一種抑制南美大豆猝死綜合癥病菌生長的化合物的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及化合物的新用途，闡明藥物化學結構與細菌的生物活性之間的關系， 更具體的說，是探索化合物對南美大豆猝死綜合癥病菌的抑菌和殺菌活性。
【背景技術】
[0002] 大豆起源于中國，屬豆科，蝶形花亞科，大豆屬，迄今在我國已有五千多年的種植 歷史。它既是重要的油料作物，也是植物蛋白質的主要來源，可作糧食和副食，又是主要的 牲畜飼料和工業原料。中國大豆品種資源豐富，類型多，適應性強，而且品質好，在我國國民 經濟中占有十分重要地位。
[0003] 世界上為害大豆的病蟲害有上百種，目前，己列入我國檢疫性有害生物的、可為害 大豆的有害生物有大豆疫病菌、菜豆細菌性萎蔫病菌、番茄環斑病毒、煙草環斑病毒等。近 年來國外大豆病蟲害的發生情況有了一些變化，一些新的重要有害生物引起了各國學者的 廣泛關注，其中較為突出的就有大豆猝死綜合癥，也稱大豆突死綜合癥。
[0004] 大豆猝死綜合癥，英文簡稱SDS，是近二十年來在美國等國大豆上發生的一種由鐮 刀菌引起的較新的真菌病害。該病于1971年由H.J.Walters在美國阿肯色州首次發現， 到1982年此病害導致該州大豆產量嚴重下降后，引起了人們的重視，根據其發病迅速的特 點，定名為大豆猝死綜合癥。
[0005] 大豆猝死綜合癥危害性很大，在適宜的條件下可引致100%的損失。2004年美國最 大的兩個大豆種植州伊利諾伊州和依阿華州，因生長季節長期的低溫多雨天氣，導致了十 年來最嚴重的SDS疫情，直接經濟損失高達數億美元，經濟影響很大。
[0006] 我國是大豆生產大國，產量居美國、巴西和阿根廷之后，列世界第4位。但我國的 大豆生產還遠遠滿足不了國內市場的需要，每年都要從國外進口大量的大豆。據海關統計， 從2000年至2002年，我國從美國、巴西和阿根廷進口大豆的總量為3551萬噸，這些主要的 出口國都是大豆猝死綜合癥的疫區。
[0007] 大豆猝死綜合癥主要分布在美國、巴西、阿根廷這三個大豆主產國，加拿大曾在 1998年報道了加拿大大豆上首次發生SDS。自1971年SDS首次在美國阿肯色州發現后，迅 速擴展到密西西比、密蘇里、肯塔基、田納西、伊利諾斯、依阿華、印第安納等州，到1986年， SDS已在美國的13個州發生。
[0008] 阿根廷于1991年和1992年首次報道了在彭巴司草原的大豆上發生大豆猝死綜合 癥。1992年和1993年該國的西北部的大豆產區也發現了SDS。SDS在巴西首次報道于1992 年，但早在1981年巴西的大豆田間就有SDS的癥狀出現。現SDS已遍布巴西200多萬公頃 大豆的產區，巴西中南部的99個縣都有此病害。
[0009] 大豆猝死綜合癥可表現在幼苗期、花期和英果充實期，葉部和根部都有癥狀，環境 條件適合時，癥狀一旦出現，整個植株就停止發育，迅速死亡。SDS的幼苗期癥狀通常表現 為植株矮小，葉片上有圓形褪綠色斑點，斑點沿葉脈擴大，葉邊緣干枯，變褐，有時卷曲。根 部褐色，側根稀少。SDS成株期的葉部癥狀為，葉面上首先出現圓形至不規則型的幾個毫米 或更大的褪綠色斑點，斑點擴大壞死或愈合成葉脈間枯黃的伸長區，最終部分或全部的枯 黃組織壞死，僅在靠近主脈處保留一點綠色組織，葉片的邊緣通常會伴隨有卷曲的現象，有 時成杯狀。發病重時葉片脫落，僅留有葉柄懸掛在莖上。在花期和英形成期間，除葉部癥狀 外，花和果莢往往敗育和發育不全，發病輕的植株雖能結英，但豆粒小，沒有生活力。高溫干 燥天氣下，癥狀可以減輕。
[0010] 根部癥狀與葉面癥狀密切相關。葉面不表現癥狀或癥狀輕微的植株，根部無癥狀； 葉片發病嚴重時，則根部腐爛，因為側根腐爛，整個植株容易從土壤中連根拔起。縱向剖開 根莖部，維管束從灰到紅色的褐變可從主根擴展到地面以上幾個節的莖部，但髓部仍保持 白色。發病嚴重的植株主根和下部莖桿上可形成肉眼可見的藍色菌落，即是SDS病原菌產 生的大分生孢子，這可作為田間鑒定SDS的一個特征。在田間，植株高度與發病的嚴重程度 無明顯的相關性，但在溫室人工接種試驗中，會導致植株矮小。大田發病，最初以圓形或橢 圓形點狀區域發生，氣候條件適宜時，則迅速蔓延成片，遠望去呈火燒狀。
[0011] 在土壤和根部殘肩中越冬的厚垣孢子是病害的初侵染源。厚垣孢子萌發后能定殖 和侵染植株的根，初侵染時，定殖僅局限于根部和下部莖桿皮層組織，菌絲在細胞內和細胞 間隙生長，主要是在細胞內。到植株的生長后期，皮層可看到菌絲，在此階段，厚垣孢子在降 解了的開始脫皮的皮層組織里形成。在靠近土壤的根部，可以看見藍色或藍綠色的大分生 孢子堆，在根部形成的分生孢子通常與根腐有關。
[0012] 田間和溫室接種試驗證明，SDS的葉面癥狀可能是由一種或多種植物毒素引起的。 研究發現，染病植株上有癥狀表現的葉片提取液中含有一種毒素多肽，將這種多肽接種到 健康植株，可以導致子葉和葉片變黃、卷曲直至干枯。而染病植株上未表現葉面癥狀的葉片 提取液中沒有發現這種毒素多肽。田間和溫室觀察發現，葉面顯癥和病原物在根部侵入和 定殖是同時的，說明葉面顯癥和根部發病的致病機制不同，葉面癥狀可能是根部病原菌激 發的毒素引起的。
【發明內容】
[0013] 本發明采用體外抗菌試驗，研究化合物對南美大豆猝死綜合癥病菌的生物活性。
[0014] 本發明的具體技術方案如下： 本發明的創新點是發現化合物對南美大豆猝死綜合癥病菌有良好的抑菌和殺菌活性， 并測量得到其最小抑菌濃度MIC值和最小殺菌濃度MBC值，屬于首次公開。
[0015] 所述化合物結構特征如下式所示：
【具體實施方式】
[0016] 下面結合具體實施實例，進一步詳細地說明本發明。應理解下面實施例僅用于說 明本發明而不用于限制本發明范圍。
[0017] 實施實例1 測量最小抑菌濃度MIC值。
[0018] (1)營養肉湯的配制：取營養肉湯30g加1000 mL蒸餾水即得。使用前121°C高壓 蒸汽滅菌20min待用。
[0019] (2)營養瓊脂固體培養基的配制：取營養瓊脂45g加1000 mL蒸餾水即得。使用前 121°C高壓蒸汽滅菌20min待用。
[0020] (3)菌株的培養：操作于超凈工作臺上進行。吸取已滅菌的液體培養基10mL，放在 已滅菌的試管中，然后用接菌環挑取一個菌落，加到液體培養基中，放于培養箱內培養，細 菌培養24h，培養溫度為28°C。
[0021] (4)菌液配制及計數：將培養后的菌液，釆用10倍稀釋法用液體培養基稀釋，并 用血球計數板在顯微鏡上初步觀察計數，然后將菌液用液體培養基稀釋，作為加入供試品 中的菌液。細菌采用平板計數法進行計數，將以上菌液用無菌生理鹽水再稀釋100倍，取 50yL，均勻涂于已鋪有固體培養基的平皿中，培養24h，培養溫度為28°C。培養后，單個活 細菌生長形成一個菌落，統計菌落數目，即可計算出樣品中的含菌數。
[0022] 計算公式為：菌液濃度=nX20X100cfu/mL (5)藥品溶液的配制：稱取化合物，加入滅菌生理鹽水，搖勾，得均勻溶液，備用。存放 于4°C冰箱保存待用。
[0023] (6)最小抑菌濃度（MIC)與最小殺菌濃度（MBC)的測定：采用微量肉湯稀釋法測定 最小抑菌濃度MIC(MinimalInhibitoryConcentration)。MIC為最小抑菌濃度，即藥物 與一定濃度的菌液作用后，能夠抑制可見菌生長的最低濃度。
[0024] 采用二倍稀釋法將藥液用無菌生理鹽水將藥液稀釋系列濃度，0.5、1、2、4、8、16、 32、64、128和256 ^/1^，在96孔板上1~10行，每孔加100^不同濃度的藥液和100 1^ 菌液，使最終菌液濃度為1~5X105cfu/mL，第11行以無菌生理鹽水加菌液作為陽性對照，第 12行以不加菌液的無菌生理鹽水為陰性對照，混勻后于28°C培養24h，以肉眼觀察藥物最 低濃度管中無細菌生長者為該試驗藥物的MIC，每個實驗重復三次。
[0025] 測得最小抑菌濃度MIC值為32yg/mL。
[0026] 實施實例2 測量最小殺菌濃度MBC值。
[0027] (1)營養肉湯的配制：取營養肉湯30g加1000 mL蒸餾水即得。使用前121°C高壓 蒸汽滅菌20min待用。
[0028] (2)營養瓊脂固體培養基的配制：取營養瓊脂45g加1000 mL蒸餾水即得。使用前 121°C高壓蒸汽滅菌20min待用。
[0029] (3)菌株的培養：操作于超凈工作臺上進行。吸取已滅菌的液體培養基10mL，放在 已滅菌的試管中，然后用接菌環挑取一個菌落，加到液體培養基中，放于培養箱內培養，細 菌培養24h，培養溫度為28°C。
[0030] (4)菌液配制及計數：將培養后的菌液，釆用10倍稀釋法用液體培養基稀釋，并 用血球計數板在顯微鏡上初步觀察計數，然后將菌液用液體培養基稀釋，作為加入供試品 中的菌液。細菌采用平板計數法進行計數，將以上菌液用無菌生理鹽水再稀釋100倍，取 50yL，均勻涂于已鋪有固體培養基的平皿中，培養24h，培養溫度為28°C。培養后，單個活 細菌生長形成一個菌落，統計菌落數目，即可計算出樣品中的含菌數；計算公式為：菌液濃 度=nX20X100cfu/mL。
[0031] (5)藥品溶液的配制：稱取化合物，加入滅菌生理鹽水，搖勾，得均勻溶液，備用。存 放于4°C冰箱保存待用。
[0032] (6)最小抑菌濃度（MIC)與最小殺菌濃度（MBC)的測定：采用微量肉湯稀釋法測定 最小殺菌濃度MBC (Minimal Bactericidal Concentration)。在MIC基礎上，從每管吸取 10yL溶液，點于固體培養基上，繼續按MIC培養條件下培養，以完全殺滅細菌的最低濃度 為最小殺菌濃度(菌落數小于等于5)。
[0033] 采用二倍稀釋法將藥液用無菌生理鹽水將藥液稀釋系列濃度，0.5、1、2、4、8、16、 32、64、128和256 ^/1^，在96孔板上1~10行，每孔加100^不同濃度的藥液和100 1^ 菌液，使最終菌液濃度為l~5X105cfu/mL，第11行以無菌生理鹽水加菌液作為陽性對照， 第12行以不加菌液的無菌生理鹽水為陰性對照，混勻后于28°C培養24h，以肉眼觀察藥物 最低濃度管中無細菌生長者為該試驗藥物的MIC。將上述未見生長細菌的各孔中的肉湯取 10yL接種于營養瓊脂平板上，做好標記，于28°C培養24h，以仍無細菌生長的管內藥物濃 度記為該藥的MBC，每個實驗重復三次。
[0034] 測得最小殺菌濃度MBC值為128yg/mL。
【主權項】
1. 一種抑制南美大豆猝死綜合癥病菌生長的化合物，其特征在于： (1) 結構特征如下式所示：(2) 其可作為南美大豆猝死綜合癥病菌的抑制劑和殺菌劑； (3) 其對南美大豆猝死綜合癥病菌的最小抑菌濃度MIC值為32 μ g/mL ; (4) 其對南美大豆猝死綜合癥病菌的最小殺菌濃度MBC值為128 μ g/mL。
【專利摘要】本發明發現對南美大豆猝死綜合癥病菌具有抑菌和殺菌活性的化合物。其南美大豆猝死綜合癥病菌的最小抑菌濃度MIC值為32μg/mL，最小殺菌濃度MBC值為128μg/mL。
【IPC分類】A01N43/86, C07D413/04, A01P3/00
【公開號】CN105175404
【申請號】
【發明人】不公告發明人
【申請人】許自協
【公開日】2015年12月23日
【申請日】2015年11月2日