一種提高哺乳動物核移植胚胎早期發育率的方法

專利名稱：一種提高哺乳動物核移植胚胎早期發育率的方法
技術領域：
本發明涉及轉基因動物技術、胚胎工程與發育生物學領域，更具體地，涉及一種提高哺乳動物核移植(NT)胚胎早期發育率的方法。
背景技術：
核移植(Nuclear transfer，NT)是研究核質互作關系中諸多重要問題的最有效方法。應用不同分化程度的細胞核移入去核卵母細胞的方法，已經在兩棲類動物獲得發育完全的個體。在最近的二十年期間，核移植方法在哺乳動物中發展神速，并已開始應用于生產。
大量結果表明，在同種動物之間，把中II期卵母細胞/受精卵作為受體細胞(供質細胞)，把不同分化程度的細胞作為供核細胞，兩者所組成的重構胚在移入寄母生殖道后，在牛、羊、豬、兔、猴、小鼠等多種動物中均已獲得相應的核移植后代；甚至把經過修飾的體細胞作供核細胞，采用類似的徑路，也相應獲得轉基因的核移植牛、綿羊、山羊、豬、兔等。
但至今為止，獲得克隆動物的成功仍然較低，一般為1-3％，其原因很多，如重排序、印跡等使NT胚胎的著床前、后的發育受到影響。其中，在體細胞克隆動物制備過程中所使用的供核細胞需經體外的長期培養，尤其是經過基因遺傳修飾(如隨機整合或定點打靶)的單克隆體細胞，隨著代次的增加，其染色體的變異等可能是影響NT的重排序及著床后發育的一個重要因素。因此，研究人員將體外培養的細胞(未饑餓)冷凍保存于液氮中，使用前再復蘇，培養數天后再使用，或將體外培養的細胞(饑餓)冷凍保存于液氮中，復蘇后直接用于核移植試驗，但以上的研究表明，NT胚胎的著床前發育率一般仍較低。
因此，本領域迫切需要開發新的提高哺乳動物核移植胚胎早期發育率的方法。

發明內容
本發明的目的就是提供一種提高核移植胚胎早期發育率的方法。該方法不僅提高了核移植胚胎早期發育率，而且解決了核移植試驗中供核細胞的使用與長期保存，以及長期培養對染色體變異等產生的影響，也解決了凍存細胞復蘇直接用于試驗造成NT胚胎早期發育率低的缺點。
在本發明的第一方面，提供了一種提高非人哺乳動物核移植胚胎早期發育率的方法，包括步驟(a)將非人哺乳動物的供核細胞經饑餓處理2-5天；(b)冷凍保存步驟(a)的供核細胞；(c)復蘇步驟(b)的供核細胞；(d)在非饑餓條件下培養步驟(c)的供核細胞2-5天(e)將步驟(d)的供核細胞饑餓處理1-4天；(f)將步驟(e)的供核細胞用于核移植。
在一優選例中，所述的饑餓處理條件為含0.1-1％FCS的DMEM培養液。
在另一優選例中，所述的非饑餓條件為含10-20％FCS的DMEM培養液。
在另一優選例中，所述的非人哺乳動物選自下組牛、羊、豬、狗、貓、兔、猴、小鼠。
在另一優選例中，所述的供核細胞包括來自哺乳動物的組織、器官的細胞、體外培養的體細胞、及遺傳修飾過的體細胞。
在另一優選例中，所述的步驟(f)包括將步驟(e)的供核細胞用作供核細胞，移入去除遺傳物質的哺乳動物的中II期卵母細胞的卵周隙內，經電融合、化學激活后，將NT胚胎經瓊脂糖包理后移入臨時寄母輸卵管內或在體外培養、獲得早期發育的NT胚胎。較佳地，所述的電融合條件是0.3M甘露醇，4mg/ml的胎牛血清，0.1mM MgSO4，在140-160V/mm，80μs條件下3次電刺激；然后，融合卵在以下條件下化學方法激活10μM伊屋諾霉素5分鐘+2μM 6-DMAP 3-6小時。
在本發明的第二方面，提供了一種處理供核細胞的方法，包括步驟(a)將供核細胞經饑餓處理2-5天；(b)冷凍保存步驟(a)的供核細胞；
(c)復蘇步驟(b)的供核細胞；(d)在非饑餓條件下培養步驟(c)的供核細胞2-5天(e)將步驟(d)的供核細胞饑餓處理1-4天，獲得供核細胞。
在本發明的一優選例中，所述的供核細胞是非人哺乳動物的細胞。


圖1顯示了本發明方法的技術路線圖。
圖2貼壁生長的(A)與懸浮的(B)經基因打靶的單克隆山羊胎兒成纖維細胞。
圖3包理在瓊脂內的發育的NT胚胎。箭頭所指為囊胚。
具體實施例方式
本發明人經過深入而廣泛的研究，發現通過在冷凍保存前對供核細胞進行饑餓處理，并且在復蘇后再次進行饑餓處理，可以大幅提高核移植胚胎早期發育率。在此基礎上完成了本發明。
簡而言之，本發明方法包括步驟將哺乳動物的供核細胞經饑餓處理2-5天后，再冷凍保存，使用前復蘇，在非饑餓培養液中培養2-5天，再饑餓1-3天的細胞用作供核細胞，移入去除遺傳物質的哺乳動物的中II期卵母細胞的卵周隙內，經電融合、化學激活后，將NT胚胎經瓊脂糖包理后移入臨時寄母輸卵管內或在體外培養、獲得較高的早期發育的NT胚胎。
本發明的核心步驟是對供核細胞的處理(包括哺乳動物體細胞的培養)，它包括(i)首先，提供所需的哺乳動物細胞。
根據所需克隆動物的種類和要求，用常規方法選擇組織或器官建立細胞系。一種常用的方法為將組織、器官或末分化細胞用胰酶消化成單個細胞，用DMEM或RM1640等培養液(加10-20％胎牛血清，FCS)培養，傳代，遺傳分析，或進行遺傳修飾。
(ii)接著，將以上所有類型的供核細胞，進行饑餓處理。
饑餓處理的條件指血清濃度低于1％的培養條件，例如含0.1-1％或0.25-0.75％小牛血清(FCS)的DMEM液。饑餓處理時間通常為2-5天，較佳地為2-4天；然后，冷凍保存供核細胞。一種優選的技術方案是在含0.5％FCS的培養液中，饑餓處理2-5天后。
冷凍保存可保存于-80℃冰箱中(短期)或在液氮中(長期)。例如，在冷凍液(含20％DMSO、80％FCS液)冷凍保存于-80℃冰箱中，每支凍存管含1000-5000個細胞。
(iii)然后，復蘇冷凍保存的供核細胞，并在非饑餓條件下培養供核細胞。
復蘇采用常規方法，而非饑餓條件就是常規的培養條件，通常是血清濃度大于5％(如10-20％FCS)的培養條件。特別優選的例子是含10％、15％或20％FCS的DMEM培養液。非饑餓條件下的培養時間通常為1-6天，較佳地為2-5天，具體時間根據細胞生長的豐度而定，最佳的豐度為75％左右。
一種優選的技術方案是在核移植試驗前，將該細胞在37℃水浴中解凍，然后去除冷凍液，加入含10-20％的FCS的DMEM液，培養2-5天。
(iv)再次饑餓處理，獲得用于核移植試驗的供核細胞。
再次饑餓處理的條件基本上與冷凍前的饑餓處理條件相同，即含0.1-1％(如0.5％)小牛血清(FCS)的DMEM液中培養。饑餓處理時間通常為1-4天，較佳地為1-3天。
一種優選方法是是在含0.5％FCS的培養液中培養2天，再饑餓1-4天，用胰蛋白酶消化成懸浮的細胞，即得到用于核移植試驗的供核細胞。
除了對供核細胞的進行至少兩次饑餓處理(即在冷凍保存前的饑餓處理和在冷凍復蘇后的饑餓處理)之外，制備轉基因動物的其他技術與現有技術沒有區別。因此，本領域常規的各種制備轉基因動物的技術都可用于本發明。
為了人們更清楚地了解本發明，以下對包括制備卵母細胞、核轉移等相關技術也作一描述。
一、供質(提供卵母細胞)母畜超數排卵技術(或應用體外成熟卵母細胞)超數排卵是指采用制劑誘導動物一次排出正常排卵數若干倍的方法。通過激素[孕馬血清促性激素(PMSG)；促卵泡激素(FSH)、促卵泡激素釋放因子(LRH)]處理，使母畜呈非季節性排卵，并且在一次排卵中，能排出較多的卵子。具體方法是每只動物肌注氯前列烯醇(PG)0.06-0.1mg/次，間隔10-14天后注射第二次，在第二次注射PG 10-14天后開始超排，即首先肌肉注射FSH，用量按7-12IU/Kg計(不同種動物用量不盡相同)，分6次，2次/日，每次間隔8-12小時。間隔24小時發情時注射LRH，25ug/次，注射LRH后_28-30小時回收卵母細胞。
二、臨時寄母的激素處理(與NT胚胎發育同步)為與提供卵母細胞胞質的供質母羊同步，臨時寄母間隔10-14天分兩次肌肉注射PG，在供質母羊超排注射PG前12小時，受體也同時注射PG，受體注射LRH的時間及劑量同供體。
三、卵母細胞的收集提供卵母細胞的母畜在注射LRH后26-30小時，進行卵母細胞的收集。收集是通過手術的方法，在母畜的腹部作一切口，將母畜的輸卵管與卵巢暴露在體外，用沖卵液(F10+5％FCS)從輸卵管中沖出卵母細胞，將收集的卵母細胞培養在M16液中。
四、卵母細胞去核與移核將卵母細胞移入含CB的M2手術液中20分鐘后，將供核細胞與卵母細胞一同置于玻片上，在顯微鏡下，用持卵針固定卵母細胞，卵母細胞排出的極體處于鐘表3點位，去核針正對著或稍偏離極體去除極體與一部分胞質。去核之后立即將1個供核細胞移入去核卵周隙內，重復下一枚卵的操作，直至所卵母細胞操作完成后，將移入供核細胞的卵母細胞置于M16液培養30min。
五、融合與NT胚胎的激活將移入供核細胞的卵母細胞在激活液(0.3M甘露醇，4mg/ml的胎牛血清，0.1mM MgSO4)中，在140-160V/mm，80μs電刺激三次，在M16液中培養30min，觀察是否融合。未融合的卵再融合一次。融合的NT胚胎在M16液中培養4-6小時，再用化學方法激活(10μM離子霉素，Ionomycin5分鐘+2μM 6-二甲基氨基嘌呤(6-dimethylaminopurine，6-DMAP)4-6小時)，激活后胚胎移入M16培養液中體外培養或經瓊脂糖包理后移入臨時寄母輸卵管內培養。
六、重構胚體內培養應用手術的方法，將激活后的NT胚胎用1％的低熔點瓊脂糖包理后，吸入移卵管內，從輸卵管喇叭口處插入將卵移進輸卵管內，隨后在輸卵管與子宮連接部用縫線結扎。在體內培養4-7天后(不同種的動物培養的時間不同)，剪下輸卵管，用培養液沖出胚胎，觀察胚胎發育情況。
本發明的主要優點在于1)顯著地提高NT胚胎的早期發育率。
2)解決了供核細胞的使用與長期保存之間的矛盾，使長期培養所造成的對染色體變異等產生的影響，以及凍存細胞復蘇后直接用于試驗造成NT胚胎早期發育率低的缺點。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1奶山羊體細胞的幾種處理方式對核移植胚胎早期發育的影響1材料與方法1.1.試劑均為胚胎級試劑，除另有說明外均為Sigma產品。
1.2方法1.2.1供質卵母細胞采集奶山羊應用FSH按常規進行超數排卵，在注射LRH后29-30小時，采用手術回收卵母細胞，用含5％小牛血清(FCS，Gibco)的F-10(Gibco)培養液沖洗輸卵管。收集卵母細胞，透明質酸酶去除附著的顆粒細胞。收集的卵母細胞置于M16液中，37.5℃，5％的二氧化碳培養箱中培養。
1.2.2供核細胞1.2.2.1薩能奶山羊胎兒成纖維細胞薩能奶山羊胎兒成纖維細胞按照文獻[21]方法培養獲得。即從懷孕35天母山羊經手術采集胎兒，去頭、四肢以及內臟后，將其剪成泥狀，加入胰蛋白酶(0.25％Trypsin/1mM EDTA)，37℃，消化20min，接著加入含10％FCS的DMEM培養液終止消化，500g離心15min。棄去上清，將細胞重懸于培養液內，接種至培養瓶中，置于培養箱中，37℃、5％CO2培養。待細胞生長豐度達85％后，按常規傳代培養。
1.2.2.2基因轉染、篩選與單克隆細胞株的建立將構建好的基因載體與胎兒成纖維細胞電轉染，篩選、鑒定，獲得定點整合的單克隆細胞株，將該細胞在含0.5％FCS培養液是饑餓處理72小時后，采用以下幾種處理方式后，用于核移植試驗。
1.2.2.2試驗分組試驗分為三組，其中試驗組I和II為對照，試驗組II為本發明方法。
(a)試驗組I將經基因打靶的單克隆細胞，饑餓72h后，一部分細胞凍存于-80℃冰箱，試驗前1小時復蘇，即用于試驗；(b)試驗組II另一部分細胞消化傳代，在含10％FCS的DMEM液，繼續培養2天后，再饑餓48h，豐度在70-85％時用于試驗；(c)試驗組III第三部分細胞饑餓72h后，凍存于-80℃冰箱，使用前四天復蘇，培養2-5天，再饑餓48小時，豐度在70-85％時用于試驗。
除供核細胞的處理有差異外，其余操作均一致。
1.2.3重構卵的構建及其激活1.2.3.1重構卵的構建卵母細胞在M16-Hepes(含Hepes 2.8mg/ml，CB 7.5μg/ml)液中洗滌3次，在M16-Hepes中處理10min；同時將培養的細胞用胰酶消化、分散成單個細胞后立即加入小牛血清以終止消化，經500g離心2min后，去除上清，加入20μlM16-Hepes液。將卵母細胞與供核體細胞同時移入M16-Hepes中，在顯微鏡下將卵母細胞核去除后隨即將供核細胞移入卵周隙。去、移核方法按照Wilmut I，Schnieke AE，McWhir J，Kind AJ，Campbell KHS.Viable offspring derived fromfetal and adult mammalian cells.Nature 1997；385810-813中所述的方法。
移入供核細胞的卵在M16培養液中洗滌3次，置于M16液中，37℃培養30min后，進行電融合(0.3mM甘露醇、0.05mM CaCl2、0.1mM MgSO4、5％BSA)，融合條件為DC、140-160V/mm，脈沖持續時間為80μs，連續刺激三次。刺激后的卵置于M16培養液中培養20-30min觀察是否融合，融合卵為重構卵；未融合的重復一次。
1.2.3.2重構卵的激活重構卵在M16液中，37℃、5％CO2培養箱中培養5小時后，用含5μM離子霉素、7.5μg/ml細胞松弛素B(CB)、不含Ca2+、Mg2+的M16-Hepes液處理5min，再在2mM 6-二甲基氨基嘌呤(6-diethylaminopurine，6-DMAP)、7.5μg/mlCB、不含Ca2+、Mg2+的M16-Hepes培養液中培養4-5小時。激活后的重構胚置于M16培養液中作短暫培養。
1.2.4重構胚的體內培養與發育的觀察應用手術的方法，將激活后的NT胚胎用1％的低熔點瓊脂糖包理后，吸入移卵管內，從輸卵管喇叭口處插入將卵移進輸卵管內，隨后在輸卵管與子宮連接部用縫線結扎。在體內培養4-7天后，剪下輸卵管，用培養液沖出胚胎，觀察胚胎發育情況。
2.結果
2.1概況本次試驗供投入羊數105頭，其中供質羊數84頭，寄母羊21頭；平均每只供體羊經超數排卵后獲9.3(785/84)枚，將卵細胞去核后再移入供核細胞，其移核率為92.3％(724/785)；移核卵經電刺激后融合率為78.67％(426/541)；將融合卵經瓊脂包埋后移入寄母輸卵管內培養6天再回收，其回收率為86.69％(469/541)；回收卵發育至桑椹與囊胚期的比率為56.29％(264/469)；將發育的桑椹與囊胚期胚胎移入受體羊的子宮內，共移124頭植受體，至35日齡時，受體羊的妊娠率為38.7％。詳見表1。
表1、定點整合體細胞克隆試驗結果

2.2供核細胞的幾種處理方式對NT胚胎的早期發育的影響在試驗組III中，應用經饑餓處理72小時，冷凍保存后，使用前復蘇，培養2-5天后，再饑餓24-48小時的供核細胞所組構的NT胚胎的分裂率(89.70％、桑椹與囊胚的發育率(66.09％)，均顯著地高于試驗組I(分裂率、桑椹與囊胚的發育率分別為70％、22.00％)與試驗組II(分裂率、桑椹與囊胚的發育率分別為67.35％，50.51％)。
冷凍復蘇后直接用于試驗的供核細胞所組構的NT胚胎的分裂率及桑椹囊胚發育率最低，與其它兩試驗組相比差異顯著。其原因可能是解凍復蘇后的細胞立即用于試驗時，其細胞未能得到充分的恢復，影響了其在卵母細胞中的重排序，從而影響了NT胚胎的早期發育，而試驗組III則完全避免了這點，具有很高的桑椹與囊胚的發育率，經對移植受體的早期妊娠檢查，結果有近40％的受體妊娠。這表明，雖然具有很高的桑椹與囊胚的發育率，但仍不影響早期發育胚胎的著床。雖然試驗組II的NT胚胎的早期發育率高于試驗I，但隨著細胞在體外的傳代次數的增加(本身已為單克隆細胞株，其代次已很高)，其細胞體積增大，染色體發生的變異的幾率也隨著增加。因此，試驗組III還具有一非常重要的優點，即是解決了細胞在體外的長期培養所造成的染色體變異的影響，能長期保存，在使用時復蘇少量細胞(如四孔板中的四孔)，一次可用于四次試驗，下批試驗再復蘇少量細胞即可。
表2.供核細胞經不同處理后對NT胚胎的早期發育的影響

未分裂率＝(1細胞數+瓦解數+空秀明帶)/回收卵總數a:b，a:c，P＜0.01，b:c P＜0.05；注表1是整個試驗的數據統計，表2是三個試驗組分開統計的。
3、結論1)饑餓后的供核細胞經冷凍保存后，復蘇培養2-5天后，再進行饑餓處理后作供核細胞，能顯著地提高NT胚胎的早期發育率(66.09％)。
2)解決了供核細胞的使用與長期保存之間的矛盾，使長期培養所造成的對染色體變異等產生的影響，以及凍存細胞復蘇后直接用于試驗造成NT胚胎早期發育率低的缺點。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
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1.一種提高非人哺乳動物核移植胚胎早期發育率的方法，其特征在于，包括步驟(a)將非人哺乳動物的供核細胞經饑餓處理2-5天；(b)冷凍保存步驟(a)的供核細胞；(c)復蘇步驟(b)的供核細胞；(d)在非饑餓條件下培養步驟(c)的供核細胞2-5天(e)將步驟(d)的供核細胞饑餓處理1-4天；(f)將步驟(e)的供核細胞用于核移植。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的饑餓處理條件為含0.1-1％FCS的DMEM培養液。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的非饑餓條件為含10-20％FCS的DMEM培養液。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的非人哺乳動物選自下組牛、羊、豬、狗、貓、兔、猴、小鼠。
5.根據權利要求1所術的方法，其特征在于，所述的供核細胞包括來自哺乳動物的組織、器官的細胞、體外培養的體細胞、及遺傳修飾過的體細胞。
6.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步驟(f)包括將步驟(e)的供核細胞用作供核細胞，移入去除遺傳物質的哺乳動物的中II期卵母細胞的卵周隙內，經電融合、化學激活后，將NT胚胎經瓊脂糖包理后移入臨時寄母輸卵管內或在體外培養、獲得早期發育的NT胚胎。
7.根據權利要求6所術的制備方法，其特征在于，電融合條件是0.3M甘露醇，4mg/ml的胎牛血清，0.1mM MgSO4，在140-160V/mm，80μs條件下3次電刺激；然后，融合卵在以下條件下化學方法激活10μM伊屋諾霉素5分鐘+2μM 6-DMAP 3-6小時。
8.一種處理供核細胞的方法，其特征在于，包括步驟(a)將供核細胞經饑餓處理2-5天；(b)冷凍保存步驟(a)的供核細胞；(c)復蘇步驟(b)的供核細胞；(d)在非饑餓條件下培養步驟(c)的供核細胞2-5天(e)將步驟(d)的供核細胞饑餓處理1-4天，獲得供核細胞。
9.如權利要求8所述的方法，其特征在于，所述的供核細胞是非人哺乳動物的細胞。
全文摘要
本發明提供了一種提高非人哺乳動物核移植胚胎早期發育率的方法，包括步驟(a)將非人哺乳動物的供核細胞經饑餓處理2－5天；(b)冷凍保存供核細胞；(c)復蘇；(d)在非饑餓條件下培養供核細胞2－5天(e)將供核細胞饑餓處理1－4天；(f)將供核細胞用于核移植。該方法不僅能提高胚胎發育率，還解決了核移植試驗中帶有定點整合的供核細胞使用與長期保存，以及長期培養對染色體變異等產生的影響。
文檔編號A01K67/027GK1500384SQ02145298
公開日2004年6月2日 申請日期2002年11月15日 優先權日2002年11月15日
發明者成國祥, 陳建泉 申請人:上海杰隆生物工程股份有限公司