一種D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶dacA基因及應用
【技術領域】
[0001] 發明涉及基因工程領域，具體地，本發明涉及一種D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶dacA 及其基因和應用。
【背景技術】
[0002] 肽聚糖是由雙糖單位，四肽尾還有肽橋聚合而成得多層網狀大分子結構。肽聚糖 層的骨架由N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸通過β-l，4糖苷鍵連接而成，糖鏈間由肽鏈交 聯，構成穩定的網狀結構，這樣構成了整個細菌表面的細胞壁。作為細胞壁的主要成分，肽 聚糖的組成與細胞結構的完整性、外膜的通透性的維持、細菌的抗干燥能力和耐熱性等均 密切相關。dacA基因表達的D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶能夠從肽聚糖五肽上移除最后一個 末端D-Ala，導致轉肽反應中供體不可用，可以控制肽聚糖的網狀交聯水平，從而改變細胞 的通透性。
[0003] 大腸桿菌(Escherichia coli)表達系統是目前基因工程中最常用的蛋白表達系 統，有操作簡單、成本低廉等優點，可以快速大規模地生產目的蛋白。但是在E.coli的表達 過程中，大部分蛋白在信號肽的引導下分泌到周質空間，會導致中間體大量積聚，對蛋白質 的生產造成阻礙。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的是提供一種可以提高E.coli胞外分泌水平的D-丙氨酰-D-丙氨酸羧 肽酶、其氨基酸序列、編碼該D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶的基因、含有該基因的重組質粒、含 有該重組載體的重組菌株、該D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶的應用。
[0005] 具體包括：
[0006] 本發明提供了一種D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶dacA，其氨基酸序列如序列1所示。
[0007] 序列 1:
[0008] MNTIFSAR頂KRLALTTALCTAFISAAHADDLNIKTMIPGVPQIDAESYILIDYNSGKVLAEQNADVRRDPASLTKM MTSYVIGQAMKAGKFKETDLVTIGNDAWATGNPVFKGSSLMFLKPGMQVPVSQLIRGINLQSGNDACVAMADFAAGS QDAFVGLMNSYVNALGLKNTHFQTVHGLDADGQYSSARDMALIGQALIRDVPNEYSIYKEKEFTFNGIRQLNRNGLL WDNSLNVDGIKTGHTDKAGYNLVASATEGQMRLISAVMGGRTFKGREAESKKLLTWGFRFFETVNPLKVGKEFASEP VffFGDSDRASLGVDKDVYLTIPRGRMKDLKASYVLNSSELHAPLQKNQVVGTINFQLDGKTIEQRPLVVLQEIPEGN FFGKIIDYIKLMFHHWFG
[0009] 其中，該酶基因編碼403個氨基酸，其理論分子量為44.45kDa。
[0010] 本發明提供了編碼上述D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶的基因 dacA，具體的，該酶的基 因序列如序列2所示。
[0011] 序列2:
[0012] ATGAATACCATTTTTTCCGCTCGTATCATGAAGCGCCTGGCGCTCACCACGGCTCTTTGCACAGCCTTTATCTCTGC TGCACATGCCGATGACCTGAATATCAAAACTATGATCCCGGGTGTACCGCAGATCGATGCGGAGTCCTACATCCTGA TTGACTATAACTCCGGCAAAGTGCTCGCCGAACAGAACGCAGATGTCCGCCGCGATCCTGCCAGCCTGACCAAAATG ATGACCAGTTACGTTATCGGCCAGGCAATGAAAGCCGGTAAATTTAAAGAAACTGATTTAGTCACTATCGGCAACGA CGCATGGGCCACCGGTAACCCGGTGTTTAAAGGTTCTTCGCTGATGTTCCTCAAACCGGGCATGCAGGTTCCGGTTT CTCAGCTGATCCGCGGTATTAACCTGCAATCGGGTAACGATGCTTGTGTCGCCATGGCTGATTTTGCCGCTGGTAGC CAGGACGCTTTTGTTGGCTTGATGAACAGCTACGTTAACGCCCTGGGCCTGAAAAACACCCACTTCCAGACGGTACA TGGTCTGGATGCTGATGGTCAGTACAGCTCCGCGCGCGATATGGCGCTGATCGGCCAGGCGTTGATCCGTGACGTAC CGAATGAATACTCGATCTATAAAGAAAAAGAATTTACGTTTAACGGTATTCGCCAGCTGAACCGTAACGGCCTGTTA TGGGATAACAGCCTGAATGTCGACGGCATCAAAACCGGACACACTGACAAAGCAGGTTACAACCTTGTTGCTTCTGC GACTGAAGGCCAGATGCGCTTGATCTCTGCGGTGATGGGCGGACGTACTTTTAAAGGCCGTGAAGCCGAAAGTAAAA AACTGCTGACCTGGGGCTTCCGTTTCTTCGAAACCGTTAACCCACTGAAAGTAGGTAAAGAGTTCGCCTCTGAACCG GTTTGGTTTGGTGATTCTGATCGCGCTTCGTTAGGGGTTGATAAAGACGTGTACCTGACCATTCCGCGTGGCCGCAT GAAAGATCTGAAAGCCAGCTATGTGCTGAACAGCAGTGAATTGCATGCGCCGCTGCAAAAGAATCAGGTCGTCGGTA CTATCAACTTCCAGCTTGATGGCAAAACGATCGAACAACGCCCGTTGGTTGTACTGCAAGAAATCCCGGAAGGTAAC TTCTTCGGCAAAATCATTGATTACATTAAATTAATGTTCCATCACTGGTTTGGTTAA
[0013] 本發明通過PCR方法克隆了 D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶基因 dacA，DNA全序列分析 結果表明，D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶的編碼基因 dacA全長1212bp。
[0014] 將上述D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶基因 dacA序列及推導出的氨基酸序列在 GenBank中進行BLAST比對，該基因與來源于E · coli str · K_12substr .MG1655的D-丙氨酰-D_丙氨酸羧肽酶序列相似性最高(99% )。
[0015] 本發明還提供了包含上述D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶基因 dacA的重組質粒，為 pRSFDuet-dacA。將本發明的D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶基因插入至表達載體相應的限制酶 切位點，使其核苷酸序列與表達調控序列相連接，作為本發明的一個最優選實驗方案，優選 D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶基因插入到質粒pRSFDuet，使該核苷酸序列位于T71ac啟動子的 下游并受其調控，得到重組E. co 1 i表達質粒pRSFDue t-dacA。
[0016] 本發明還提供了上述D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶基因 dacA的應用菌株，優選所述 菌株為E.coli。
[0017] 本發明能夠增強E.c〇li胞內蛋白到達胞外，促進其分泌，降低其在胞內積累，提供 一種可提高E.coli蛋白胞外分泌水平的D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶、及其氨基酸序列、基因 序列。
【附圖說明】
[0018] 圖1為D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶重組質粒pRSFDuet-dacA圖譜。
[0019] 圖2為D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶的過量表達
[0020] 圖3為過量表達D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶對E. coli胞外分泌α-半乳糖苷酶的影 響。
【具體實施方式】
[0021] 實施例l:E.coli BL21(DE3)D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶基因 dacA的克隆 [0022]基于PCR獲得D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶dacA的DNA序列，將D-丙氨酰-D-丙氨酸羧 肽酶的基因片段與表達載體pRSFDuet連接，獲得重組質粒pRSFDuet-dacA(圖1)。然后轉化 至IjE.coli BL21(DE3)感受態細胞中，獲得重組菌株E.coli BL21(DE3)/dacA。
[0023]實施例2:D_丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶酶活
[0024]將已構建的重組菌，接種250mL搖瓶培養，經誘導劑（IPTG)誘導后，收集E. coli細 胞，采用超聲破碎法破壁細胞。高速離心后，收集破壁上清，取樣測定破壁上清中的羧肽酶 酶活力。通過測定酶活力計算出過量表達后，羧肽酶dacA-Δρ在胞內的比酶活力為5.83U/g (圖2)，對照組羧肽酶比酶活力僅為1.51U/g。
[0025] 實施例3:過量表達dacA對E.coli胞外分泌α-半乳糖苷酶的影響
[0026] 在E. col i中過量表達羧肽酶dacA時，誘導10h后，E. col i胞外分泌α-半乳糖苷酶的 水平顯著提高，胞外α-半乳糖苷酶酶活力達到10.64U/g(圖3)。但沒有過量表達任何羧肽酶 的對照菌株誘導發酵l〇h后，在E.coli胞外測得的α-半乳糖苷酶的酶活力僅為1.82U/g。
【主權項】
1. 一種D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶dacA，其特征在于：由序列1所示氨基酸序列組成的 蛋白質。2. -種D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶基因 dacA，其特征在于，編碼權利要求1所述的D-丙 氨酰-D-丙氨酸羧肽酶dacA。3. 根據權利要求2所述D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶基因 dacA，其特征在于:其DNA序列如 序列2所示。4. 包含權利要求2或3所述的D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶基因 dacA的重組質粒。5. 根據權利要求4所述的重組質粒，其特征在于，所述載體為pRSFDuet。
【專利摘要】本發明涉及基因工程領域，具體地，一種D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶dacA基因及應用。本發明提供了一種來源于大腸桿菌(Escherichia？coli)BL21(DE3)的D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶dacA，其氨基酸序列如序列1所示，且本發明提供了編碼上述dacA的編碼基因dacA。本發明的D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶能夠從肽聚糖五肽上移除最后一個末端D-丙氨酸(D-Ala)，導致轉肽反應中供體不可用，從而控制肽聚糖的網狀交聯水平，可以提高E.coli蛋白胞外分泌水平。
【IPC分類】C12N15/57, C12N15/70, C12N9/48
【公開號】CN105647892
【申請號】
【發明人】許菲, 楊海泉, 胡金遠, 強書敏, 沈微, 陳獻忠, 鄭虹寧, 寧璐璐
【申請人】江南大學
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2016年3月4日