專利名稱：一種耐銨工程菌和含有這種工程菌的生物肥料的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種耐銨工程菌和含有這種工程菌的生物肥料。
自1976年巴西Dobereiner實驗室報道從禾本科植物根際分離得固氮螺菌(Azospirillum spp)，并測定固氮螺菌對宿主的氮素供應達2KgN-ha-1 d-1(后來的研究表明由于測定方法的問題，此數值偏高)。激起世界范，圍的研究熱。各研究組相繼從禾本科作物根際分離多種固氮菌(統稱聯合固氮菌)包括腸桿菌科、固氮菌科、芽孢桿菌科、假單孢菌科、螺菌科的細菌.但研究最多的還是固氮螺菌，，大量的文獻報導固氮螺菌的生理，生化及遺傳特性并用固氮螺菌在田間做了大量的接種實驗。目前國際上固氮微生物制劑商業產品中最主要的是根瘤菌。以聯合固氮菌Azospirillum為主要商業產品只有法國的AzogreenTM，意大利、法國、比利時聯合生產的Zea-Net TM，美國的Azo-Green墨西哥的Biofertilizonepara Maiz.這些產品商業規模都不大。1993年在烏拉圭召開以固氮螺菌的農業應用為題的國際研討會總結了20年來用固氮螺菌的田間接種實驗，由此研討會總結的資料可反映出聯合固氮菌在田間接種的概況。20年的實驗表明在不同地區和氣侯條件下接種聯合固氮菌對農業上一些重要作物如玉米、水稻、小麥是有增產作用的，雖然很難精確估計接種實驗成功的百分數，用統計學上有意義的增產率5-30％計算，實驗的成功率在60-70％(有些失敗的試驗未報道)。但至今接種實驗所用的菌株都是野生型菌株，在中國用野生型聯合固氮菌研制的菌劑產品名目繁多，良莠參雜，據統計生產生物菌肥的廠家不下300家。應用菌株主要是腸桿菌科的聯合固氮菌Klebsila pneumoniae，芽胞桿菌及根瘤菌。生產量最多并形成產品的有保定微生物所生產的小麥根際聯合固氮菌劑，玉米根際聯合固氮菌劑，推廣面積達幾百萬畝，但由于增產效果不穩定已停產。
國外實驗室用遺傳操作構建不同類型耐銨沁銨工程菌的研究仍仃留在溫室盆栽階段(Colnaghi et al 1997)，(Fujii et al 1987)，(Christiansen et al1991)。1996年用外源dctABD基因及修飾的nifA基因重組的苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)的接種實驗在美國已進入大田應用階段。國內自1988年863高技術研究發展計劃設立了水稻及玉米聯合固氮工程菌研究課題，兩課題組成功地構建了數株不同性能的工程菌并進行了田間小區實驗，八五期間廣東微生物所在廣東省中國農科院原子能利用研究所在江蘇省用水稻聯合固氮工程菌進行了數十萬畝大面積接種試驗，增產率分別達到8.4％及5-7％。經中國專利信息中心計算機檢索從1980-1994年11月國內外沒有有關聯合固氮菌菌肥專利的報道，2000年1月由中國科學院文獻情報中心做的查新報告結果指出國外文獻中未見有關聯合固氮耐銨工程菌進行田間試驗的報道，國內未見用聯合固氮菌構建耐銨工程菌在田間接種玉米獲得成功的報道。1950-2000年美國專利，1976-2000年日本專利，1985-2000年中國專利沒有有關聯合固氮工程菌菌肥專利的報道。，田間接種成功受很多因素影響，它依賴于起始細菌的特性，植物品種、土壤類型、接種量和環境條件，而要更好的發揮接種微生物的作用，其中一個重要環節是研究接種劑的配方，(包括菌和載體)以提供一個合適的微環境以保證在產品貯存、運輸、施用到土壤后，接種微生物的存活率。聯合固氮菌多數是非芽胞桿菌在土壤中存活率低對菌劑中保持菌種存活率的條件要求亦更高.。以草炭作為接種劑載體10年前在根瘤菌制劑上已得到成功，并廣泛得到應用。由于草炭是一不確定的復雜有機物，使制造、貯存，應用過程有很大變異性，近10年有很多關于新的合成聚合物和天然聚合物用作為微生物包裹劑，用這些聚合物包裹的細菌細胞制成新型的微生物制劑，改進了傳統草炭菌劑的缺點，大大提高了微生物接種劑的在土壤中存活率，抗干旱能力和生物效益，是很有潛力的，如法國的Azogreen TM但這類產品仍存在價格高，制作難度大，對產業化設備要求高的問題。同時很多研究亦表明混合接種劑(多種微生物組合)對植物的效應優于單一菌種，這也是微生物菌劑生產的一種趨勢。
本發明的一個目的是提供一種經過生物工程改造的耐銨工程菌。
本發明的另一個目的是提供一種生物肥料。
本發明人通過將篩選到的一種新的聯合固氮菌，日勾維腸桿菌(Enterobacter gergoviae)57-7(保藏號為CGMCC No.0510)，通過基因工程改造得到一種耐銨工程菌(日勾維腸桿菌Enterobacter gergoviaeE7)，并在中國微生物軍種保藏管理委員會普通微生物中心進行了保藏(保藏中心地址中國，北京，中關村，郵政編碼100080)，保藏號為CGMCC No.0511。保藏日為2000年11月28日。
耐銨工程菌Enterobacter gergoviae E7的特性1.耐銨工程菌E7的構建根據K.pneumoniue中固氮基因表達的調控機制，當nifA基因組成型表達，超量的nifA基因產物消除了nifL產物的阻遏作用，通過改造nifA基因，構建解除NH4+阻遏的耐銨工程菌使固氮菌在10mmol/L NH4+以上合成固氮酶。
重組質粒pCK3由美國C.Kennedy實驗室構建，(C.Kennedy 1985)是由pRK290質粒(Ditta 1980)與pMC73A質粒(Buchanan-Wallaston 1981a)整合而成。重組質粒的載體是pRK290廣宿主范圍低拷貝數的質粒，質粒大小為20Kb.具有二單一的限制性內切酶位點Bgl II和EcoR I和四環素抗性標記基因.pRR290中Bgl II位點整合來自pMC73A質粒BamH IDNA片段。BamH I片段含K.pneumoniae nifB啟動子控制的抗卡拉霉素基因及完整的nifA基因及nifL片段，由于nifL啟動子缺失，nifA基因的表達受pRK290質粒上四環素抗性基因啟動子控制是組成型表達的。pCK3重組質粒具有四環素及卡拉霉素抗性標記，是低拷貝數的質粒只有在助質粒pRK2013存在下才能在革蘭氏陰性菌間轉化，并能在革蘭氏陰性細菌中自行復制。
重組質粒pCK3在助質粒的pRK2013幫助下通過三親雜交，轉化到受體菌E.gergoviae 57-7中獲得轉交子E.gergoviae 57-7/pCK3。轉交子在含300mmol/L甲胺的平板上反復篩選得到抗甲胺并具有部分泌銨能力的耐銨工程菌E.gergoviae E7作為進一步的實驗菌株。
2.耐銨工程菌E7特性
轉交子E.gergoviae 57-7/pCK3在含抗生素的無氮KP培養基中的生長速率與固氮活性的消長規律與野生型菌相同，用抗固氮酶鐵蛋白抗體作為第一抗體的免疫印跡實驗表明轉交子在50mmol/L NH4+中仍能合成固氮酶，乙炔還原實驗表明轉交子在50mmol/L NH4+中恢復76％固氮活性在100mmol/L中恢復52％固氮活性，而野生型菌在10mmol/L NH4+就不能合成固氮酶，沒有固氮活性。NH4+對E.gergoviae57-7及E.gergoviae 57-7/pCK3固氮活性的影響
攜帶目的基因nifA的重組質粒pCK3在有抗性協迫條件下能在受體菌中穩定復制并表達。因nifA基因是受體菌本身具有的，nifA基因的組成型表達使受體菌具有耐銨能力，而在沒有抗性協迫條件下重組質粒pCK3在受體菌E.gergoviae 57-7不穩定，在宿主細胞連續裂殖過程中pCK3隨宿主細胞裂殖而自行丟失，在LB培養基中當宿主細胞裂殖50代pCK3的缺失達50％而宿主細胞裂殖110代pCK3質粒只存留0.1％。
采用Ap.Km.Tc三種抗性同時監測工程菌E7。經Rep-PCR基因組指紋圖譜分析得到E7的特征圖譜。
本發明還提供了一種生物肥料，它含有本發明的耐銨工程菌E7。這種生物肥料中所使用的載體可以是草炭。
實施例在佳木斯田間小區接種E7，10天后的幼苗玉米根系含E7菌量5×105CFU/克干根、根際土3.5×105CFU/克土、根外土0.2×103CFU/克土。20天后菌數達5.6×105CFU/克干根、6.2×105CFU/克根際土、0.2×103CFU/克根外土。到了抽雄期，玉米根系含E7菌數下降至3×102CFU/克土根，根際土含E7菌數下降為0.3×102CFU/克土，根外土中E7菌數為零，在地下水中一直監測不到E7的存在。
玉米聯合固氮工程菌E7在根、土壤、地下水中的存活(佳木斯農墾作物所1999年)
接種量＞1×107cfu/種子土壤草甸土培養基改良KP培養基+Ap100，Km50，Tc12.5
在氣溫較高的北京實驗地E7的消長規律與佳木斯相同。在自然條件下E7隨著根系生長而繁殖，但由于沒有抗生素協迫，pCK3質粒容易丟失部分E7回復成野生型。
用E57-7和E7接種在盆栽缺氮條件下培養的玉米幼苗和田間小區施氮肥條件下生長的玉米，發現接種使玉米根的次生根增加，根系總長和干重也明顯增加，接種工程菌E7比接種野生型E57-7更顯著地促進玉米根系的生長和發育。將載有nifH-gfp融合基因的質粒pMGFP21導入E57-7，并接種玉米幼苗，由于受化合態氮、氧和碳源等因素的限制，nifH-gfp融合基因在玉米根際不能表達。進而將載有能組成表達nifA基因的質粒導入E57-7/pGFP21，其中nifH-gfp的表達不再受化合態氮、氧等因素的遏制，耐銨工程菌在玉米根表面上表達了nifH-gfp。用15N同位素稀釋法也證實，玉米幼苗接種E7后，幼苗在34天里吸收的氮素中有14％源于生物固氮，而接種E57-7的固氮百分率為0。耐銨工程菌E.gergoviae E7與玉米聯合固氮
15N同位素稀釋法，盆栽實驗每項處理10盆每盆1株，37天苗齡E7在無機鹽培養基中生長，能向胞外分泌吲哚乙酸、赤霉酸、玉米素等植物激素。工程菌E7由于不僅能分泌植物激素，而且能持續固氮并向玉米提供氮素，因此能比接種E57-7更顯著地促進玉米根系的生長和發育，增強根系吸收水分和營養的能力，進而促進植株的生長和發育，在適宜的農藝管理下，就能使玉米顯著增產并節省氮肥。
2.菌劑制備及接種方式用含50μg/ml卡那霉素的KP培養基培養工程菌E7，固體平板培養基含1.5％瓊脂，種子罐及大罐培養基含50mmoles NH4+。30℃培養16-18小時菌數達8×109CFU/ml，用草炭作載體與菌液混合(7∶3)制備菌劑，使菌數達1-2×109CFU/克菌劑。
KP培養基配方Na2HPO4.12H2O 32g/LKH2PO40.68g/L PH8.0檸檬酸鐵 36mg/LMgSO430mg/LCaCl2.2H2O 26mg/LMnSO40.3mg/LNa2MoO4.2H2O 7.6mg/L蔗糖 20g/L酵母粉0.5g/L草炭菌劑采用拌種，做底肥或拌種加底肥，三種施用方法在田間小區做接種實驗。在正常施肥條件下三種施用方法皆比無菌對照有增產作用。按增產幅度計算拌種加做底肥＞做底肥＞拌種。施用量為1kg/666.7m2，5×107CFU/種子。工程菌的田間應用效果1995-1998年連續4年，在吉林省及黑龍江省農墾地區采用適宜的農田管理條件在田間小區接種工程菌E7比接種野生型菌及無菌載體顯著地促進了玉米增產及節省氮肥，為進一步大田應用提供了依據。
接種耐銨工程菌E7對玉米生長的影響以1997年寶泉嶺農場試驗為例，在砂壤土的田間小區試驗結果表明，接種工程菌E7與接種野生型菌和無菌載體相比，在不同生育期地上部分、地下部分干重皆有明顯增加，這種效應在苗期比較明顯。
接種工程菌E7對玉米生長的影響(寶泉嶺農場1997) 注玉米品種為四早11號，覆膜育苗，施肥量NPK＝20kg/666.7m2接種工程菌E7對玉米的增產效應試驗結果表明，無論在土壤肥力較高的草甸黑土或土壤肥力較低的白漿土，砂壤土及黑土、黑鈣土中接種工程菌E7對玉米產量的影響皆優于野生型菌及無菌載體，但增產的幅度與土質有明顯相關性。在土壤肥力較低的白漿土、砂壤土中，不論施用化肥量為16.8kg/666.7m2或20kg/666.7m2，接種工程菌E7皆比接種無菌載體及野生菌對產量的影響大，接種工程菌E7比無菌載體增產平均幅度達到12.3％，而接種工程菌E7比接種野生菌E57-7平均增產8.8％。多數實驗點的生物統計表明差異達到顯著水平(P＝0.05)
在白漿土、砂壤土中接種工程菌E7對玉米的增產效應
*生物統計差異顯著(P＝0.05)
在黑土及黑鈣土試驗田，接種工程菌E7比無菌載體增產平均幅度達到14.6％生物統計表明差異達到顯著水平(P＝0.05)而接種工程菌E7比接種野生菌E57-7平均增產4.7％。在黑土、黑鈣土中接種工程菌E7對玉米的增產效應
生物統計F測定各處理間差異顯著，用L.S.D法多重比較，E7及E7+K處理，效果皆高于WT及CK，產量差異顯著或極顯著。除化肥外加施農家肥2m3/畝。
K為硅酸鹽細菌(復合菌劑的效果比單一菌好)。
在肥力較高的草甸黑土中，當NPK施肥量在20kg/666.7m2時，接種工程菌E7與接種野生菌E57-7和無菌載體CK相比對玉米產量的影響差別不大，增產幅度只有2.6％。但當降低化肥用量至16.8kg/666.7m2時接種工程菌E7增產幅度提高。
在草甸黑土中接種工程菌E7對玉米的增產效應
接種工程菌E7的節肥效應1997-1998年在黑龍江省土質為白漿土砂垠土的試驗田做小區節肥試驗，節肥實驗方案化肥N∶P∶K＝2∶1∶0.3，NPK＝16.8kg或20kg/666.7m2。(1)對照+100％氮肥；(2)野生型菌株E57-7+100％氮肥；(3)野生型菌株E57-7+90％氮肥；(4)工程菌E7+100氮肥；(5)工程菌E7+90％氮肥；(6)工程菌E7+80％氮肥。
每項處理用磷酸二銨和氯化鉀做種肥，施用量相同。在玉米生長至大喇叭口期施不同量的尿素做追肥，100％氮肥指正常施氮量，90％、80％氮肥指施氮量為正常施氮量的80％、90％。
當降低氮肥用量至正常施氮量的90％，接種工程菌E7仍比正常施氮量(100％N)下接種無菌載體使玉米增產，分別為17.9％，10.2％，5.6％，1.6％和-2.6％。而當氮肥用量為正常施氮量的80％時，接種工程菌E7比正常施氮量(100％N)下接種無菌載體平產或略減產。結果表明，在玉米相同產量水平上接種工程菌E7比接種無菌載體節省15％-20％氮肥。
當降低氮肥用量至正常施氮量的90％，接種工程菌E7比正常施氮量(100％N)下接種野生型菌使玉米增產，增產幅度分別為9.6％，5.9％，7.9％，1.2％ 和-5.2％，而當氮肥用量為正常施氮量的80％時接種工程菌E7比正常施氮量(100％N)下接種野生型菌平產或減產。結果表明，在玉米相同產量水平上，接種工程菌E7比接種野生型菌節省15％氮肥。
玉米田間小區接種工程菌E7的節肥效應(1997-1998年) NPK總施用量20Kg/666.7m2，土質為白漿土，或砂壤土。*生物統計差異顯著(P＝0.05)
1999年在黑龍江省進行400畝大田(白漿土)接種工程菌E7示范對比實驗，增產幅度達到7.3％(由于接種劑質量及當年氣溫較低影響增產幅度)。玉米聯合固氮工程菌E7大田示范實驗(1999年)
菌劑E＜1×109CFU/克草炭，菌劑拌種，玉米直播.N∶P∶K＝2∶1∶0.31999年4-7月黑龍江地區氣溫偏低，比往年低5℃采用溝施法接種，E7接種量為2Kg/菌劑/666.7m，E7菌數＜109CFU/克菌劑
權利要求
1.一種耐銨工程菌，日勾維腸桿菌Enterobacter gergoviae E7，保藏號為CGMCCNo.0511。
2.一種生物肥料，含有權利要求1所述的耐銨工程菌。
3.按照權利要求1所述的生物肥料，還含有草炭。
全文摘要
本發明涉及一種耐銨工程菌,日勾維腸桿菌Enterobacter gergoviaeE7,保藏號為:CGMCC No.0511。本發明還涉及一種生物肥料,含有權利要求1所述的耐銨工程菌。
文檔編號C05F11/08GK1355294SQ0013362
公開日2002年6月26日 申請日期2000年11月29日 優先權日2000年11月29日
發明者李久蒂, 李永興, 董越梅, 安千里, 王繼文, 匡柏健 申請人:中國科學院植物研究所