專利名稱：牡丹規范化快繁方法
技術領域：
本發明涉及植物學領域。更佳的是，本發明涉及一種規模化快速繁殖牡丹的方法。
背景技術：
牡丹(Paeonia suffruticosa)是我國的候選國花，素有國色天香和百花之王的美譽，起源于我國，已演變成四大種群。國內利用高新技術，在牡丹新品種的選育和溫控化控調節花期方面也已取得了很大進展。但牡丹名特優品種因長期人工栽培，大部分結實能力降低，種子發育不良而只能進行無性繁殖，在用遠緣雜交培育品種時也常遇到雜交不育或種子發育不良不能萌發等問題。這些因素對牡丹名特優品種的繁育及推廣造成影響。因此，本領域迫切需要建立一種新的快速繁殖牡丹的方法。
發明內容
具體而言，針對上述問題，本發明提供了一種快速繁殖牡丹的方法，該方法包括以下步驟a)取植株腋芽莖尖和嫩葉葉柄置于基本培養基中培育至形成愈傷組織并分化出芽，其中所述基本培養基中添加了一種或多種選自6-芐基氨基嘌呤、激動素、吲哚乙酸、萘乙酸、吲哚丁酸、赤霉酸、水解乳蛋白、活性炭、蔗糖的物質；b)從愈傷組織上切下叢生芽，將其轉移到加有芐基氨基嘌呤、吲哚丁酸和赤霉酸的基本培養基上培養至單芽長至3-5cm高；c)切下步驟b)中的所述單芽，用濾紙橋法將其插入含吲哚丁酸的溶液中處理18-24小時，然后再轉入加有吲哚丁酸、芐基氨基嘌呤、活性炭和蔗糖而大量元素濃度減半的MS固體培養基中，培養25-35天，形成具良好的根系的牡丹小植株；d)移栽步驟c)形成的小植株。
本文中所用的術語“腋芽、莖尖、嫩葉、葉柄”具有本領域技術人員通常所知曉的含義，因此其對于本領域技術人員而言是清楚。
術語“基本培養基”具有本領域技術人員通常所知道的含義，如MS培養基或添加了有機添加物B5的MS培養基(即MSB培養基)。
在一個較佳的實施方案中，將腋芽莖尖接種到含芐基氨基嘌呤0.5-1.5毫克/升，激動素0.1～0.5毫克/升、赤霉酸0.1-0.5毫克/升的MSB培養基中使其形成愈傷組織并分化成芽。最適宜的培養基配方為含芐基氨基嘌呤1.0毫克/升、激動素0.3毫克/升、赤霉酸0.3毫克/升的MSB培養基。如果在僅加細胞分裂素而無赤霉酸的培養基上培養，則由長大的腋芽基部葉柄內側處直接形成叢生的芽簇，最多的可分化出具20多個芽的芽叢。這種芽葉子生長較快，但莖的抽出速度卻較緩慢。
在另一實施方案中，將嫩葉葉柄置于含水解乳蛋白300-800毫克/升、芐基氨基嘌呤1.0-3.0毫克/升和萘乙酸0.1～0.5毫克/升的MSB培養基上，進行誘導愈傷組織培養。在形成愈傷組織后，將愈傷組織轉移到有芐基氨基嘌呤1.0-3.0毫克/升、吲哚乙酸0.2-0.5毫克/升的新鮮的MSB基本培養基上進行分化芽培養。最佳的是，誘導愈傷組織培養基為含水解乳蛋白500毫克/升、芐基氨基嘌呤2.0毫克/升、萘乙酸0.3毫克/升的MSB培養基。最適宜的芽分化培養基為含芐基氨基嘌呤2.0毫克/升、吲哚乙酸0.3毫克/升的MSB培養基。
在另一較佳的實施方案中，在上述步驟(b)之后、步驟(c)之前還包括一個步驟將從愈傷組織上切下的叢生芽置于培養基中培育至再次形成愈傷組織和叢生芽，并可重復該步驟以獲得大量叢生芽苗。所述培養基的配方宜為含芐基氨基嘌呤0.5-2.0毫克/升、激動素0.1-0.5毫克/升、赤霉酸0.1-0.5毫克/升的MSB培養基，更佳的為含芐基氨基嘌呤1.0毫克/升、激動素0.3毫克/升、赤霉酸0.3毫克/升的MSB培養基。
為了便于切取單芽進行根的誘導長成牡丹小植株，可把小芽叢及時轉移到附加芐基氨基嘌呤0.1-0.5毫克/升、吲哚丁酸0.1-0.5毫克/升、赤霉酸0.1-0.5毫克/升的MSB培養基(更佳為附加芐基氨基嘌呤0.2毫克/升、吲哚丁酸0.2毫克/升、赤霉酸0.2毫克/升的MSB培養基)上，再培養30-40天，使叢芽的芽長到3-4cm高。
在步驟c)中，可將切下步驟b)中的單芽先插入含吲哚丁酸30-80ppm(較佳為50ppm)的溶液中處理18-24小時，然后再轉入加有吲哚丁酸1.0-3.0毫克/升(較佳為2.0毫克/升)、芐基氨基嘌呤0.05-0.15毫克/升(較佳為0.1毫克/升)、0.4-0.6％活性炭和2-4％蔗糖而大量元素濃度減半的MS固體培養基中，培養25-35天，形成具良好的根系的牡丹小植株。在較佳的實施方案中，所述培養基中還可添加PVP等抗氧化劑以基本解決牡丹試管苗的褐變。通過使用較低的激素濃度、增加光強度和及時進行叢生芽分割，可有效地解決了牡丹試管苗的早衰、枯死及玻璃苗的技術難題。
在步驟d)中，可用常規手段對步驟c)獲得的完整小植株進行移栽。
本發明的方法應用植物細胞組織工作技術，建立了一種牡丹規模化快速繁殖方法，使之能進入工廠化生產的階段，形成年產牡丹試管苗1萬株能力的規模化生產程序。
附圖簡述
圖1顯示了從腋芽和嫩葉葉柄培育獲得可用于移栽的完整小植株的一個較佳實施流程，圖中BA表示6-芐基氨基嘌呤、KT表示激動素、IAA表示吲哚乙酸、NAA表示萘乙酸、IBA表示吲哚丁酸、GA3表示赤霉酸、LH表示水解乳蛋白。
具體實施方案下面將結合附圖和具體實施例來進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。在本申請中，除非另有所述，所有試劑的單位均用毫克/升表示。
材料和方法試驗材料牡丹(Paeonia suffruticosa)名貴品種為“青龍臥墨池”；“十八號(瑞紅)”；“姚黃”；“魏紫”；“百花妒”，常觀品種為“洛陽紅”；“胡紅”；“趙粉”；“胭脂紅”；“烏龍捧盛”共十個品種，由河南先農公司提供。
1)腋芽的培養三月上中旬取上述10個品種的植株的腋芽，從腋芽上剝取4～6mm長的莖尖，用75％酒精浸泡30秒鐘，然后在5％的次氯酸鈉溶液中浸泡8～10分鐘進行表面滅菌，再用無菌水沖洗4～5次，用無菌濾紙吸干后，將外植體接種到含芐基氨基嘌呤0.5-1.5毫克/升，激動素0.1～0.5毫克/升、赤霉酸0.1-0.5毫克/升的MSB培養基上進行培養，培養溫度為25±1℃，每天照光10小時，光強為1500～2000勒克斯。接種后2-3周，外植體先膨大并肉質化，爾后在其基部周圍逐漸愈傷組織化，經5～6周，基部形成一團略帶紫紅色的愈傷組織，并由愈傷組織分化出芽。
2)嫩葉葉柄的培養三月中下旬取上述10個品種的植株嫩葉葉柄作離體培養的材料。將嫩葉葉柄切斷成長約6～7mm長的切段，用75％酒精浸泡30秒鐘，然后在5％的次氯酸鈉溶液中浸泡8～10分鐘進行表面滅菌，再用無菌水沖洗4～5次，用無菌濾紙吸干后，將外植體放在加有水解乳蛋白500、芐基氨基嘌呤2.0和萘乙酸0.1～0.5的MSB培養基上，進行誘導愈傷組織培養。培養溫度為25±1℃，每天照光10小時，光強為1500～2000勒克斯。葉柄切段培養15-20天后，從切口處先開始形成愈傷組織。隨后形成的愈傷組織生長迅速，大約1個半月后，整個外植體都長成愈傷組織塊。將愈傷組織轉移到附加芐基氨基嘌呤2.0、吲哚乙酸0.2-0.5的新鮮的MSB基本培養基上進行分化芽培養，再經6-8周培養，10個品種的葉柄切段愈傷組織，其分化芽的頻率為40-90％左右，平均每塊愈傷組織可形成8-20個芽的芽叢。
3)叢生芽的繼代培養將愈傷組織塊上的叢生芽分割，在新鮮的MSB+芐基氨基嘌呤1.0+激動素0.3+赤霉酸0.3的培養基上培養，經1.5-2個月左右的培養，又產生愈傷組織及叢生芽，經試驗平均每隔二個月就可繼代培養產生叢生芽一次，有效芽的增殖系數可達4-6。這樣，通過一年的連續繼代分化程序培養，就可得到4千-1萬個試管芽苗。
4)叢生芽的伸長及根的誘導把小芽叢及時轉移到附加芐基氨基嘌呤0.2、吲哚丁酸0.2、赤霉酸0.2的MSB培養基上，再培養30-40天，使叢芽的芽長到3-4cm高，便于切取單芽進行根的誘導長成牡丹小植株。切取芽叢中長到3-4cm高的單芽，先使單芽基部切口處陰干收疤1個小時左右，然后用濾紙橋法將其插入含50ppm吲哚丁酸的溶液中處理18-24小時(芽基部插入溶液中的深度為2-3mm)，然后用無菌濾紙吸干，再轉入附加吲哚丁酸2.0、芐基氨基嘌呤0.1、0.5％活性炭、2％蔗糖，而大量元素濃度減半的MS固體培養基中，培養大約7-10天后在芽的基部切口處即開始形成鋸齒狀凸起，2-3星期左右由此長成白嫩粗壯的初生根。再經25-35天即可形成具良好的根系的牡丹小植株。在該試驗條件下，牡丹試管苗誘導生根率可達90-95％。
5)由腋芽、嫩葉的葉柄培養年繁殖獲得的牡丹試管苗發明人在2003-2004年期間對牡丹的10個品種繁殖的牡丹試管苗數如下表所示
6)牡丹試管小植株的移栽當牡丹試管小植株誘導出3-4條根，并長到2-3cm長時即可移栽。移栽前，將瓶塞打開加入少許無菌水淹沒固體培養基，放入陽光充足、通風處煉苗3-4天。取出小植株后，用溫水沖去瓊脂，將試管小植株直接移栽到盛沙性的中性土壤或用1/2MS大量元素濕潤的蛭石的盆中。移栽后，用透明薄膜加以覆蓋，以免過度蒸騰并保持一定濕度。一周后逐步揭開透明薄膜，二周后去掉薄膜，牡丹小植株即可成活正常生長。結果表明，牡丹試管小植株的移栽成活率達到85-90％。
綜上所述，通過三年多的培養試驗，發明人已能從牡丹的10個品種(包括5個名貴品種和5個早、中、晚花期的常規品種)的腋芽、嫩葉的葉柄培養，分別獲得叢生芽，經繼代或伸長培養，切割單芽誘導生根，基本解決了牡丹試管苗生根難的問題。根據本實施例所確定的條件，試管苗生根率可達90-95％。分割叢生芽經繼代培養和伸長培養，在2003-2004年度，發明人達到了年繁殖牡丹試管苗5500多株的水平。據統計其有效繁殖系數可達4-6，每隔2.5-3個月繼代及伸長一次，如在開始階段能提供200個以上的腋芽、嫩葉的葉柄外植體，則就能形成一套年產牡丹試管苗1萬株能力的規模化生產程序及工藝。
權利要求
1.一種快速繁殖牡丹的方法，該方法包括以下步驟a)取植株腋芽莖尖或嫩葉葉柄置于基本培養基中培育至形成愈傷組織并分化出芽，其中所述基本培養基中添加了一種或多種選自6-芐基氨基嘌呤、激動素、吲哚乙酸、萘乙酸、吲哚丁酸、赤霉酸、水解乳蛋白、活性炭、蔗糖的物質；b)從愈傷組織上切下叢生芽，將其轉移到加有芐基氨基嘌呤、吲哚丁酸和赤霉酸的基本培養基上培養至單芽長至3-5cm高；c)切下步驟b)中的所述單芽，用濾紙橋法將其插入含吲哚丁酸的溶液中處理18-24小時，然后再轉入加有吲哚丁酸、芐基氨基嘌呤、活性炭和蔗糖而大量元素濃度減半的MS固體培養基中，培養25-35天，形成具良好的根系的牡丹小植株；d)移栽步驟c)形成的小植株。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟a)中，將腋芽莖尖接種到含芐基氨基嘌呤0.5-1.5毫克/升，激動素0.1～0.5毫克/升、赤霉酸0.1-0.5毫克/升的MSB培養基中使其形成愈傷組織并分化成芽。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述培養基的配方為含芐基氨基嘌呤1.0毫克/升、激動素0.3毫克/升、赤霉酸0.3毫克/升的MSB培養基。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟a)中，將嫩葉葉柄置于含水解乳蛋白300-800毫克/升、芐基氨基嘌呤1.0-3.0毫克/升和萘乙酸0.1～0.5毫克/升的MSB培養基上，進行誘導愈傷組織培養；在形成愈傷組織后，將愈傷組織轉移到有芐基氨基嘌呤1.0-3.0毫克/升、吲哚乙酸0.2-0.5毫克/升的新鮮的MSB基本培養基上進行分化芽培養。
5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，誘導愈傷組織培養基為含水解乳蛋白500毫克/升、芐基氨基嘌呤2.0毫克/升、萘乙酸0.3毫克/升的MSB培養基；芽分化培養基為含芐基氨基嘌呤2.0毫克/升、吲哚乙酸0.3毫克/升的MSB培養基。
6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟(b)之后、步驟(c)之前還包括一個步驟將從愈傷組織上切下的叢生芽置于培養基中培育至再次形成愈傷組織和叢生芽，并可重復該步驟以獲得大量叢生芽苗，其中所述培養基為含芐基氨基嘌呤0.5-2.0毫克/升、激動素0.1-0.5毫克/升、赤霉酸0.1-0.5毫克/升的MSB培養基。
7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，所述培養基為含芐基氨基嘌呤1.0毫克/升、激動素0.3毫克/升、赤霉酸0.3毫克/升的MSB培養基。
8.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟b)中，使小芽叢轉移到附加芐基氨基嘌呤0.1-0.5毫克/升、吲哚丁酸0.1-0.5毫克/升、赤霉酸0.1-0.5毫克/升的MSB培養基上再培養30-40天，使叢芽的芽長到3-4cm高。
9.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟c)中，將切下步驟b)中的單芽先插入含吲哚丁酸30-80ppm的溶液中處理18-24小時，然后再轉入加有吲哚丁酸1.0-3.0毫克/升、芐基氨基嘌呤0.05-0.15毫克/升、0.4-0.6％活性炭和2-4％蔗糖而大量元素濃度減半的MS固體培養基中，培養25-35天，形成具良好的根系的牡丹小植株。
10.根據權利要求9所述的方法，其特征在于，所述培養基還含有抗氧化劑。
全文摘要
本發明公開了一種快速繁殖牡丹的方法，該方法包括a)取植株腋芽莖尖或嫩葉葉柄置于培養基中培育至形成愈傷組織并分化出芽，b)從愈傷組織上切下叢生芽，將其培養至單芽長至3－5cm高；c)將步驟b)的單芽插入含吲哚丁酸的溶液中，再轉入加有吲哚丁酸、芐基氨基嘌呤、活性炭和蔗糖而大量元素濃度減半的MS固體培養基中培養，形成小植株；d)移栽步驟c)形成的小植株。本發明應用植物細胞組織工作技術，建立了一種牡丹規模化快速繁殖方法，形成了年產牡丹試管苗1萬株能力的規模化生產程序。
文檔編號A01H4/00GK1768576SQ20041006776
公開日2006年5月10日 申請日期2004年11月3日 優先權日2004年11月3日
發明者衛志明 申請人:中國科學院上海生命科學研究院