專利名稱：小麥高效遺傳轉化技術的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種獲得小麥高效遺傳轉化的方法。
背景技術：
在轉基因小麥的研究中，基因槍法是目前獲得小麥轉基因植株的主要方法。
目前被公認并被廣泛采用的基因槍轉化受體是未成熟胚及其衍生物。但是，應用此轉化系統獲得的基因轉化效率偏低， 僅可以達到0.1％-2.5％。而且其轉化效率還要受到基因型的影響，尤其是，將近20％的基因型很難得到再生植株。因此，一些綜合農藝形狀好的品種由于再生性差無法獲得轉基因植株，而少數再生性強的品種又不是生產實踐所需要的或在生產實踐中的應用很有限。
發明內容
本發明的目的是克服現有的轉化系統轉化效率低的缺點，建立一種可以得到較多的轉基因植株，獲得較高的基因轉化頻率的轉化方法。
本發明的方案是通過選擇適宜外植體、調整培養基成份和配套改進措施，將外源目的基因導入小麥，以獲得較高的基因轉化頻率。
本發明選用了3個品種的植物材料進行了研究。研究了小麥不同外植體對離體培養的反應及小麥不同外植體基因槍轉化效率。發現以適宜時期(護穎分化期到雌雄蕊原基分化期)的幼穗作為外植體，在誘導培養基上進行愈傷組織誘導培養，在幼穗愈傷組織生長旺盛期進行基因槍轉化，可以獲得較高的基因轉化頻率。
本方法在分化篩選后增加一個芽苗的誘導及伸長階段，可以更好地達到本發明的目的。
具體方法步驟如下1.將幼穗作為外植體接種于誘導培養基上；2.愈傷組織生長旺盛期，用基因槍轟擊幼穗愈傷組織；3.將上述愈傷組織轉至篩選培養基上進行Basta抗性篩選；4.將經篩選的愈傷組織轉至芽苗伸長培養基上；5.移栽幼苗長至15cm高時用Basta進行再次篩選。
6.轉化株葉片進行PCR檢測。
本發明對三個基因型的適時幼穗和相應的未成熟胚進行了離體對照培養。結果顯示以適時幼穗作為外植體進行離體培養的綠苗分化率高于其相應的未成熟胚。表明以幼穗作為外植體進行基因轉化能獲得較高的綠苗分化率。
在進行小麥不同外植體基因槍轉化效率的研究中發現，以幼穗愈傷組織作為基因槍轉化受體時，基因轉化效率較高，可達到2.53％～8.16％；而以未成熟胚愈傷組織作為基因槍轉化受體的對比實驗中，或未獲能得陽性植株，或轉化效率只有0.91％。表明本發明以幼穗作為外植體接種進而進行基因槍轉化可以獲得較高的基因轉化頻率。
本發明研究的以幼穗作為轉化受體的轉化系統克服了以往的轉化系統的轉化效率低的缺點，可以得到較多的轉基因植株，獲得較高的基因轉化頻率，轉化效率最高可達到8.16％，是一種高效的小麥基因轉化體系。
具體實施例方式實施例一.材料與方法1.植物材料準備選擇綜合農藝性狀較好的藁城8901、H6756和H311為試驗材料，取田間護穎至雌雄蕊原基形成期的幼穗，用0.1％HgCl2消毒，無菌水沖洗。
2.培養基愈傷組織的誘導和繼代培養基為MS+2mg/l 2.4-D高滲培養基為MS+0.2mol/L山梨醇+0.2mol/L甘露醇誘導篩選培養基MS+0.2mg/L 2，4-D+5mg/L Basta分化篩選培養基MS+5mg/L Basta芽苗伸長培養基MS+0.2mg/1NAA+1.5mg/1BA生根培養基1/2MS+0.2mg/L IAA3.培養條件愈傷組織誘導為25℃暗培養，愈傷組織分化培養為26℃14h/10h光照培養。
4.微粒子彈的制備稱取60mg金粉于1.5ml離心管中，加入1ml70％乙醇，用旋渦混合器混合，離心去上清液，用無菌水重復洗3次，加入1ml 50％的無菌甘油，并用旋渦混勻。取50μl上述制備的金粉至一無菌離心管中，順序加入5μl質粒DNA、50μl2.5MCaCl2和50μl0.1M亞精胺，將混合物旋渦、離心、去上清夜。用70％乙醇和100％乙醇各沉淀1次，最后用48μl100％乙醇重新懸浮、分散顆粒。
5.PCR檢測條件反應體系為10μL，反應條件為94℃預變性5min；94℃變性50s，41℃復性40s，72℃延伸1min，循環35次；72℃延伸5min，4℃保存。
二.試驗步驟1.取藁城8901、H6756和H311三個品種護穎至雌雄蕊原基形成期的幼穗，作為外植體；接種前用0.1％HgCl2消毒8-10分鐘，無菌水沖洗2-3次，于超凈臺中剝離出幼穗接種于誘導培養基上。
2.接種一周左右在愈傷組織生長旺盛期將幼穗愈傷組織擺放于高滲培養基的培養皿中央，6小時后用Bio-Rad公司生產的PDS-1000/He型基因槍轟擊。轟擊壓力為1100psi，真空度為27-28pa，轉化材料與微彈之間的距離為7cm。
3.轟擊后18h，將愈傷組織轉至誘導培養基上恢復培養10天。
4.恢復培養后的愈傷組織轉至誘導篩選培養基上進行Basta抗性篩選，20天后轉至分化篩選培養基上篩選。
5.分化篩選后轉至芽苗伸長培養基上，該培養基能有效促使大量弱小芽苗生長，從而大幅提高綠苗分化率。
6.再生綠苗轉至生根培養基上(1/2MS+0.2mg/L IAA)壯苗。最后將含有健壯根系的綠苗經0～4℃春化處理，煉苗移栽。
7.移栽幼苗長至15cm高時，用棉簽沾取100mg/L的Basta溶液涂抹轉化株的葉片，10天后觀察葉片壞死情況。
8.剪取具有除草劑抗性的轉化株的葉片，采用CTAB法提取總DNA，進行PCR檢測。
三.實驗結果1.小麥不同外植體對離體培養的反應本試驗對三個基因型的適時幼穗和相應的未成熟胚進行了離體培養，結果見表1。
表1.不同品種及外植體離體培養結果品種名稱 外植體接種數 出愈數 出愈率(％) 轉分化愈傷 綠苗數綠苗分化率(％)H6756 適時幼穗 95 95 100 58 32 55.17未成熟胚 100 100 100 63 711.11H311 適時幼穗 80 80 100 70 32 45.71未成熟胚 100 98 98 60 58.33
藁城8901適時幼穗100 99 99 80 60 75未成熟胚100 100 100 80 55 68.75以上結果可看出，H6756和H311，以幼穗作為外植體離體培養綠苗分化率分別為55.17％和45.71％，其相應的未成熟胚的綠苗分化率只有11.11％和8.33％；藁城8901幼穗綠苗分化率為75％，高于未成熟胚綠苗分化率68.75％。
結論適時幼穗作為外植體進行離體培養的綠苗分化率高于其相應的未成熟胚，以幼穗作為外植體進行基因轉化能獲得較高的綠苗分化率。
2.小麥不同外植體基因槍轉化效率用基因槍分別轟擊H6756、H311和藁城8901三個品種(品系)幼穗誘導的胚性愈傷組織及未成熟胚誘導的胚性愈傷組織。
三組對比實驗中，基因轉化效率分別為5.36％和0、2.53％和0、8.16％和0.91％。具體結果見表2。
表2 不同外植體基因轉化結果品種名稱外植體 轟擊外植Basta抗性 Basta抗性株PCR陽性株數PCR陽性株率體總數 株數率(％)(％)H6756 適時幼穗932 205 22.00 50 5.36未成熟胚431 0 0 0 0H311適時幼穗475 70 14.74 12 2.53未成熟胚199 0 0 0 0藁城8901適時幼穗49 13 26.53 4 8.16未成熟胚881 440 49.94 8 0.91從以上結果可以看出，以幼穗愈傷組織作為基因槍轉化受體時，基因轉化效率較高，最高可達到8.16％，最低為2.53％，而以未成熟胚愈傷組織作為基因槍轉化受體時，轉化效率最高只有0.91％，特別是H6756和H311均未獲得陽性植株。
結論以幼穗作為外植體接種進而進行基因槍轉化可以獲得較高的基因轉化頻率。
權利要求
1.一種小麥高效遺傳轉化方法，其特征是將護穎分化期到雌雄蕊原基分化期的小麥幼穗作為外植體，在誘導培養基上進行愈傷組織誘導培養，在幼穗愈傷組織生長旺盛期進行基因槍轉化。
2.權利要求1所述的方法，在幼穗愈傷組織分化篩選后增加一個芽苗的誘導及伸長階段。
3.權利要求2所述的方法，具體方法步驟是1)將幼穗作為外植體接種于誘導培養基上；2)愈傷組織生長旺盛期，用基因槍轟擊幼穗愈傷組織；3)將上述愈傷組織轉至篩選培養基上進行Basta抗性篩選；4)將經篩選的愈傷組織轉至芽苗伸長培養基上；5)移栽幼苗長至15cm高時用Basta進行再次篩選。6)轉化株葉片進行PCR檢測。
全文摘要
本發明涉及一種獲得小麥高效遺傳轉化的方法。本發明通過選擇適宜外植體、調整培養基成分和配套改進措施，將外源目的基因導入小麥。本發明以適宜時期(護穎分化期到雌雄蕊原基分化期)的幼穗作為外植體，在誘導培養基上進行愈傷組織誘導培養，在幼穗愈傷組織生長旺盛期進行基因槍轉化。本發明研究的以幼穗作為轉化受體的轉化系統克服了以往的轉化系統的轉化效率低的缺點，可以得到較多的轉基因植株，獲得較高的基因轉化頻率，轉化效率最高可達到8.16％，是一種高效的小麥基因轉化體系。
文檔編號A01H1/04GK1618278SQ20031011534
公開日2005年5月25日 申請日期2003年11月20日 優先權日2003年11月20日
發明者劉錄祥, 趙林姝, 梁欣欣, 鄭企成, 王晶, 趙世榮, 郭會君, 陳文華 申請人:中國農業科學院作物育種栽培研究所