專利名稱：一種用于微生物肥料的芽孢桿菌液的同步發酵方法
技術領域：
本發明涉及一種用于微生物肥料的芽孢桿菌液的同步發酵方法。
背景技術：
肥料是重要的農業生產資料，微生物肥料的應用，不僅可以保證農產品的產量，而且可以顯著提高產品的品質、減少環境污染、培肥地力、改良土壤，防治土壤病蟲害，是農業可持續發展及生產綠色食品的新型肥料。目前已在我國大力推廣，并展現出美好的應用前景。為此，中華人民共和國農業部已制定頒發了“微生物肥料行業標準NY-227-94”，等微生物肥料系列標準，并明確規定了作為肥料的有效微生物種類及其質量標準。而其中有效微生物的活菌數量乃是產品的質量核心。
為了保證產品能夠達到標準所要求的微生物數量，目前很多微生物肥料的生產都選用了易于培養、生長快、菌體形成數量多的有效微生物進行生產。但是大多數微生物極易受到環境的影響，而很快喪失生活能力，失去商品價值。現有的研究表明，一類細菌，在特定條件下可以形成一種具有休眠特性的“芽孢”，它們可以耐受一定的高溫和干燥，存活時間長且性狀穩定，此種有效的菌種更適宜作為微生物肥料進行生產。這類細菌一般在固體培養基上容易形成“芽孢”，但在液體深層培養條件下，則較難形成芽孢，只有在滿足其特定條件后，才能形成或最大量形成。
目前，微生物肥料芽孢桿菌液的生產，大多采用微生物發酵的常規方法進行接種培養，即在發酵培養基滅菌后，待降溫至所需的培養溫度(35～26℃)時，再將種子液接入罐內按正常條件進行培養。由于種子液內除了部分為芽孢外，仍有一定數量的營養體，因此，未經加熱而一同接入罐內會造成生長起點不一，菌體生長快慢參差不齊，幾代同堂，給生產控制帶來困難。即使延長生產周期6個小時，芽孢形成率也僅80％左右。
發明內容
本發明的目的在于克服現有的微生物發酵方法接種的種子液易造成生長起點不一，菌體生長快慢參差不齊，幾代同堂，給生產控制帶來困難，且芽孢形成率低的缺陷，從而提供一種可在大規模的液體發酵條件下，使之同步形成芽孢，并能提高芽孢形成的數量和比例，縮短生產周期的用于微生物肥料的芽孢桿菌液的同步發酵方法。
本發明的目的是通過如下的技術方案實現的本發明提供一種用于微生物肥料的芽孢桿菌液的同步發酵方法，包括如下步驟1)將芽孢桿菌的培養基液加入發酵罐內，于121～126℃、0.11～0.13MPa下滅菌25～35分鐘(優選30分鐘)；然后降溫至80～95℃，同時將罐內壓力降至常壓；2)在火圈火焰滅菌的狀態下，開啟發酵罐罐體的接種蓋，將純種芽孢菌液作為種子接入發酵罐內，并隨即關閉接種蓋，使發酵罐罐體呈密閉狀態；3)在罐溫80～95℃(優選85～90℃)和常壓條件下，將發酵罐內混合物攪拌10～20分鐘，對芽孢桿菌種子進行高溫處理；然后采用夾套循環水冷卻，20分鐘內降溫至26～35℃，按照常規發酵條件進行芽孢桿菌的發酵培養。
所述的芽孢桿菌包括巨大芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、膠質芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌側孢芽孢桿菌、解幾丁質芽孢桿菌、固N芽孢桿菌等微生物肥料生產用芽孢桿菌。
本發明的方法已經在巨大芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、膠質芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、側孢芽孢桿菌、固N芽孢桿菌、解幾丁質芽孢桿菌等有肥料功能的芽孢桿菌的液體發酵生產中應用。可分別使成熟芽孢的同步形成率達到90～99％，一般可縮短發酵周期6個小時左右。
本發明提供的發酵方法是在發酵罐生產過程中，將菌種的芽孢種子液，在種子罐上直接進行高溫接種和高溫處理。與現有技術通常應用的適溫接種相比較，其優點在于1.本方法不僅有助于打破種子(有效菌芽孢)的休眠，促進芽孢的萌發，也可以殺死非芽孢狀態的菌體，如種子液中的營養體細胞。使接種的種子處在同一生理狀態，從同一起跑線出發，以便在適宜的條件下同步生長，同步增殖，同步形成新一代的芽孢，提高了成熟芽孢形成的速率、比例和整齊度。避免因為種子本身的生理和發育階段的差異而引至發酵過程中的菌體生長快慢不一。因而有利于生產控制，對縮短生產周期、降低生產成本、穩定和提高產品質量，效果顯著。
2、通過高溫接種可以殺死種子液中可能攜帶的噬菌體和其他非芽孢狀態的雜菌，有利于保證種子液的純度。
3.采用高溫接種，當打開接種罐蓋接種時，罐內蒸汽外逸形成罐內正壓，減少了空氣中雜菌進入罐內的可能性，降低了因接種操作帶來污染的機率。
4.該方法簡便易行，適用于目前微生物肥料生產中芽孢桿菌制品的生產。
具體實施例方式
試驗裝置本發明的實驗是在帶有攪拌器的外置換熱夾套的發酵罐中進行的，還包括機械攪拌、進氣管、排氣管、取樣管、移種管、放料管、溫度指示、罐壓表、空氣流量表、投料口、接種口、外置換熱夾套等裝置。
測試方法當正常發酵10小時后，每4小時，取樣一次，進行發酵液中微生物的形態變化和數量觀察；具體方法按照《微生物肥料行業標準NY-227-94》的方法，進行取樣、制片和顯微鏡觀察，以確定菌體的生長狀態，統計芽孢形成的比例，直至發酵液中的芽孢形成速率相對穩定時，結束培養。然后再按照規定的平板活菌計數法，對發酵液進行稀釋、塗皿培養，根據長出的菌落數(包括由芽孢萌發形成的菌落和尚未形成芽孢的營養體形成的菌落)進行計算，而確定活菌總數；同時將稀釋塗皿的稀釋液，經80℃水浴中加熱處理10分鐘，進行塗皿、培養和菌落計數(芽孢形成的菌落數)，則可取得發酵液中芽孢的數量，與前者檢測的活菌總數之差，則為芽孢同步形成的比例。
實施例1將巨大芽孢桿菌的培養基液(按重量百分比計，淀粉3％，豆餅粉1％，玉米漿0.1％，K2HPO40.5％，(NH4)2SO40.2％，CaCO30.5％，pH7.2-7.5)300公斤加入帶有攪拌器的外置換熱夾套的發酵罐，升溫至121℃、壓力達0.11MPa，保溫保壓30分鐘進行滅菌。然后緩慢降溫至90℃，同時將罐內壓力降至常壓，在發酵車間的正常工作狀態下，在罐體接種口周圍，點燃火圈，在火焰的保護下打開發酵罐罐體的接種蓋，迅速將純種巨大芽孢桿菌液種子加入發酵罐內，并隨即關閉接種蓋，使罐體呈密閉狀態。打開攪拌，在罐溫90℃和常壓條件下保持15分鐘，進行巨大芽孢桿菌種子的高溫處理。然后，迅速將罐溫降至30℃，按照該菌的發酵條件進行培養(培養溫度30±1℃，罐壓0.05MPa，攪拌轉速每分鐘280轉，通氣量1∶1體積/體積/分)。用本試驗規定的測試方法測得芽孢同步形成率92％，總用時28小時。
對比例1將巨大芽孢桿菌采用與實例1同樣的培養基及滅菌方法，在發酵培養基滅菌后，待降溫至所需的培養溫度30℃時，再將種子液接入罐內，不需要90℃高溫處理，按照相同發酵條件進行培養。用本試驗規定的測試方法測得芽孢同步形成率75％，總用時35小時。
實施例2將地衣芽孢桿菌的培養基液(按重量百分比計，淀粉0.5％，K2HPO40.2％，(NH4)2SO40.1％，MgSo40.05％，酵母膏0.1％，CaCO30.1％，pH7.0-7.3)300公斤加入帶有攪拌器的外置換熱夾套的發酵罐，升溫至121℃、壓力達0.11MPa，保溫保壓35分鐘進行滅菌。然后緩慢降溫至90℃，同時將罐內壓力降至常壓，在發酵車間的正常工作狀態下，在罐體接種口周圍，點燃火圈，在火焰的保護下打開發酵罐罐體的接種蓋，迅速將純種地衣芽孢桿菌液種子加入發酵罐內，并隨即關閉接種蓋，使罐體呈密閉狀態。打開攪拌，在罐溫85℃和常壓條件下保持20分鐘，進行地衣芽孢桿菌種子的高溫處理。然后，迅速將罐溫降至32℃，按照該菌的發酵條件(培養溫度32±1℃，罐壓0.06MPa，攪拌轉速每分鐘200轉，通氣量1∶0.5體積/體積/分)進行培養。用本試驗規定的測試方法測得芽孢同步形成率94％，總用時32小時。
對比例2將地衣芽孢桿菌采用與實施例2相同的培養基和滅菌方法，當培養基滅菌后結束，降溫至32℃時，將種子液接入罐內，不經過85℃，20分鐘的高溫處理，按相同條件進行培養。用本試驗規定的測試方法測得芽孢同步形成率76％，總用時38小時。
實施例3將側孢芽孢桿菌的培養基液(按重量百分比計，蛋白胨0.5％，豆餅粉0.2％，酵母粉0.2％，淀粉1％，蔗糖0.5％，K2HPO40.2％，MgSo40.05％，CaCO30.01％，pH7.0-7.5)300公斤加入帶有攪拌器的外置換熱夾套的發酵罐，升溫至121℃、壓力達0.11MPa，保溫保壓35分鐘進行滅菌。然后緩慢降溫至88℃，同時將罐內壓力降至常壓，在發酵車間的正常工作狀態下，在罐體接種口周圍，點燃火圈，在火焰的保護下打開發酵罐罐體的接種蓋，迅速將純種側孢芽孢桿菌液種子加入發酵罐內，并隨即關閉接種蓋，使罐體呈密閉狀態。打開攪拌，在罐溫88℃和常壓條件下保持13分鐘，進行側孢芽孢桿菌種子的高溫處理。然后，迅速將罐溫降至30℃，按照該菌的發酵條件(培養溫度30±1℃，罐壓0.05MPa，攪拌轉速每分鐘180轉，通氣量1∶0.7體積/體積/分)進行培養。用本試驗規定的測試方法測得芽孢同步形成率92％，總用時28小時。
對比例3將側孢芽孢桿菌采用與實施例3完全相同的培養基及滅菌條件，在培養基滅菌后，降溫至所需的培養溫度30℃時，再將種子液接入罐內按該菌的正常條件進行培養。用本試驗規定的測試方法測得芽孢同步形成率81％，總用時34小時。
實施例4將枯草芽孢桿菌的培養基液(按重量百分比計，淀粉1.5％，玉米漿0.1％，K2HPO40.5％，(NH4)2SO40.1％，CaCO30.25％，pH7.3-7.5)300公斤加入帶有攪拌器的外置換熱夾套的發酵罐，升溫至121℃、壓力達0.11MPa，保溫保壓30分鐘進行滅菌。然后降溫至95℃，同時將罐內壓力降至常壓，在發酵車間的正常工作狀態下，在罐體接種口周圍，點燃火圈，在火焰的保護下打開發酵罐罐體的接種蓋，迅速將純種枯草芽孢桿菌液種子加入發酵罐內，并隨即關閉接種蓋，使罐體呈密閉狀態。打開攪拌，在罐溫95℃和常壓條件下保持10分鐘，進行枯草芽孢桿菌種子的高溫處理。然后，迅速將罐溫降至35℃，按照該菌的酵條件(罐溫35℃，罐壓0.05MPa，轉速每分鐘160轉，通氣量1∶0.8體積/體積/分)進行培養。用本試驗規定的測試方法測得芽孢同步形成率90％，總用時30小時。
對比例4將枯草芽孢桿菌采用與實施例4相同的培養基和滅菌條件，在培養基滅菌后，待降溫至35℃時，再將種子液接入罐內按相同條件進行培養。用本試驗規定的測試方法測得芽孢同步形成率72％，總用時36小時。
實施例5將膠質芽孢桿菌的培養基液(按重量百分比計，葡萄糖0.7％，酵母粉0.5％，花生餅粉0.2％，(NH4)2SO40.2％，MgSO40.1％，pH7.5-7.8)300公斤加入帶有攪拌器的外置換熱夾套的發酵罐，升溫至121℃、壓力達0.11MPa，保溫保壓30分鐘進行滅菌。然后緩慢降溫至88℃，同時將罐內壓力降至常壓，在發酵車間的正常工作狀態下，在罐體接種口周圍，點燃火圈，在火焰的保護下打開發酵罐罐體的接種蓋，迅速將純種膠質芽孢桿菌液種子加入發酵罐內，并隨即關閉接種蓋，使罐體呈密閉狀態。打開攪拌，在罐溫80℃和常壓條件下保持15分鐘，進行膠質芽孢桿菌種子的高溫處理。然后，迅速將罐溫降至28℃，按照常規發酵條件進行培養。用本試驗規定的測試方法測得芽孢同步形成率99％，總用時32小時。
對比例5將膠質芽孢桿菌采與實施例5相同的培養基及滅菌條件，在發酵培養基滅菌后，降溫至28℃時，再將種子液接入罐內按相同條件進行培養。用本試驗規定的測試方法測得芽孢同步形成率72％，總用時36小時。
附表使用本發明的方法和常規方法進行芽孢桿菌的發酵培養的比較
由上表的數據可以看出，使用本發明的方法與常規方法進行芽孢桿菌的發酵相比，(1)本發明的在發酵罐上直接高溫接種處理方法簡便易行；(2)通過高溫處理，可以促進種子液中的芽孢萌發，殺死未形成芽孢的營養體，使接種的種子處在同一生理狀態，從同一起跑線出發，同步生長、增殖，提高芽孢的同步形成率14-19％；同時縮短發酵周期6個小時左右；降低了生產成本，提高和穩定了產品質量。(3)通過高溫處理，還可以直接殺死混入種子液中的其它雜菌的營養體細胞，及可能摻帶的噬菌體，降低了因為種子液純度不夠或接種操作而帶來的染菌機率，提高了生產的成功率，保證了生產的穩定性。
權利要求
1.一種用于微生物肥料的芽孢桿菌液的同步發酵方法，包括如下步驟1)將芽孢桿菌的培養基液加入發酵罐內，于121～126℃、0.11～0.13MPa下滅菌25～35分鐘；然后降溫至80～95℃，同時將罐內壓力降至常壓；2)在火圈火焰滅菌的狀態下，開啟發酵罐罐體的接種蓋，將純種芽孢菌液作為種子接入發酵罐內，并隨即關閉接種蓋，使發酵罐罐體呈密閉狀態；3)在80～95℃和常壓條件下，將發酵罐內混合物攪拌10～20分鐘，對芽孢桿菌種子進行高溫處理；然后采用夾套循環水冷卻，20分鐘內降溫至26～35℃，按照常規發酵條件進行芽孢桿菌的發酵培養。
2.如權利要求1所述的用于微生物肥料的芽孢桿菌液的同步發酵方法，其特征在于所述步驟1)中的滅菌時間為30分鐘。
3.如權利要求1所述的用于微生物肥料的芽孢桿菌液的同步發酵方法，其特征在于所述步驟2)中對芽孢桿菌種子進行高溫處理的溫度為85～90℃，時間為10-20分鐘。
4.如權利要求1所述的用于微生物肥料的芽孢桿菌液的同步發酵方法，其特征在于所述的芽孢桿菌為巨大芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、膠質芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌側孢芽孢桿菌、解幾丁質芽孢桿菌、或固N芽孢桿菌。
全文摘要
本發明涉及一種用于微生物肥料的芽孢桿菌液的同步發酵方法，其為在發酵罐生產過程中，將菌種的芽孢種子液，在種子罐上直接進行高溫接種和高溫處理。本發明的方法可分別使成熟芽孢的同步形成率達到90～99％，一般可縮短發酵周期6個小時左右。該方法克服了現有的微生物發酵方法接種的種子液易造成生長起點不一，菌體生長快慢參差不齊，幾代同堂，給生產控制帶來困難，且芽孢形成率低的缺陷，并可在大規模的液體發酵條件下，使之同步形成芽孢，并能提高芽孢形成的數量和比例，縮短生產周期的同步發酵方法。
文檔編號C05F11/08GK1970736SQ200510126210
公開日2007年5月30日 申請日期2005年11月25日 優先權日2005年11月25日
發明者高昭遠 申請人:北京丹路實業公司