'
[0076]步驟(4)，鳥苷發酵液紅外吸收特征峰位置的確定:
[0077]利用純水、鳥苷標準品及發酵上層清液為對照，確定發酵液紅外特征峰的位置；
[0078]步驟(5)，鳥苷發酵前、中、后期指紋圖譜的構建:
[0079]以鳥苷發酵液特征峰為主要研究對象，根據步驟(2)測定的發酵液中的鳥苷含量，研究鳥苷發酵前、中、后期紅外吸收圖譜特征，構建指紋圖譜；
[0080]步驟(6)，指紋圖譜的驗證:
[0081]10批次搖床及5批次發酵罐驗證指紋圖譜可靠性。其中，發酵罐發酵的發酵罐為10L，發酵條件為溫度36°C，轉速600轉/分，pH6.5，填料系數0.7，溶氧30-40%。
[0082]實施例2
[0083]鳥苷發酵過程紅外指紋圖譜的構建方法，包括如下步驟:
[0084]步驟⑴，發酵液樣品采集和制備:
[0085]I)菌種活化
[0086]取平板上的單菌落劃線接種于活化斜面，38°C恒溫靜置培養14h ；
[0087]2)種子培養
[0088]接兩環生長良好的活化斜面菌種放入裝有15mL種子培養基的250mL搖瓶中，8層紗布封口，置于往復式搖床上，往復式搖床的沖程76mm，速度為108r/min，37°C振蕩培養18h，得到種子液；
[0089]3)鳥苷發酵
[0090]將上述種子液以10%的接種量接入裝有20ml發酵培養基的500ml三角瓶中，置于發酵罐中，37°C，培養72h，獲得發酵液；
[0091]4)采集
[0092]將10批次發酵罐發酵的鳥苷發酵每隔9h從三個平行樣品中分別采集Iml的3份發酵液樣品，其中0-27h所采樣品為發酵前期樣品、27-45h的樣品為發酵中期樣品，45-72h的樣品為發酵后期樣品；
[0093]步驟(2)，發酵液鳥苷含量的測定:
[0094]發酵液中鳥苷含量采用目前工廠常用的高效液相色譜法定量測定；
[0095]步驟(3)，光譜采集:
[0096]利用德國BRUKER Tensor 27紅外光譜儀采集光譜，以空氣為參比，對步驟(I)得到的發酵前、中、后期樣品的發酵液及其上層清液分別重復掃描次數5次，取平均光譜；其中，紅外光譜的波長范圍為4000-600(^1'
[0097]步驟(4)，鳥苷發酵液紅外吸收特征峰位置的確定:
[0098]利用純水、鳥苷標準品及發酵上層清液為對照，確定發酵液紅外特征峰的位置；
[0099]步驟(5)，鳥苷發酵前、中、后期指紋圖譜的構建:
[0100]以鳥苷發酵液特征峰為主要研究對象，根據步驟(2)測定的發酵液中的鳥苷含量，研究鳥苷發酵前、中、后期紅外吸收圖譜特征，構建指紋圖譜；
[0101]步驟(6)，指紋圖譜的驗證:
[0102]10批次搖床及5批次發酵罐驗證指紋圖譜可靠性。
[0103]其中，發酵罐發酵的發酵罐為10L，發酵條件為溫度36°C，轉速600轉/分，pH6.5，填料系數0.7，溶氧30-40
[0104]實施例3
[0105]鳥苷發酵過程紅外指紋圖譜的構建方法，包括如下步驟:
[0106]步驟(I)，發酵液樣品采集和制備:
[0107]I)菌種活化
[0108]取平板上的單菌落劃線接種于活化斜面，37°C恒溫靜置培養13h ；
[0109]2)種子培養
[0110]接兩環生長良好的活化斜面菌種放入裝有15mL種子培養基的250mL搖瓶中，8層紗布封口，置于往復式搖床上，往復式搖床的沖程76mm，速度為108r/min，36.5°C振蕩培養16h，得到種子液；
[0111]3)鳥苷發酵
[0112]將上述種子液以10%的接種量接入裝有20ml發酵培養基的500ml三角瓶中，置于往復式搖床上或發酵罐中，36.7°C，培養72h，獲得發酵液；
[0113]4)采集
[0114]將10批次的鳥苷發酵每隔9h從三個平行樣品中分別采集Iml的3份發酵液樣品，其中0-27h所采樣品為發酵前期樣品、27-45h的樣品為發酵中期樣品，45-72h的樣品為發酵后期樣品；10批次的鳥苷發酵為往復式搖床和發酵罐發酵各5批；所述的發酵罐發酵的發酵罐為10L，發酵條件為溫度36 °C，轉速600轉/分，pH6.5，填料系數0.7，溶氧30-40%;鳥苷發酵時，往復式搖床的沖程76mm,速度為108r/min ；
[0115]步驟(2)，發酵液鳥苷含量的測定:
[0116]發酵液中鳥苷含量采用目前工廠常用的高效液相色譜法定量測定；
[0117]步驟(3)，光譜采集:
[0118]利用德國BRUKER Tensor 27紅外光譜儀采集光譜，以空氣為參比，對步驟⑴得到的發酵前、中、后期樣品的發酵液及其上層清液分別重復掃描次數5次，取平均光譜；其中，紅外光譜的波長范圍為4000-6000^1 ；
[0119]步驟(4)，鳥苷發酵液紅外吸收特征峰位置的確定:
[0120]利用純水、鳥苷標準品及發酵上層清液為對照，確定發酵液紅外特征峰的位置；
[0121]純水、發酵64h發酵液、發酵64h發酵液的上清液紅外吸收光譜見圖1，鳥苷標準品的紅外吸收光譜見圖2。
[0122]鳥苷的結構式為，如下所示。
[0123]
O
JL
HM
I ]L ?>
Z ^ KS-N
H3-N H
mcBz
門
HO OH
[0124]鳥苷中有0-H、C = O、C = N、C_N、N_H、C = C、C-0等基團，這些基團的吸收峰的位置不同。圖1中第一個峰在3300-3200(^'純水、發酵液、發酵上清液在此位置均有強吸收峰，且峰形較寬，符合締合O-H基團的吸收峰；第二個峰在2300CHT1左右，圖2中鳥苷標準品無此峰，比較發酵液和發酵上清液可以得出，此峰是發酵液中可以離心除去的成分的吸收所致，并不是鳥苷發酵液的特征吸收峰；第三個峰在ieOOcnf1左右，比較發現純水、發酵液、發酵上清液在此位置均有峰，應屬于O-H的吸收峰。第四個峰在HOOcnf1左右，只有發酵液在此位置有吸收峰，發酵上清液在此位置沒有吸收峰，判斷也是發酵液中可以離心除去的成分的吸收所致。第五個峰在llOO-lOOOcnf1，符合C-O(醇、醚等)的吸收范圍(UOO-lOOOcnf1)，發酵液、發酵上清液和鳥苷標準品在此均有吸收，C-N的吸收峰在1310-1020(^1'也在此峰附近，在鳥苷中存在較多的C-O和C-N，判斷此位置就是要研究的重點位置。
[0125]從圖1可以看出要研究的吸收位置峰形并不尖銳，而是比較平緩，可能是由于發酵液成分非常復雜，各種組分干擾所致，所以只能大概從峰形的變化上來研究。
[0126]步驟(5)，鳥苷發酵前、中、后期指紋圖譜的構建:
[0127]以鳥苷發酵液特征峰為主要研究對象，根據步驟(2)測定的發酵液中的鳥苷含量，研究鳥苷發酵前、中、后期紅外吸收圖譜特征，構建指紋圖譜；
[0128]將發酵不同時期的發酵液進行紅外光譜掃描，得到發酵不同時期發酵液的紅外吸收光譜，由于要研究的波數區段在llOO-lOOcnT1。
[0129]圖3為未接種培養基(發酵0h)，發酵9、18、27h發酵液的紅外吸收光譜比較圖。從圖中可以看出，未接種培養基的吸收光譜非常雜亂，峰很多，吸收強度很大，發酵9h的發酵液吸收光譜與之相比，除了吸收強度有所減小外，峰形及位置幾乎無變化。隨著發酵的繼續進行，發酵液的吸收峰逐漸趨向于單一化，吸收強度逐漸變小。
[0130]圖4為發酵27、36、45h發酵液的紅外吸收光譜比較圖。從圖中可以發現，峰形及位置變化很小，主要是吸收強度的變化。
[0131]圖5為發酵45、54、63、72h發酵液的紅外吸收光譜。觀察圖發現，峰形及位置變化很小，吸收峰的強度增大得也很小。
[0132]鳥苷發酵前期主要是培養基中成分的變化，沒有新物質生成或生成量很少。發酵9h的發酵液與培養基相比，只有吸收強度的減少，此時沒有鳥苷生成，吸收光譜中呈現的是培養基中某些成分的變化，吸收峰很雜亂。吸收強度減小的原因是培養基中有紅外吸收的成分的利用。18-27h培養基繼續被利用，鳥苷產生并開始累積，紅外圖譜中吸收峰變得單一，鳥苷的吸收成為主要因素。27h以后鳥苷積累的越來越多，吸收強度越來越大，到45h后進入發酵的后期，鳥苷產率下降，產量變化不大，吸收峰的強度增大得不明顯。所以枯草芽孢桿菌發酵產鳥苷過程中鳥苷產量的變化情況是與發酵液紅外吸收光譜掃描的結果是相符的。
[0133]發酵液紅外吸收光譜掃描的結果與鳥苷產量變化是相符的。可以初步認為用紅外吸收光譜技術檢測鳥苷的產量是可行的。本研究為利用紅外吸收光譜技術檢測發酵過程提供了新思路，為檢測鳥苷發酵過程提供一種方便快捷的新手段。
[0134]步驟(6)，指紋圖譜的驗證:
[0135]10批次搖床及5批次1L發酵罐驗證指紋圖譜可靠性，見表1。
[0136]表1鳥苷發酵液變化規律與指紋圖譜一致程度
[0137]
【權利要求】
1.鳥苷發酵過程紅外指紋圖譜的構建方法，其特征在于包括如下步驟: 步驟(I)，發酵液樣品采集和制備: 1)菌種活化 取平板上的單菌落劃線接種于活化斜面，36-38°C恒溫靜置培養12-14h ； 2)種子培養 接兩環生長良好的活化斜面菌種放入裝有種子培養基的搖瓶中，紗布封口，置于往復式搖床上，36-37°C振蕩培養12-18h，得到種子液； 3)鳥苷發酵 將上述種子液以10 %的接種量接入裝有發酵培養基的三角瓶中，置于往復式搖床上或發酵罐中，36-37 °C，培養72h，獲得發酵液； 4)米集 將10批次的鳥苷發酵每隔9h從三個平行樣品中分別采集3份發酵液樣品，其中0-27h所采樣品為發酵前期樣品、27-45h的樣品為發酵中期樣品，45-72h的樣品為發酵后期樣品; 步驟(2)，發酵液鳥苷含量的測定: 發酵液中鳥苷含量采用常用的高效液相色譜法定量測定； 步驟(3)，光譜采集: 利用紅外光譜儀采集光譜，以空氣為參比，對步驟(I)得到的發酵前、中、后期樣品的發酵液分別重復掃描次數5次，取平均光譜； 步驟(4)，鳥苷發酵液紅外吸收特征峰位置的確定: 利用純水、鳥苷標準品及發酵上層清液為對照，確定發酵液紅外特征峰的位置； 步驟(5)，鳥苷發酵前、中、后期指紋圖譜的構建: 以鳥苷發酵液特征峰為主要研究對象，根據步驟(2)測定的發酵液中的鳥苷含量，研究鳥苷發酵前、中、后期紅外吸收圖譜特征，構建指紋圖譜； 步驟￠)，指紋圖譜的驗證: 10批次搖床及5批次發酵罐驗證指紋圖譜可靠性。
2.根據權利要求1所述的鳥苷發酵過程紅外指紋圖譜的構建方法，其特征在于步驟(I)中所述的種子培養時，接兩環生長良好的活化斜面菌種放入裝有15mL種子培養基的250mL搖瓶中。
3.根據權利要求1所述的鳥苷發酵過程紅外指紋圖譜的構建方法，其特征在于步驟(I)中種子培養時，紗布封口的紗布層數為8層。
4.根據權利要求1所述的鳥苷發酵過程紅外指紋圖譜的構建方法，其特征在于步驟(I)中種子培養和鳥苷發酵時，往復式搖床的沖程76mm,速度為108r/min。
5.根據權利要求1所述的鳥苷發酵過程紅外指紋圖譜的構建方法，其特征在于步驟(I)中鳥苷發酵時，將上述種子液以10%的接種量接入裝有20ml發酵培養基的500ml三角瓶中。
6.根據權利要求1所述的鳥苷發酵過程紅外指紋圖譜的構建方法，其特征在于步驟(I)中10批次為往復式搖床和發酵罐發酵各5批。
7.根據權利要求1所述的鳥苷發酵過程紅外指紋圖譜的構建方法，其特征在于所述的發酵罐發酵的發酵罐為10L，發酵條件為溫度36°C，轉速600轉/分，pH6.5，填料系數0.7，溶氧 30-40%。
8.根據權利要求1所述的鳥苷發酵過程紅外指紋圖譜的構建方法，其特征在于所述的紅外光譜儀為德國BRUKER Tensor 27紅外光譜儀。
9.根據權利要求1所述的鳥苷發酵過程紅外指紋圖譜的構建方法，其特征在于所述的紅外光譜的波長范圍為4000-600(^1'
10.根據權利要求1所述的鳥苷發酵過程紅外指紋圖譜的構建方法，其特征在于所述的鳥苷發酵每隔9h從三個平行樣品中分別采集Iml的3份發酵液樣品。
【文檔編號】G01N21/3577GK104198431SQ201410456115
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年9月1日 優先權日:2014年9月1日
【發明者】楊天佑, 張明霞, 田靜, 常景玲 申請人:河南科技學院