一種銀納米簇傳感器及其制備方法和應用
【專利摘要】本發明提供了一種銀納米簇傳感器及其制備方法和應用，該傳感器為DNA熒光傳感器，所述DNA為分子信標型多功能DNA序列，在其3'端修飾有猝滅劑。其制備方法包括設計多功能DNA序列、形成分子信標型DNA序列和制備銀納米簇傳感器三個步驟。該傳感器可用于DNA生物傳感如檢測基因序列，還可應用于適配體傳感如檢測小分子物質和大分子物質。本發明的銀納米簇傳感器僅僅在識別待測物后，原本熄滅的信號才被激活，從而進行可激活熒光檢測，以免去洗滌步驟并提高檢測的靈敏度。
【專利說明】
一種銀納米簇傳感器及其制備方法和應用
技術領域
[0001]本發明屬于化學領域，具體涉及一種以DNA為模板的銀納米簇傳感器及其制備方法和應用。
[0002]
【背景技術】
[0003]DNA生物傳感器是目前生物傳感器中報道最多的一種，其中，由于熒光分析法的諸多優點而使熒光生物傳感器的應用又最為廣泛。熒光生物傳感器是將探針DNA進行熒光標記或與熒光物質結合，當探針與目標物質作用時熒光信號發生變化，將識別信息轉換為可檢測的熒光信號，從而實現對目標物質的分析。近年來，熒光生物傳感器的研宄內容主要集中對特定基因序列、蛋白質、藥物、小分子、無機離子等目標分析物的存在和含量進行定性、定量分析。
[0004]用于熒光傳感器經常被用于物質的檢測，大多基于猝滅機制而構建，存在假陽性信號干擾，影響了檢測的準確性。為了解決該問題，科研工作者發展增強型傳感器，是在原有較弱熒光信號的基礎上產生更強的熒光信號，在一定程度上彌補了熒光減弱型傳感器的假陽性缺陷。以上兩類傳感器均屬于常亮型傳感器，但由于傳感器本身具有熒光信號，檢測過程中往往需要多步洗滌以除去未結合探針，增加了實驗的操作步驟，并降低檢測的靈敏度。
[0005]
【發明內容】
[0006]解決的技術問題:本發明的目的是克服現有常亮型熒光傳感器存在的繁瑣操作、靈敏不高的缺陷，提出一種激活型銀納米簇傳感器，該傳感器僅僅在識別待測物后，原本熄滅的信號才被激活，從而進行可激活熒光檢測，以免去洗滌步驟并提高檢測的靈敏度。
[0007]技術方案:
一種銀納米簇傳感器，該傳感器為DNA熒光傳感器，所述DNA為分子信標型多功能DNA序列，在其3’端修飾有猝滅劑。
[0008]所述銀納米簇傳感器的粒徑為I?2nm。
[0009]所述的銀納米簇傳感器的制備方法，包括以下步驟:
步驟I，設計多功能DNA序列，該多功能DNA序列從5 ’端到3 ’端依次為銀納米簇的模板序列、識別序列及其部分互補序列，在3 ’末端修飾有猝滅劑；
步驟2，形成分子信標型DNA序列，將步驟I的多功能DNA序列進行熱變性并退火，即得；步驟3，制備銀納米簇傳感器，以步驟2所得分子信標型DNA序列作為穩定劑，依次加入硝酸銀和硼氫化鈉發生還原反應，得到銀納米簇傳感器。
[0010]進一步地，步驟3中多功能DNA序列、硝酸銀、硼氫化鈉的摩爾比為1: 6: 6。
[0011 ]所述的銀納米簇傳感器在DNA生物傳感中的應用。
[0012]所述的銀納米簇傳感器在適配體傳感中的應用。
[0013]有益效果:
1.本發明的激活型銀納米簇傳感器僅僅在識別待測物后，原本熄滅的信號才被激活，從而進行激活型熒光檢測，以免去洗滌步驟并提高檢測的靈敏度；
2.本發明的激活型銀納米簇傳感器能夠特異性檢測多種靶標如基因序列、小分子物質和大分子物質；
3.本發明的激活型銀納米簇傳感器能夠推廣并應用于細胞成像及活體成像領域。
[0014]
【附圖說明】
[0015]圖1為實施例1的銀納米簇傳感器的合成路線及檢測多種靶標示意圖；
圖2為實施例1中未修飾猝滅劑的分子信標型DNA序列銀納米簇傳感器的熒光光譜圖； 圖3為實施例1的銀納米簇傳感器的透射電鏡表征圖片；
圖4為實施例2中在銀納米簇傳感器中加入不同濃度p53基因后傳感器的發射光譜圖。
[0016]
【具體實施方式】
[0017]以下實施例進一步說明本發明的內容，但不應理解為對本發明的限制。在不背離本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改和替換，均屬于本發明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。
[0018]
實施例1
所用溶液的準備:
稱取0.1052g檸檬酸氫二鈉和0.47056g檸檬酸三鈉，用超純水定容至10mL，調節溶液pH為7，即得20 mM檸檬酸緩沖溶液。將0.1698g AgNO3溶解于10mL超純水中配置成濃度為1mM的AgNO3工作溶液;稱取0.0378g NaBH4溶解于10mL水中配制成濃度為1mM的NaBH4工作溶液;將DNA鏈溶解于檸檬酸緩沖溶液(20 mM, pH7)中，配制成ΙΟΟμΜ儲備液。
[0019]銀納米簇傳感器的制備:
步驟I，多功能DNA序列設計
多功能DNA序列包含三部分，如圖1所示，從5 ’端到3 ’端依次為銀納米簇的模板序列(功能片段Ι)、ρ53基因的互補序列(識別序列，功能片段II)、與識別序列5’端序列部分互補的6堿基序列(功能片段III)，3 ’末端修飾有猝滅劑BHQl分子。具體序列如SEQ ID N0.1所示。
[0020]步驟2，制備分子信標型DNA序列
在1.5mL規格離心管中加入500仙檸檬酸緩沖溶液(20mM，pH7)，取90 yL多功能DNA序列(ΙΟΟμΜ)，混合均勻，放入95° C水浴鍋使之變性10分鐘，快速放入冰水浴中使之保持I小時，由于識別序列與部分互補序列發生特異性雜交，在上述條件下形成分子信標型DNA序列，5 ’端為銀納米簇模板序列，3 ’端為猝滅劑BHQl分子。
[0021 ]步驟3，制備銀納米簇傳感器
以形成的發夾型DNA序列作為穩定劑，放入冰水浴中保持10分鐘，加入5.4tiL硝酸銀工作溶液震蕩2分鐘使之混合均勻，避光放入冰水浴中繼續冰浴15分鐘；加入5.4tiL新鮮制備的硼氫化鈉工作溶液，快速混勻使之反應5分鐘，避光放入4° C冰箱保存使之過夜，得到激活型分子信標型銀納米簇。實驗中反應物摩爾比DNA模板:硝酸銀:硼氫化鈉=1: 6: 6。為了確定產物的激發波長和發射波長，以未修飾猝滅劑BHQl的分子信標型多功能DNA序列作為穩定劑，按照同樣的過程制備出常亮型分子信標型銀納米簇。如圖2所示，制備的分子信標型銀納米簇在445nm激發下，于520nm波長處有一熒光峰。制備的分子信標型銀納米簇的透射電鏡表征如圖3，該銀納米簇的粒徑為2 nm，形狀規則均一。
[0022]
實施例2銀納米簇傳感器基于熒光增強檢測p53基因
(I)取101IL實施例1制備得到的銀納米簇傳感器溶液到離心管中，加入不同濃度的P53基因序列(如SEQ ID N0.2所示)，混合均勻至少5分鐘，設定激發波長為445 nm，監測其在520 nm波長處的熒光強度，記為F。同時設置對照組，即以3’端未修飾猝滅劑分子的多功能DNA鏈為模板，按照同樣的制備方法進行合成，并用445 nm波長光激發，測定520 nm波長處的焚光強度，記為Fo。
[0023](2)加入靶標基因后，p53基因與傳感器的分子信標環狀區的識別序列發生特異性結合，形成雙鏈DNA，打開發夾結構，使銀納米簇遠離熒光猝滅分子，激活傳感器熒光信號并逐漸增強(圖1)，根據加入不同濃度P53基因標準品溶液后熒光強度的變化值(F-F0)(圖4)，計算出加入p53基因前后基于分子信標銀納米簇探針的熒光強度變化值與p53基因濃度的線性關系，并繪制標準曲線，檢測限低至2 nM，線性范圍為10?1000 nM。而常亮型銀納米簇傳感器的檢測限> I OnM。
[0024](3)將待測樣品加入基于分子信標型銀納米簇傳感器溶液前后，在445 nm波長光的激發下，測試其在520 nm波長處的熒光強度的變化值，根據步驟2得到的線性關系，計算出待測樣品中P53基因的濃度。
[0025]
實施例3銀納米簇傳感器用于適配體傳感
將識別序列設為小分子物質ATP或生物大分子物質Thrombin的適配體，所用多功能DNA序列如SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4所示，制備出ATP靶向或者Thrombin靶向激活型分子信標型銀納米簇，按照類似的過程用于熒光增強檢測ATP和Thrombin，檢測限分別為0.2 μΜ和0.2 ηΜ，線性范圍依次為I?15μΜ和I?1500ηΜ。常亮型銀納米簇傳感器對二者的檢測限分別為>10μΜ和>20ηΜ。
【主權項】
1.一種銀納米簇傳感器，該傳感器為DNA熒光傳感器，其特征在于:所述DNA為分子信標型多功能DNA序列，在其3 ’端修飾有猝滅劑。2.根據權利要求1所述的銀納米簇傳感器，其特征在于:該銀納米簇傳感器的粒徑為I?2nm03.權利要求1所述的銀納米簇傳感器的制備方法，其特征在于:包括以下步驟: 步驟I，設計多功能DNA序列，該多功能DNA序列從5 ’端到3 ’端依次為銀納米簇的模板序列、識別序列及其部分互補序列，在3 ’末端修飾有猝滅劑； 步驟2，形成分子信標型DNA序列，將步驟I的多功能DNA序列進行熱變性并退火，即得；步驟3，制備銀納米簇傳感器，以步驟2所得分子信標型DNA序列作為穩定劑，依次加入硝酸銀和硼氫化鈉發生還原反應，得到銀納米簇傳感器。4.根據權利要求3所述的銀納米簇傳感器的制備方法，其特征在于:步驟3中多功能DNA序列、硝酸銀、硼氫化鈉的摩爾比為1: 6: 6。5.權利要求1所述的銀納米簇傳感器在DNA生物傳感中的應用。6.權利要求1所述的銀納米簇傳感器在適配體傳感中的應用。
【文檔編號】G01N21/64GK105928917SQ201610248846
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年4月20日
【發明人】劉國良, 馮大千, 孔蕾, 刁維維
【申請人】鹽城工學院