專利名稱：用于制備d－泛酸鈣的方法
技術領域：
本發明涉及一種用于制備D-泛酸鈣的過程，并且涉及基于此的組合物，所述組合物適合用作為動物飼料補充劑。
D-泛酸鈣是D-泛酸在商業上最為重要的產品形式。較之泛酸自身和單價D-泛酸鹽，D-泛酸鈣具有穩定性更高和更不易吸濕的優點。D-泛酸或維生素B5是維生素B復合物的成員，其是哺乳動物(包括牲畜和人類)天然所需的。細胞中，泛酸主要用于對輔酶A(CoA)和酰基載體蛋白(ACP)的生物合成。這些輔酶對于所有細胞來說都是重要的，它們參與細胞代謝中超過100種不同的中間反應。
2001年生產了大約6000噸D-泛酸及其鹽，其中大約80％被用作為動物飼料添加劑。其還用于制藥、健康護理和食物產品。從D-泛酸內酯和β-丙氨酸鹽/酯對D-泛酸鹽(僅D-對映異構體是具有生物學活性的)的傳統化學合成需要對外消旋中間產物進行光學拆分的步驟，以獲得想要的D-對映異構體，因此傳統化學合成被相對高的生產成本所阻礙。
為克服此缺陷，以及為了改進對D-泛酸鹽的生產，近年來直接微生物合成(例如，從葡萄糖到泛酸鹽)方法已成為研究主題，也已得到了發展。
同時，用于對D-泛酸鹽(即，D-泛酸及其鹽)進行微生物制備的若干種發酵方法已被描述并已知，例如，見EP 0 590 857、WO 96/33283、WO97/10340、EP 1 001 027、EP 1 006 192、EP 1 006 193、WO 01/21772以及其它文獻。這些方法中的一些使用以高度復雜的手段進行過轉化和遺傳操縱的微生物，以在發酵培養液中獲得高產量的D-泛酸鹽。
另一方面，通過微生物生產的D-泛酸鹽必須被分離、純化，并且必須被轉化為想要的產品形式，即，D-泛酸鈣。因此，已經開發并公開了大量的下游工藝，包括下述工藝步驟，例如，過濾、結晶、使用離子選擇性膜、木炭吸附、陽離子交換、陰離子交換以及隨后的中和及濃縮或干燥，直到制成配方。
WO 02/066665描述了一種方法，用于制備D-泛酸和/或其鹽，這是通過一種轉化體微生物來進行的，所述微生物具有被負調(deregulate)的泛酸(pan)和/或異亮氨酸/纈氨酸(ilv)生物合成，其中，來自發酵培養液的泛酸被陰離子交換樹脂固定，用氫氯酸的水溶液洗脫，通過加入鈣堿和/或鎂堿，將洗出液中獲得的游離泛酸轉化為鈣鹽和/或鎂鹽。由此獲得的產品尤其可用作為動物飼料補充劑。
本發明的方法提供了一種下游工藝，其在對D-泛酸和/或其鹽的微生物生產之后進行，其使用陰離子交換樹脂，但是，在不同于WO02/066665所述的條件下進行。該下游工藝提供了更高純度的、飼料級的D-泛酸鈣材料，并且/或者較之目前已知的其它下游工藝更為經濟。
更詳細地，本發明涉及一種制備D-泛酸鈣的方法，所述方法包括從生產泛酸的微生物的發酵培養液中分離和純化D-泛酸鈣，所述方法的特征在于下述步驟(a)用弱有機酸的水溶液從強堿性陰離子交換樹脂洗脫D-泛酸，(b)通過加入堿性鈣鹽來中和洗出液，以及(c)將溶液轉化為能被用作為動物飼料補充劑的自由流動的產品。
本發明還涉及適合用作為動物飼料補充劑的組合物，所述組合物基于可通過上述方法獲得的D-泛酸鈣。
雖然本發明的關鍵步驟是用弱有機酸的水溶液從強堿性陰離子交換樹脂上洗脫D-泛酸，但是，在特定的實施方式中，所述方法可以額外包含通常用于此類下游工藝中的步驟，其中，例如，在陰離子交換步驟之前，將全部或僅一些生物質從發酵培養液中除去，在中和之前對洗出液加以濃縮，或者在所述方法的任何階段進行脫色，以及最后的配方。
如WO 02/066665所述，用強無機酸，例如氫氯酸，從陰離子交換樹脂上洗脫D-泛酸時，與樹脂結合的其它所有陰離子也會被洗脫下來，而本發明的方法則提供了一種對D-泛酸更具選擇性的洗脫，因為使用了較弱的有機酸，例如，羧酸，優選地，乙酸。用水以1-99％(w/w)的濃度對有機酸進行或多或少的稀釋，優選地，5-50％，更優選地，8-30％，以及最優選地，10-20％。盡管使用較弱的酸，從強堿性陰離子交換樹脂除去D-泛酸鹽是定量的。較之經過稀釋的氫氯酸(大約5％)，同樣體積的經過稀釋的乙酸足以完成對D-泛酸的洗脫。
因此，較之使用強無機酸的洗脫，本發明的方法包括若干好處。使用較弱的有機酸使得可以更具選擇性地從樹脂上除去D-泛酸。與氫氯酸相反，乙酸的應用避免了大量的洗脫無機陰離子，例如，硫酸鹽或磷酸鹽。因此，采用本發明的新技術，最終產物中這些陰離子的含量被降低至＜2％的水平，優選地，＜1％，更優選地，＜0.5％，以及最優選地，＜0.1％。此外，使用本項新發明，能獲得具有極端最小化的氯含量的產品。與通過用氫氯酸洗脫獲得的高氯含量的產品相反，通過應用有機羧酸，氯含量可被降低至＜2％，優選地，＜1％，更優選地，＜0.5％，以及最優選地，＜0.1％。從技術的角度來看，乙酸的最大好處是較之氫氯酸其具有較低的腐蝕性。所以，下游方案的成本將被顯著降低，因為更為便宜、穩定性更差一些的材料就足以構建車間。
本發明的另一好處產生自本發明方法的步驟(b)，對洗出液的中和。在該步驟中，含有D-泛酸的洗出液被堿性鈣鹽(尤其是氫氧化鈣或碳酸鈣)中和至4-10的pH，優選地，5-9，更優選地，6-8，以及最優選地，6.5-7.5。這兩種鹽是優選的，因為在步驟中不會有其它陰離子的副產物。用具有除鈣之外的其它陽離子的堿性鹽進行中和將不會直接得到優選的D-泛酸鈣。該堿性鈣鹽作為固體加入，或者更有利地，作為堿性鈣鹽含量為2-50％的水性懸浮液加入，更優選地，為15-45％，以及最優選地，為20-40％。懸浮液的加入使得在該步驟中能對pH更好地控制。如上所述，用氫氯酸進行洗脫不能將D-泛酸鹽與無機陰離子(例如硫酸鹽或磷酸鹽)分開。因為這些陰離子很難形成可溶鈣鹽，在中和步驟中將獲得懸浮液。相反，本發明在向洗出液中加入氫氧化鈣之后將提供清澈的溶液。因此，可將經過中和的溶液直接用于干燥或配方步驟，而無需任何額外的過濾步驟。
獲得含有D-泛酸鹽的培養液的發酵方法可根據本領域任何已知方法來進行。因此，該方法可以以分批、補料分批、重復補料分批或連續方法來進行，其中使用公知的培養基，所述培養基包含碳源、氮源和無機陰離子，例如氯化物、硫酸鹽或磷酸鹽。為中和發酵培養基中的D-泛酸，使用公知的緩沖系統，例如，帶NaOH、KOH或NH4OH的磷酸緩沖液。
所有生產D-泛酸鹽的微生物都可以使用，包括真菌、酵母和細菌，例如，由Saccharomyces、Corynebacterium、Escherichia和Bacillus所代表的，以及在上文提到的參考文獻，例如WO 02/066665，中更為詳細地描述過的。優選的微生物是那些以能過量生產D-泛酸鹽的方式被轉化過或其途徑被基因操縱(負調)過的。如何進行上述操作的若干種方法都是公知的，其通過增強D-泛酸鹽途徑中基因的表達和/或遏制副途經中涉及的基因的表達來進行。
取決于所用的微生物和發酵條件，發酵培養液將含有濃度為至少25g/L的D-泛酸鹽，優選地，至少50g/L，更優選地，至少80g/L，以及最優選地，至少100g/L。
所有已知的、商業上可獲得的強堿性陰離子交換樹脂都可用于本發明的方法。這包括所有強堿性的樹脂(例如，具有作為功能基團的季銨殘基的那些)，例如，分別來自下述公司Bayer、Rohm & Haas、DowChemicals和Mitsubishi Chemicals Corp的Lewaitits、Amberlites、Duolite、Dowex和Diaion樹脂。陰離子交換樹脂與D-泛酸鹽和其它陰離子結合，而所有其它組分，例如陽離子和中性化合物，能經過并被棄去。用水洗之后，然后用弱有機酸的水溶液對D-泛酸鹽進行選擇性洗脫，優選地，使用優選濃度為10-20％的乙酸。
然后通過加入氫氧化鈣或碳酸鈣將洗出液調節至4-10的pH，優選地，5-9，更優選地，6-8，以及最優選地，6.5-7.5。根據本發明，將2-55％(w/w)的(優選地，10-50％，以及更優選地，20-40％的)氫氧化鈣水溶液或懸浮液或2-65％(w/w)(優選地，10-50％，最優選地，20-40％)的碳酸鈣水溶液或懸浮液加入到洗出液中。
根據本發明的步驟(c)，來自陰離子交換樹脂的被中和的洗出液被轉化為能自由流動的產品，其能根據本領域已知的方法直接被用作為動物飼料補充劑，例如，通過使用本領域公知的方法在有或沒有預先濃縮的情況下干燥，以及，如果需要的話，進行配方(見，例如Ullmann’sEncyclopedia of Industrial Chemistry，6th edition，1999)，優選地，通過噴霧干燥或噴霧造粒來進行。干燥步驟之后，獲得微黃色的產品，其泛酸鹽含量＞20％，優選＞40％，更優選大于65％，以及最優選＞90％，其中相對單價陽離子鈣含量為＞90％，優選＞92％，更優選＞96％，最優選＞99％。在該產品中，無機陰離子，例如氯化物、硫酸鹽、磷酸鹽的含量被最小化至＜2％優選＜1％，更優選＜0.5％，最優選＜0.1％。
如果需要的話，在步驟(a)之前、步驟(a)-(c)之間或者甚至步驟(c)之后，本發明的方法可被一個或數個額外的傳統工藝步驟所改變。因此，工藝步驟(a)-(c)的溶液、懸浮液或產品可被滅菌，例如，通過加熱、過濾或輻射來進行。
如果洗出液中存在大含量的乙酸，可以在洗脫步驟(a)之后立即將其除去，這可以通過在適當的溫度和低壓下進行蒸餾來實現。因為乙酸較之強礦物質酸的低腐蝕性，并不需要特殊的設備，可以使用廉價材料用于蒸餾設備。還可以用本領域技術人員已知的若干種柱的特殊設置來使洗出液中的乙酸最小化，使得洗出液中乙酸水平＜2％，優選＜1％，更優選＜0.5％，最優選＜0.1％。
在發酵培養液被送上陰離子交換樹脂以前，適合地，對生物質加以裂解和/或殺死和/或或多或少將其自培養液中分離。這可以通過本領域已知的方法來實現。尤其是如果想要具有高含量D-泛酸鹽的產品時，通過例如傾析、過濾以及離心的方法來進行生物質的分離，如果需要的話，之前加入商業上可獲得的凝聚劑。如果不需要分離生物質或者僅需要部分分離生物質的話，有利地，使帶有生物質的培養液從底部到頂部經過陰離子交換柱，即，以反重力方向進行。
最后，對本發明方法的另一改良可以包括如果想要較少顏色的產品，尤其是白色產品的時候，對溶液之一進行木炭處理。該木炭處理優選在發酵之后進行，更優選在從發酵培養基中移除生物質之后。最優選的是在中和步驟(b)之后進行的木炭處理。對該操作而言，可以使用可通過商業途經獲得的所有粉末或顆粒狀木炭產品。
下述實施例將對本發明進行更為詳細地闡述。
實施例1 對B.subtilis的發酵發酵在攪拌和通氣下的2000L引導發酵罐(pilot fermenter)中進行。
初始發酵培養基在發酵罐中于121℃被滅菌30分鐘，其組成如表1所示。
表1初始發酵培養基的組成滅菌之后，對表2所示的成分單獨高壓滅菌，并在無菌條件下將其加入到發酵罐中。
表2對初始培養基滅菌之后加入的組分用25L光密度(OD)為10.7的能過量生產泛酸鹽的B.subtilis菌株去接種500L培養基，所述菌株中，使用SP01噬菌體啟動子使panBCD操縱子和panE基因過量表達(例如WO 01/21772中所述)。發酵溫度為39℃，使用的氣流為700L/分鐘。通過加入氣態氨保持pH 6.85。通過攪拌器速率控制，將溶解氧濃度(DO)保持為高于15％。通過加入消泡劑Clerol FBA 5057來防止泡沫形成。
發酵作為葡萄糖受限的補料分批發酵進行。在43小時的時間段，將182L補料溶液(表3)加入到發酵罐中。
表3補料溶液的組成48小時的發酵之后，在70℃對培養液進行30分鐘的巴氏滅菌。經過巴氏滅菌的發酵培養液中泛酸鹽的濃度為32g/L。
實施例2 Amberlite IRA 900；用10％乙酸進行洗脫將758mL根據實施例1獲得的經過巴氏滅菌和超濾的生物培養液上樣到強堿性陰離子交換樹脂Amberlite IRA 900(600mL)上。流速被調節為1L/h。使用相同流速，用1168mL去礦物質水來洗柱子。然后以1L/h的流速使用2000mL乙酸(10％)來洗脫泛酸鹽。收集到1898mL洗出液。用去礦物質水(975mL)、4％NaOH水溶液(1639mL)以及接著使用去礦物質水(1000mL)使柱子再生。
在旋轉式蒸發器上，以減壓條件和50-70℃之間的溫度來濃縮洗出液。
用水(1∶1)來稀釋濃縮的粗產品，然后加入5.22g Ca(OH)(作為5％的水懸浮液)，將pH值調節至7。在旋轉式蒸發器上對溶液進行濃縮和干燥。得到53.60g自由流動的黃色產品，其由37.1％(w/w)D-泛酸鹽、＜0.1％氯化物、＜0.1％硫酸鹽以及小于0.01％磷酸鹽構成。陽離子包括13.6％的鈣(探測到的所有陽離子中的97％)、0.2％的鈉、＜0.1％的銨、＜0.1％的鉀以及＜0.1％的鎂。
實施例3 Amberlite IRA 958；用10％乙酸進行洗脫將1068mL根據實施例1獲得的經過巴氏滅菌和超濾的生物培養液上樣到強堿性陰離子交換樹脂Amberlite IRA 958(600mL)上。流速被調節為1L/h。使用相同流速，用617mL去礦物質水來洗柱子。然后以1L/h的流速使用1079mL乙酸(10％)來洗脫泛酸鹽。收集到1179mL洗出液。用去礦物質水(711mL)、4％NaOH水溶液(747mL)以及接著使用去礦物質水(1000mL)使柱子再生。
洗出液被分為兩部分，第一部分601g，第二部分567g。
在旋轉式蒸發器上，以減壓條件和50-70℃之間的溫度來濃縮部分1。用水(1∶1)來稀釋濃縮的粗產品，然后加入8g Ca(OH)2(作為25％的水懸浮液)，將pH值調節至7。在旋轉式蒸發器上對溶液進行濃縮和干燥。得到36.0g自由流動的黃色產品，其由42.8％(w/w)D-泛酸鹽、＜0.1％氯化物、＜0.5％硫酸鹽以及小于0.01％磷酸鹽構成。陽離子包括11.2％的鈣(探測到的所有陽離子中的97％)、0.2％的鈉、＜0.1％的銨、＜0.1％的鉀以及＜0.1％的鎂。
部分2被直接用于中和步驟。加入21.7g Ca(OH)2(作為25％的水懸浮液)，將pH值調節至7。在旋轉式蒸發器上對溶液進行濃縮和干燥。得到61.1g自由流動的黃色產品，其由23.3％(w/w)D-泛酸鹽、＜0.1％氯化物、0.67％硫酸鹽以及小于0.01％磷酸鹽構成。陽離子包括17.2％的鈣(探測到的所有陽離子中的97％)、0.2％的鈉、＜0.1％的銨、＜0.1％的鉀以及＜0.1％的鎂。
實施例4 Amberlite IRA 958；用20％乙酸進行洗脫將1453mL根據實施例1獲得的經過巴氏滅菌和超濾的生物培養液上樣到強堿性陰離子交換樹脂Amberlite IRA 958(600mL)上。流速被調節為1L/h。使用相同流速，用606mL去礦物質水來洗柱子。然后以1L/h的流速使用1000mL乙酸(20％)來洗脫泛酸鹽。收集到781mL洗出液。用去礦物質水(773mL)、4％NaOH水溶液(1200mL)以及接著使用去礦物質水(1000mL)使柱子再生。
在旋轉式蒸發器上，以減壓條件和50-70℃之間的溫度來濃縮洗出液。
用水(1∶1)來稀釋濃縮的粗產品，然后加入9.53g Ca(OH)2(作為25％的水懸浮液)，將pH值調節至7。在旋轉式蒸發器上對溶液進行濃縮和干燥。得到52.40g自由流動的黃色產品，其由40.8％(w/w)D-泛酸鹽、＜0.1％氯化物、0.15％硫酸鹽以及小于0.01％磷酸鹽構成。陽離子包括9.3％的鈣(探測到的所有陽離子中的91％)、0.1％的鈉、0.6％的銨、＜0.1％的鉀以及＜0.1％的鎂。
權利要求
1.一種制備D-泛酸鈣的方法，所述方法包括從生產泛酸的微生物的發酵培養液中分離和純化D-泛酸鈣，所述方法的特征在于下述步驟(a)用弱有機酸的水溶液從強堿性陰離子交換樹脂洗脫D-泛酸，(b)通過加入堿性鈣鹽來中和洗出液，以及(c)將溶液轉化為能被用作為動物飼料補充劑的自由流動的產品。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，用乙酸水溶液從所述陰離子交換樹脂進行洗脫。
3.如權利要求1或2所述的方法，其特征在于，對來自所述陰離子交換樹脂的所述洗出液的中和是用氫氧化鈣或碳酸鈣來進行的。
4.適合用作為動物飼料補充劑的組合物，其基于D-泛酸鈣，其特征在于，其可以通過如權利要求1至3中任意一項所述的方法獲得。
全文摘要
本發明涉及一種改進的用于從發酵培養液制備D－泛酸鈣的方法，所述方法包括用弱有機酸從強堿性陰離子交換樹脂上洗脫D－泛酸，以及用堿性鈣鹽來中和洗出液。
文檔編號A23K1/16GK1946851SQ200580012877
公開日2007年4月11日 申請日期2005年4月18日 優先權日2004年4月26日
發明者弗蘭克·艾瑟利 申請人:帝斯曼知識產權資產管理有限公司