專利名稱：一種日本沼蝦多倍體的誘導方法
技術領域：
本發明涉及蝦類育種技術，尤其是涉及一種日本沼蝦多倍體的誘導方法。
背景技術：
蝦類中的對蝦不抱卵，卵子受精后即分散于水中自行發育，不依賴母體。因此在蝦類中，對蝦的種間雜交率先取得突破。如中國專利971060967公開的一種“三倍體對蝦育苗方法”，該方法包括改對蝦夜間產卵為白天產卵和用6-DMAP作誘導劑誘導對蝦三倍體以及用流式細胞計檢測倍性這樣三個步驟。因此根據對蝦的不抱卵特征，用該方法可批量育出三倍體對蝦菌種。
而沼蝦類為抱卵蝦，其繁殖方式非常特殊。沼蝦類受精卵粘于母蝦腹部，整個發育過程都不能離開母體，即具有抱卵現象。長期以來，沼蝦類多倍體的誘導一直是一個未能突破的技術難題。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是針對上述現有技術現狀而提供一種用細胞松馳素B誘導日本沼蝦多倍體的方法，該方法可操作性強、誘導率高且穩定、適于三倍體沼蝦苗種的規模生產。
本發明解決上述技術問題所采用的技術方案為該方法包括(1)親蝦的培育與促產將雌雄蝦養于水溫恒定在18～22℃之間的同一網箱內，讓其自然交配產卵；(2)抱卵蝦采集與處理檢查雌蝦的抱卵情況，并將抱卵的雌蝦取出，另箱暫養，把開始產卵的時間記為受精零時；(3)用細胞松馳素B(C.B)作誘導劑進行三、四倍體誘導處理a.C.B液的配制將細胞松馳素B(C.B)溶于0.01％二甲基亞砜(DMSO)，配成濃度為1.5mg/L的C.B溶液；b.三、四倍體的誘導處理將培育好的抱卵蝦取出，迅速用紙吸干蝦身上的水份，放入已配制好的C.B溶液中進行誘導處理；處理完畢后，用池水清洗兩遍，將母蝦小心放入網箱中孵化，常規管理；當池中出現蚤狀幼體時，速將抱卵蝦移至另一池中繼續孵化，以免母蝦吞食幼體；(4)存活率統計與倍性鑒定四個步驟。
在上述(3)的三、四倍體誘導處理，水溫最好控制在18～19℃，三倍體誘導處理的起始時刻為受精后5～10分鐘，處理持續時間為20分鐘；四倍體誘導處理的起始時刻為受精后7～8小時，處理持續時間為20分鐘；亦可將水溫控制在22～23℃，而此溫度三倍體誘導處理的起始時刻為受精后5～8分鐘，處理持續時間為15～20分鐘；四倍體誘導處理的起始時刻為受精后5.5～6.5小時。
與現有技術相比，本發明的優點在于三倍體和四倍體誘導率穩定，用四倍體與二倍體雜交可產生全三倍體的日本沼蝦苗種，適用于規模化三倍體菌種的生產。
具體實施例方式
以下結合附圖
實施例對本發明作進一步詳細描述。
1、親蝦的培育與促產選擇雌蝦體長5-8cm，體重6-8g；雄蝦體長7--10cm，體重7--10g。收集的親蝦雌雄分開，暫養在置于土池中的網箱內。依水溫變化每天投喂一定量的新鮮小雜魚。待水溫穩定在18℃以上后，將親蝦轉入用于交配促產的置于室內水泥池中的網箱內，雌雄按1∶2比例并箱促產，讓其自然交配產卵。充氣增氧，每天換水1/5。全期水溫恒定在18℃-22℃之間。
2、抱卵蝦采集與處理于雌雄并箱的翌日凌晨4時起每小時檢查抱卵情況，并將抱卵蝦取出，另箱暫養待處理。把開始產卵的時間記為受精零時。
3、C.B液配制與三、四倍體誘導細胞松馳素B(C.B)為美國Sigma公司產品，現配現用。將C.B溶于0.01％二甲基亞砜(DMSO)，C.B配成濃度1.5～2.0mg/L，其中以濃度1.5mg/L為最佳。
控制水溫，將自然順產的抱卵蝦培育至預定處理時間，取出抱卵蝦，迅速用紙吸干蝦身上的水份，放入置C.B溶液的臉盆中，按設計時間處理。處理完畢后，用池水清洗兩遍，將母蝦小心放網箱中孵化，常規管理。當池中出現蚤狀幼體時，速將抱卵蝦移至另一池中繼續孵化，以免母蝦吞食幼體。
三倍體與四倍體誘導條件控制水溫 處理目的C.B濃度 處理起始時刻處理持續時間18～19℃ 三倍體誘導 1.5mg/L 受精后5-10分鐘 20分鐘四倍體誘導 1.5mg/L 受精后7～8小時 20分鐘22～23℃ 三倍體誘導 1.5mg/L 受精后5-8分鐘 15-20分鐘四倍體誘導 1.5mg/L 受精后5.5～6.5小時 15-20分鐘其中水溫最好控制在18～19℃。
4存活率統計與倍性鑒定倍性鑒定在多細胞期進行。用500μg/l秋水仙堿于20℃下培養1h，在37℃水浴鍋中用0.1M的KCl低滲溶液處理40-50min，移去低滲液，緩慢加入預冷的卡諾氏固定液，4℃下靜止1h，其間更換固定液2次。然后改用1∶1的甲醇和冰醋酸液固定。制片時，取單個胚胎置于載玻片上，滴上1-2滴50％醋酸使其軟化，并除去部分卵黃物質。日產Olympus顯微鏡下鏡檢并拍照。青蝦的2n染色體數約為104左右，一般以染色體數156左右為三倍體，208左右為四倍體。
權利要求
1.一種日本沼蝦多倍體的誘導方法，其特征在于該方法包括(1)親蝦的培育與促產將雌雄蝦養于水溫恒定在18～22℃之間的同一網箱內，讓其自然交配產卵；(2)抱卵蝦采集與處理檢查雌蝦的抱卵情況，并將抱卵的雌蝦取出，另箱暫養，把開始產卵的時間記為受精零時；(3)用細胞松馳素B(C.B)作誘導劑進行三、四倍體誘導處理a.C.B液的配制將細胞松馳素B(C.B)溶于0.01％二甲基亞砜(DMSO)，配成濃度為1.5～2.0mg/L的C.B溶液；b.三、四倍體的誘導處理將培育好的抱卵蝦取出，迅速用紙吸干蝦身上的水份，放入已配制好的C.B溶液中進行誘導處理；處理完畢后，用池水清洗兩遍，將母蝦小心放入網箱中孵化，常規管理；當池中出現蚤狀幼體時，速將抱卵蝦移至另一池中繼續孵化，以免母蝦吞食幼體；(4)存活率統計與倍性鑒定。
2.如權利要求1所述的日本沼蝦多倍體的誘導方法，其特征在于在作三、四倍體誘導處理時，水溫控制在18～19℃，三倍體誘導處理的起始時刻為受精后5～10分鐘，處理持續時間為20分鐘；四倍體誘導處理的起始時刻為受精后7～8小時，處理持續時間為20分鐘。
3.如權利要求1所述的日本沼蝦多倍體的誘導方法，其特征在于在作三、四倍體誘導處理時，水溫控制在22～23℃，三倍體誘導處理的起始時刻為受精后5～8分鐘，處理持續時間為15～20分鐘；四倍體誘導處理的起始時刻為受精后5.5～6.5小時，處理持續時間為15～20分鐘。
4.如權利要求1所述的日本沼蝦多倍體的誘導方法，其特征在于所述的倍性鑒定在多細胞期進行。
全文摘要
一種用細胞松弛素B誘導日本沼蝦三倍體和四倍體的方法。將受精卵與母體一起孵育，用細胞松弛素B處理，保持一定藥物濃度，掌握起始時間和持續處理時間，通過抑制第二極體的排放和受精卵的第一次卵裂，分別獲得三部體和四倍體幼體。本發明方法可操作性強、誘導率高且穩定、用四倍體與二倍體雜交可產生全三倍體的日本沼蝦苗種，適用于規模化三倍體苗種的生產。
文檔編號A01K61/00GK1600089SQ20041006744
公開日2005年3月30日 申請日期2004年10月22日 優先權日2004年10月22日
發明者錢國英 申請人:錢國英