定量側向流系統和測定的制作方法

專利名稱：定量側向流系統和測定的制作方法
技術領域：
本申請一般涉及定性和定量測定及系統，該定性和定量測定及系統用于檢測生物樣本中，尤其是包含全血、紅細胞、白細胞、或其它細胞類型的樣本中至少一種分析物的存在，并測定或定量該至少一種存在的分析物的數量。
背景技術：
很多人嘗試設計用于檢測例如包含全血、紅細胞、白細胞的血液樣本的生物樣本中分析物的存在和數量的側向流分析，但失敗了。失敗的原因很多，但可能主要歸因于以下因素例如產生高背景噪聲的紅細胞溶血、例如導致紅細胞滲漏到層析條上的低過濾效率、需要相對較大量的樣本(例如需要100μl樣本或以上)、溶解共軛物或可檢測試劑的低效、當存在細胞時由于細胞體積變化引起的體積變化、分析時間長、以及溶解用于檢測分析物的共軛物的低效。需要設計能夠克服現有技術中這些問題的一個或多個側向流測定和系統。
此外，需要簡化用于側向流測定的測試帶的結構以提高測定效率和降低制造成本。
Polito等人的美國專利No.6,136,610闡述了用于實施側向流測定的方法和裝置。Thayer等人的美國專利No.6,528,323闡述了用于進行側向流測定的雙向側向流測試帶和方法。盡管這些專利中闡述的方法和系統對于檢測和定量大多數分析物是有用的，但這些專利未教授這些方法和系統如何能用于分析含有包括紅細胞和/或白細胞或其它細胞類型的細胞的樣本。PCT出版的已公開專利申請No.WO03/008933闡述了用于對包含全細胞的樣本進行側向流測定的測試帶。然而，WO03/008933中的測試帶可被改良以簡化結構、提高效率、可靠性、減少體積相關性并減少制造成本。
不同的策略已被用于從例如血液樣本的樣本中去除例如紅細胞的細胞，以便于檢測分析物，例如傳染性疾病生物體或針對傳染性疾病生物體的抗體。然而，至今為止，很少策略能有良好效果。例如，Doshi等人的美國專利No.5,766,552公開了使用多孔材料，諸如包含游離粘合劑和與成核微粒密切相關的微粒相關粘合劑的吸收墊。該過濾系統需要大約100μl全血，如圖4中所示。
人類紅血球在它們的細胞表面上包含幾種跨膜蛋白質，這幾種跨膜蛋白質可能是制造針對紅細胞的抗體的合適靶點。例如，帶3與氯化物和重碳酸鹽穿越細胞膜的電中性交換相關聯。帶3是911氨基酸的糖蛋白，具有結合細胞骨架、血色素和糖酵解酶的43kDa氨基末端細胞溶質結構域，以及介導陰離子轉運的52kDa羧基末端細胞膜結構域，如Wang，D.N.(1994)中所闡述的已提純帶3的兩種肽，C1包含Ala893-Val911而KS4包含Gly647-Arg656，如在Fu，G.等人(2004)中描述的，肽C1被發現具有酶活性，以劑量相關的方式在Leu118-SeM 19處分解血型糖蛋白A9(GPA)，但肽KS4在相同條件下不分解GPA。
人紅血球在它們的細胞表面上還包含另一種蛋白，血型糖蛋白。已報道血型糖蛋白(GPA)增強爪蟾卵細胞表面上帶3陰離子轉運活性的表達。Young，MT.和Tanner，M.J.(2003)。作者發現GPA的C末端胞質尾區增強帶3向細胞表面的穿行，而細胞外剩余部分68-70增加帶3的特殊陰離子轉運活性。
至今為止，還是缺乏能用于在醫療點環境測定諸如血液樣本的生物樣本中的分析物的快速、有效和高效定量的側向流測定和系統，或者能用于測定存在于例如從針刺手指得到的少量樣本中的分析物的側向流測定和系統，或者與量無關的能用于測定分析物的、或解決現有技術側向流測定和系統中其它問題的側向流測定和系統。

發明內容
因此，本發明的一個目的是為用于測定生物樣本中的分析物的現有技術側向流測定和系統所面臨的問題提供解決方案，這些生物樣本包括但不限于包含諸如紅細胞、或白細胞、或其它細胞類型的細胞的樣本。
本發明的另一目的是提供側向流測定和系統，包含測試帶和/或用于容納定量測試帶的測試盒。
本發明的又一目的是提供如上的與量無關的側向流測定和系統。
本發明的再一目的是提供如上的能使用少量樣本實現的側向流測定和系統，該量為例如在小于約100μl的范圍內。典型地，取樣量少于約90μl。更典型地，取樣量小于約80μl。優選地，取樣量小于約70μl。更優選地，取樣量小于約60μl。更進一步優選地，取樣量小于約50μl。最優選地，取樣量為約40μl。
本發明的另一目的是提供如上的對溶解共軛物或可檢測試劑有效的側向流測定和系統。
本發明的又一目的是提供如上的提供對諸如紅細胞的細胞的良好過濾的側向流測定和系統。
根據本發明的目的之一，提供如下發明。
一般而言，本發明的一個實施例包括用于側向流測定的測試帶，側向流測定用于檢測或定量含液體樣本中的至少一種分析物，該測試帶包括(1)第一膜，其中該第一膜包含樣本過濾器，而該樣本過濾器包含第一孔徑和(可任選地)第一粘合劑；(2)(可任選地)第二膜，其中該第二膜包含第一液體收集器，而該第一液體收集器包含第二孔徑，其中第二膜如果存在則與第一膜毛細作用接觸。
(3)(可任選地)第三膜，其中該第三膜包含共軛物墊，并且該共軛物墊如果存在則直接或間接地與層析條毛細作用接觸，且其中共軛物墊包含至少一種可流動的可檢測試劑，而該至少一種可流動的可檢測試劑是第一可流動的可檢測試劑。
(4)第四膜，其中該第四膜包含層析條，所述層析條包含第一端和第二端、至少一個捕獲帶、至少一個任選地包含對照試劑的對照帶；和(可任選地)至少一種可流動的可檢測試劑，其中該至少一種可流動的可檢測試劑是第二可流動的可檢測試劑，其中至少一個捕獲帶包含用于捕捉至少一種分析物的固定捕獲試劑，其中層析條允許液體從第一端向第二端或從第二端向第一端的側向流動，并且其中層析條與第一、第二或第三膜中的至少一個直接或間接地毛細作用接觸。
(5)(可任選地)第五膜，包含用于施加樣本、緩沖液、或試劑的緩沖液墊，其中該第五膜如果存在則與第四膜毛細作用接觸，并可任選地包含第二粘合劑；(6)第六膜，其中該第六膜包含第一吸收墊，并且該第一吸收墊與層析帶直接或間接毛細作用接觸。
(7)(可任選地)第七膜，其中該第七膜包含第二吸收墊，并且該第二吸收墊如果存在則與第六膜毛細作用接觸；以及(8)(可任選地)第八膜，其中該第八膜包含第二液體收集器，并且該第二液體收集器如果存在則與第四膜和第五膜(如果存在)毛細作用接觸；以及其中測試帶被配置成允許樣本中至少一種分析物的檢測或定量，并且樣本包含紅細胞。
典型地，測試帶包含第二膜，且第二孔徑與第一孔徑的比小于約20并大于約1。
在一個可選實施例中，測試帶包含第二膜，并且其中至少第一膜的至少一部分置于第二膜之上。
在另一個可選實施例中，測試帶包含第二膜和共軛物墊，并且第一膜通過第二膜與共軛物墊毛細作用接觸，但不與共軛物墊物理接觸。
在又一個可選實施例中，測試帶包含第五膜，并且第五膜包含第二粘合劑。
在再一個可選實施例中，第一吸收墊與第五膜直接或間接毛細作用接觸。
本發明的另一個實施例包含用于側向流測定的測試帶，該側向流測定用于檢測含液體樣本中的至少一種分析物，該測試帶包含(1)包含樣本濾過器的第一膜，其中樣本濾過器可任選地包含粘合劑；(2)包含層析條的第二膜，其中層析條包含第一端和第二端、至少一個包含用于捕獲至少一種分析物的固定捕獲試劑的捕獲帶、至少一個對照帶、以及(可任選地)第一可流動的可檢測試劑，其中層析條支撐液體從第一端向第二端或從第二端向第一端的側向流動，并且其中層析條與樣本過濾器毛細作用接觸；(3)(可任選地)包含共軛物墊的第三膜，其中該共軛物墊包含第二可流動的可檢測試劑，并且共軛物墊如果存在則與層析條毛細作用接觸；(4)包含緩沖液墊的第四膜，其中緩沖液墊與共軛物墊或層析條毛細作用接觸；(5)包含第一吸收墊的第五膜；(6)(可任選地)包含第二吸收墊的第六膜；和(7)(可任選地)包含第一液體收集器的第七膜；其中測試帶被配置成允許樣本中至少一種分析物的檢測或定量，并且樣本包含紅細胞。
本發明的再一個實施例包含用于側向流測定的測試帶，該側向流測定用于檢測樣本中的至少一種分析物，測試帶包含
(1)具有第一端和第二端的層析條，該測試帶包含用于捕獲分析物的捕獲帶；(2)與層析條的第一端有效接觸的液體傳遞元件，該液體傳遞元件從包含樣本墊和第一樣本過濾器的組中選擇，該液體傳遞元件被放置為使施加到液體傳遞元件的液體經過液體傳遞元件傳遞并被施加到層析條；(3)至少一個與液體傳遞元件有效接觸的吸收墊；(4)(可任選地)與層析條的第二端有效接觸的共軛物墊，該共軛物墊包含分析物的帶標記的特異性結合配偶體；(5)液體收集器，與共軛物墊(如果存在)或(如果不存在共軛物墊)與層析條的第二端有效接觸，以使施加到液體收集器的液體經過液體收集器傳遞至共軛物墊(如果存在)，或傳遞至層析條的第二端(如果共軛物墊不存在)；(6)第二樣本過濾器，與液體收集器有效接觸，以使經過第二樣本過濾器傳遞的液體被施加到液體收集器；和(7)(可任選地)與層析條的一側相接觸的襯墊，襯墊被設置成使液體能夠無障礙地從與層析條第一端有效接觸的液體傳遞元件和從與層析條第二端有效接觸的液體收集器或共軛物墊進入層析條。
本發明的又一個實施例包含用于側向流測定的測試帶，該側向流測定用于檢測樣本中的至少一種分析物，該測試帶包含(1)具有第一端和第二端的層析條，測試帶包含用于捕獲分析物的捕獲帶；(2)與層析條的第一端有效接觸的第一樣本過濾器，該第一樣本過濾器放置成使施加到第一樣本過濾器的液體經過第一樣本過濾器傳遞并被施加到層析條；(3)至少一個與至少一部分第一樣本過濾器有效接觸的吸收墊，從而該至少一個吸收墊能在層析條第一端從層析條抽出液體，該液體經過樣本過濾器被吸回；(4)(可任選地)與層析條的第二端有效接觸的共軛物墊，該共軛物墊包含分析物的可流動的帶標記特異性結合配偶體；(5)液體收集器，它與共軛物墊(如果存在)，或者與層析條的第二端(如果不存在共軛物墊)有效接觸，以使施加到液體收集器的液體經過液體收集器傳遞至共軛物墊(如果存在)，或傳遞至層析條的第二端(如果共軛物墊不存在)；(6)第二樣本過濾器，與液體收集器有效接觸，以使經過第二樣本過濾器傳遞的液體被施加到液體收集器；和(7)(可任選地)與層析條的一側相接觸的襯墊，襯墊被設置成使液體能夠無障礙地從與層析條第一端有效接觸的第一樣本過濾器、和從與層析條第二端有效接觸的液體收集器或共軛物墊進入層析條。
本發明的又一個實施例包含用于側流動測定的測試帶，該側向流測定用于檢測樣本中的至少一種分析物，該測試帶包含(1)包含第一端和第二端的層析條、包含用于捕獲至少一種分析物的固定捕獲試劑的至少一個捕獲帶、以及包含用于檢測非特異性結合的固定對照試劑的至少一個對照帶；(2)共軛物墊，其中共軛物墊與層析條的第二端毛細作用接觸，且其中共軛物墊包含固定的可檢測試劑，該可檢測試劑能夠結合至少一種分析物或在捕獲分析物后結合捕獲試劑；(3)在靠近第二端的一側上毗鄰共軛物墊的樣本過濾器，其中樣本過濾器可任選地包含粘合劑，并且樣本過濾器與層析條毛細作用接觸；(4)(可任選地)液體收集器(如果存在)置于樣本過濾器和層析條之間；(5)(可任選地)置于層析條第一端處并與層析條毛細作用接觸的緩沖液墊；(6)置于層析條第一端處并與層析條直接或間接毛細作用接觸的第一吸收墊；和(7)(可任選地)第二吸收墊(如果存在)與第一吸收墊毛細作用接觸；其中測試帶允許檢測或定量包含全細胞的樣本中的分析物。
本發明的其它目的、特征或優點將在以下描述中部分地闡述，并且對于本領域普通技術人員而言在閱讀本文的描述后將部分地變得顯易見，或可通過實踐本發明獲知。本發明的目的和優點將通過特別在發明內容和所附權利要求中指出的元件和組合來實現和獲得。此外，說明書中描述的優點，如果不包含在權利要求中，則不是對所公開發明的本質的限制。
本文中示意性地描述的發明在缺少任何未具體在此公開的元件或諸元件、限制或諸限制的情況下可被適當地實踐。因此，例如，術語“包括”“包含”“具有”等都應理解為是可擴展的和無限制的。另外，本文中所采用的術語和表達作為描述的術語使用而不是限制，且并非旨在排除任何將來示出和描述的等效物或其任何部分來使用這些屬于和表達，并且認識到在本發明權利要求要求的范圍內各種改變都是可能的。因此，應理解盡管本發明已通過優選實施例和可選特征具體地公開，但本領域技術人員可采取本文所公開的本發明的更改和變化，并且這樣的更改和變化被視為在本文公開的發明范圍內。在此已對本發明進行了廣泛的和一般性的描述。包含在上位公開范圍內的狹義種類和亞屬分類也形成這些發明的一部分。這包括以某種條件或否定限制從類中排除了任何主題內容的對每一發明的一般性描述，而與所排除的內容是否具體落入該一般性描述無關。
另外，發明的特征和方面按照馬庫什(Markush)組描述時，本領域技術人員將認識到本發明因此也可以按照馬庫什組中任何單獨成員或成員的亞組進行描述。還應理解以上描述是為了說明而不是限制。閱讀以上描述后很多實施例對于本領域人員而言將變得顯而易見。本發明的范圍因此不應參考上述描述確定，而是應參考所附權利要求和這些權利要求授權的整個等效范圍來確定。所有文章和參考(包括專利申請)的公開通過引用結合于此。


圖1是用于容納本發明測試帶的測試盒的一個示例的平面俯視圖。
圖2是本發明測試帶的一個實施例的側視圖，其中樣本施加在窗口1上。
圖3是本發明測試帶的另一實施例的側視圖，其中樣本施加在窗口2上。
圖4是本發明測試帶的又一個實施例的側視圖，其中樣本施加在窗口1和窗口2上。
圖5是本發明測試帶的一個實施例的側視圖，和可與該測試帶一起使用的測試盒的俯視平面圖，示出了測試帶和測試帶的能在測試盒中看見的各個部分之間的對應性。
圖6是本發明測試帶的一個實施例的俯視圖，示出了在窗口1施加樣本和在窗口2施加緩沖液后液體的雙向流動。
圖7是本發明測試帶的另一個實施例的俯視圖，示出了在窗口1和在窗口2施加樣本后液體的雙向流動。
圖8是測試帶的總體類似于圖3的另一實施例的側視圖，但在該實施例中樣本(至少對于通常通過窗口2施加至共軛物墊的樣本)在到達樣本過濾器前與共軛物反應。
圖9是測試帶的總體類似于圖4的又一實施例的側視圖，但在該實施例中樣本(至少對于通常通過窗口2施加至共軛物墊的樣本)在到達樣本過濾器前與共軛物反應。
圖10是測試帶的總體類似于圖3的再一實施例的側視圖，但在該實施例中，在層析介質的第二端處堆疊在層析介質上的是共軛物墊、樣本過濾器、以及液體收集器，其中液體施加至共軛物墊，且液體收集器與層析介質接觸。
圖11是測試帶的總體類似于圖3的另一實施例的側視圖，，但在該實施例中，在層析介質的第二端處堆疊在層析介質上的是共軛物墊、樣本過濾器、以及液體收集器，其中液體施加至共軛物墊，且液體收集器與層析介質接觸。
圖12是能使用金抗-DNP抗體和DNP-BSA作為對照來實施對人類丙型肝炎病毒(HCV)的間接測定的測試帶的一個實施例的詳細側視圖。
圖13是能使用金抗-DNP抗體和DNP-BSA作為對照來實施前列腺特異性抗原(PSA)夾心測定的測試帶的一個實施例的詳細側視圖。
圖14是能使用金抗-DNP抗體和DNP-BSA作為對照來實施人類HIV特異性抗體夾心測定的測試帶的一個實施例的詳細側視圖。
圖15是能使用金抗-DNP抗體和DNP-BSA作為對照來實施人類HIV特異性抗體間接測定的測試帶的一個實施例的詳細側視圖。
圖16是能使用金抗-DNP抗體和DNP-BSA作為對照來實施人類HIV特異性抗體和HCV特異性抗體間接測定的測試帶的一個實施例的詳細側視圖。
圖17是能使用金抗-DNP抗體和DNP-BSA作為對照來實施乙型肝炎表面抗原(HbsAg)和梅毒螺旋體抗原夾心測定的測試帶的一個實施例的詳細側視圖。
本發明的詳細描述本發明公開了側向流測定方法和系統，該方法和系統包含測試帶和/或用于容納該測試帶的測試盒，用于測定樣本中分析物的存在和/或數量，樣本包括但不限于生物材料或其它含樣本材料，包含抗原、抗體、激素和其它分泌性蛋白、細胞表面蛋白、跨膜蛋白、糖蛋白、酶、與細胞或其它蛋白相關聯的蛋白、與例如細菌、病毒、霉菌的病原體相關的蛋白、碳水化合物、藥物、肽、毒素、核素、小分子和適體。這種新的測定或系統能檢測和/或定量少量樣本中的分析物。通常，采樣量小于約100μl。典型地，采樣量小于約90μl。更典型地，采樣量小于約80μl。優選地，采樣量小于約70μl。更優選地，采樣量小于約60μl。仍然更優選地，采樣量小于約50μl。最優選地，采樣量為約40μl。該測定或系統也能在樣本中將液體與細胞分離，諸如紅細胞、或白細胞、或其它細胞類型。該測定或系統基本上是與量無關的，從而不管樣本中所存在的紅細胞的細胞容積，例如紅細胞容積的變化如何，結果都是恒定的。該測定或系統還具有低背景干擾和高效率。
對于此處的使用，“分析物”指將通過使用本發明的側向流測試帶和方法所檢測的材料。“分析物”包含但不限于抗原、抗體、激素(例如TSH、hCG、LH)、藥物、心臟標記物(諸如肌鈣蛋白I、心肌型肌酸激酶同功酶(CKMB)、肌紅蛋白、C反應蛋白(CRP)、脂肪酸結合蛋白(FABP)、糖原磷酸化酶同功酶BB(GPBB)、B型利鈉肽(BNP)和Pro-BNP、自身免疫性疾病標記物、腫瘤標記物(例如PSA、CEA、α-胎蛋白)、與細胞相關聯的蛋白(“細胞蛋白”)、分泌性蛋白、酶、細胞表面或跨膜蛋白、糖蛋白和其它蛋白、與例如細菌、病毒、霉菌的病原體相關的蛋白或碳水化合物、肽、毒素、核素、適體和碳水化合物。當在本文中使用時，分析物還包含可被特異性非抗體結合蛋白(例如受體)檢測的分子、以及可被特異性沃森-克力克堿基配對(雜交)檢測的核酸。其它分析物貫穿說明書作進一步描述。
本文中的“分析物結合劑”是特異性結合將要分析的樣本中的分析物的分子。“分析物結合劑”可以是抗體或抗原但并不局限于此。“分析物結合劑”包含生物工程蛋白、肽、包含具有分析物結合部位的抗原的異類混合物的半抗原和溶菌產物。在一個典型但非排他性的實施例中，分析物結合劑是用于結合要分析樣本中抗原的抗體、或用于結合要分析樣本中抗體的抗原。如果分析物是核酸分子，則分析物結合劑可以是例如通過沃森-克力克堿基配對的與其特異性結合的核酸分子，或者可以是在序列-特異性相互作用基礎上結合核酸序列的蛋白質。
在本文中使用時，術語“抗原”包含感染性抗原和其它微生物或其一部分，諸如細菌、病毒、衣殼、核殼體、或者病毒、霉菌、蛋白感染素或寄生蟲的其它部分。感興趣的分析物最好包含免疫原部分，從而針對用于檢測目的部分可產生抗體。細菌包含革蘭氏陽性和陰性細菌，比如炭疽芽孢桿菌、大腸埃希桿菌、沙門氏菌屬類、志賀氏菌屬類、鼠疫巴斯德(氏)菌、螺旋桿菌、霍亂弧菌、葡萄球菌類等。病毒包含HIV、甲乙丙丁型肝炎病毒、單純瘡疹病毒、細胞巨化病毒(CMV)、埃博拉病毒、絨毛狀瘤病毒(例如HPV)、包含流感病毒的鼻病毒、SARS病毒、和牛痘病毒。“抗原”還包含抗體能針對其產生的化合物或感染劑的免疫原部分。另外，術語“抗原”也可包含要檢測的抗體或可刺激抗體產生的微分子。例如，在檢測人免疫缺陷病毒(HIV)或丙型肝炎病毒(HCV)時，人類抗HIV抗體或抗HCV抗體是要檢測的抗原，例如通過抗-人IgG(免疫球蛋白G)。在檢測例如風濕性關節炎、橋本(氏)甲狀腺炎、系統性紅斑狼瘡的人體自身免疫疾病的情況下，和在以對自身抗原的異常抗體反應為特征的其它情況下，針對這樣的自身抗原的人類抗體成為抗原。
在本文中使用時，術語“抗體”包含多克隆或單克隆抗體、或足以結合感興趣抗原或分析物的片段。抗體片段可以是，例如，單節顯性的Fab片段、單節顯性的Fab′片段、或雙節顯性的F(ab)′2片段。也在術語“抗體”的范圍內的是由抗體工程產生的分子，例如單鏈抗體分子(ScFv)；或由單克隆抗體產生的人源化抗體或嵌合抗體，通過取代重鏈和輕鏈的恒定區可產生嵌合抗體，或者取代恒定區和可變區的結構部分可產生人源化抗體。然而，在大多數情況下，不需要這樣的更改以產生適合與本發明一起使用的抗體。
在本文中使用時，術語“捕獲帶”指層析條上包含至少一種分析物結合劑的區域或區帶。分析物結合劑通常固定在帶或區域內，從而在與可檢測試劑反應后，該帶或區域產生可觀察的或可測量的反應存在于樣本中分析物的存在或數量的結果。“捕獲帶”可包含用于捕獲樣本中一個以上分析物的一個以上捕獲區域，在該情況下可使用一種以上分析物結合劑。例如，被視為在本發明范圍內的兩種分析組合是同時檢測丙型肝炎病毒(HCV)和人類免疫缺陷病毒(HIV)的測定的組合，以及同時檢測乙型肝炎表面抗原(HbsAG)和梅毒螺旋體抗原(TP)的測定的組合。其它組合仍是可能的，并且在本發明的范圍內。
在本文中術語“共軛物”和“可檢測試劑”互換地使用，指共軛至諸如有色試劑、熒光試劑或化學發光試劑的可檢測材料的抗體或抗原。在本發明的實踐中，“共軛物”或“可檢測試劑”特異性地結合要檢測的分析物，或固定在捕獲帶上的所捕獲的分析物。可任選地，“共軛物”或“可檢測試劑”在捕獲帶上產生可測量的定量讀數，該讀數反映捕獲帶上存在的分析物的量。如在以下進一步描述的，捕獲帶內可直接測量的定量密度并不一定反映通過結合存在于捕獲帶內的分析物的量，但RI(相對密度)確實反映捕獲帶處存在的分析物的量。
在本文中使用時，“可檢測材料”指諸如在捕獲帶處可被共軛至抗原或抗體、并且可被檢測的任何材料。該材料可以是微粒、有色材料、熒光材料、化學發光材料并可包含一種以上材料。如果使用一種以上材料，則可使用可能材料的任何組合。例如，如果測定意欲檢測一種以上分析物，則使用的可檢測材料可以是在不同波長處發熒光的熒光材料。微粒可以是如在美國專利No.6,136,610中所描述的帶有或不帶有機或無機包衣的膠體金微粒、膠體硫微粒、膠體硒微粒、膠體硫酸鋇微粒、膠體硫酸亞鐵微粒、金屬碘酸鹽微粒、鹵化銀微粒、硅微粒、膠態金屬(含水的)氧化物微粒等、蛋白質或肽分子、脂質體、或有機聚合物乳膠微粒(例如聚苯乙烯乳膠珠)。微粒的大小可與層析條的孔隙率相關。
在本文中使用時，術語“對照帶”包含固定在對照結合區域內的對照試劑。對照試劑特異性結合至對照結合試劑以形成對照結合對，如在美國專利No.6,136,610中所描述的，該專利通過引用結合于此。本發明通常包含兩個對照帶，盡管并不要求使用兩個對照帶。兩個對照帶可相同或不同。具有對照結合對的一個特別優點是它們作為內部對照起作用，即，對可在單個測試帶上對比分析物檢測結果的對照。該對照可用于校正條與條之間的變化。對照之一可指定為高對照(“HC”)，而對照中的另一個可指定為低對照(“LC”)。當使用兩個對照時HC與LC的比通常被預定為內部質量對照之一。另外，HC或(可選地)LC的反映密度可用于確定測試帶(分析物)的RI(相對密度)。對于任何定量測定，都根據系列濃度標準試劑的RI來制定標準曲線。在定量測定時，根據信號/截斷(S/C)的RI的比檢測數量，而截斷根據大量陰性樣本來確定。盡管通常本文中可使用任何常規的對照，但通常優選將不存在于樣本中或不會與存在于樣本中的化合物發生交叉免疫反應的化合物作為對照；例如，可購自Molecular Probes(Eugene，OR，cat#A-23018)的2，4-地樂酚苯醚小牛血清白蛋白可用作對照試劑。化合物2，4-地樂酚苯醚是不存在于人體內但作為半抗原起作用的小分子；即，當結合至較大分子(例如蛋白質載體)并注射進入抗體產生哺乳動物時它具有免疫原性，所述哺乳動物例如鼠、大鼠、牛、兔、馬、綿羊或山羊。
術語“有效接觸”在本文中應用如下兩個固體組分在它們以如下方式或直接或間接接觸時是有效接觸液體可通過毛細管現象或其它方式從兩組分之一幾乎不間斷地流至另一個。“直接接觸”表示兩組分為物理接觸，例如邊緣-至-邊緣或前方-至-后方。“間接接觸”表示兩組分沒有物理接觸，而是由一個或多個傳導手段橋接。這種通過一個或多個傳導手段的橋接可以是邊緣-至-邊緣或前方-至-后方的。在本文中使用時，術語“毛細作用接觸”等同于有效接觸。
用于檢測諸如PSA(前列腺特異性抗原)或TSH(甲狀腺刺激激素)的分析物的“直接測定”意為夾心測定法。例如，對于PSA的測定，帶標記的抗PSA抗體與存在于樣本中的PSA反應以形成復合物。該復合物在捕獲帶上檢測，該捕獲帶可涂上或PSA抗原或PSA抗體。如果抗原是聚集的或包含相同抗原決定簇(抗原定子)的多重拷貝，并且想要在捕獲帶上將抗體結合至測試帶，則分析物的特異性第一和第二抗體可以是等同的。否則，第一和第二抗體是結合至分析物上不同抗原決定簇的兩種抗體。在夾心測定中，樣本可被加至設備的孔1和孔2兩者中，如下所示。可任選地，在使用單向流以提供信號的測定中，樣本可只被加入孔1中。
在用于例如抗-HIV抗體的“間接測定”中，樣本被加至孔1，并且當樣本在檢測帶上向下流過層析條時，樣本中的抗-HIV抗體結合至檢測帶中的HIV抗原。當緩沖液被加至孔2時，它溶解向上流過層析條并結合至與檢測帶中HIV抗原特異性結合的人類抗體的抗-人IgG-金共軛物。在這個間接測定形式中，樣本總是加在設備的孔1中，如下所示。
在本文中使用時，“停流”測定是其中第一方向的流停止的測定。在停流中，加入孔1的液體(樣本或緩沖液)是以相對較小量加樣的，從而沒有足夠的液體流過硝基纖維素膜，并且在流到達帶標記的試劑(共軛物)之前流停止。實現停流測定的目的是預濕潤硝基纖維素膜，封閉某些非特異性蛋白結合位點以及確保硝基纖維素膜表面上的化學物質在標記試劑流進這些區域之前均勻地分布。這是與“逆流”測定相對照的。在逆流測定中，較大量的液體被加至孔1從而這種液體能夠流回。對于逆向流測定，測試盒被構建為當正確量的樣本被加至孔1時，液體沿帶朝孔2流下，經過對照和檢測區域，然后終止，然后逆向朝吸收墊流回。然后樣本被加至孔2，并沿帶朝吸收劑墊向上流。另外，使用根據本發明圖3和4中的設備可實施雙向流測定形式。在雙向流動析形式中，液體通常通過孔1和孔2順序地加至硝基纖維素膜或其它層析介質的兩端，并且在硝基纖維素膜內兩個方向上都出現了流。
應理解前面一般描述和以下詳細描述只是示例性的和闡述性的，而并不像權利要求所要求地限制本發明。此外，必須理解本發明不局限于所描述的具體實施例，具體實施例當然是可變的。另外，用于描述具體實施例的術語并不是為了作出限制，因為本發明的范圍將僅由它的權利要求來限制。
另外，雖然本發明可單獨使用、或與任何適于人工或自動讀取結果的分析設備一起使用，但在本文中本發明使用美國專利No.6,136,610中的裝置和盒為例，并且在本發明的一個實施例中，使用了美國專利No.6,528,323中的雙向流機構。應理解本發明并不局限于使用這樣的裝置或盒。
關于值的范圍，本發明包含該范圍上限和下限之間的每一中間值到下限單位的至少十分之一，除非上下文另外明確提示。而且，本發明包含任何其它規定的中間值以及包含范圍上限和下限的兩者之一或兩者的范圍，除非它們從規定的范圍內被特別排除。
除非另外定義，本文中使用的所有技術和科學術語的意義是本發明所屬領域技術人員通常理解的。本領域技術人員也將理解任何與本文中所描述相類似或等同的方法和材料也可用于實踐或檢測本發明。
本文所討論的出版物或專利只是因為它們的公開先于本申請的提交日期而提供。此處決不能解釋為承認本發明不會先于已有發明的出版物而授權。此外出版物提供的日期可能與實際出版日期不同，該實際出版日期可能需要單獨確認。
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如在本說明書和所附權利要求中所使用的，單數形式包含復數形式。例如術語“a”“an”和“the”包含復數范圍，除非上下文另外明確提示。因此，除非另外提示，“一樣本過濾器”包含一個或多個樣本過濾器。可任選地，緩沖液墊可置于任何樣本過濾器或樣本過濾器集合上。這應用于以下描述的所有實施例。
參看圖1，圖1是可與本發明的測試條一起使用的現有技術測試盒(1)的平面俯視圖，測試盒(1)有兩個窗口。窗口1(2)可用于夾心法的加樣，例如應用于乙肝表面抗原(HbsAg)的檢測；或者可用于間接法雙向橫流檢測中對分析物的檢測，例如人體免疫缺陷病毒(HIV)抗體。窗口2(3)可用作夾心法測定中的加樣窗口，或者可用作加試劑的窗口，例如間接法雙向流檢測中的緩沖液。測試盒(1)還包含一個檢測窗口(4)用來觀察試驗結果。通過觀察檢測窗口(4)，可觀測到用于待檢測分析物的捕獲帶(5)-此分析物在本例中標記為人體免疫缺陷病毒(HIV)，同時還可觀測到第一條對照帶(6)——此帶在本例中標記為HC，和第二條對照帶(7)——此帶在本例中標記為LC。為便于管理測試類型、產品有效期、和批間變化的調整，測試盒(1)還可有選擇地包括條形碼(8)。
在本發明中，如果使用了圖1所示的測試盒，則窗口1(2)或窗口2(3)各自可用來添加樣本或者試劑，具體如下所述。
參看圖2，圖2是本發明一實施例的測試條的側視圖。在本實施例中，如圖2所示，在層析條(9)的第一端(10)有一個樣本過濾膜(12)置于窗口1(圖1的2)，窗口2(圖1的3)上設置有緩沖液墊(14)。緩沖液墊(14)設置在共軛物墊(13)的上面，該共軛物墊(13)含有至少一種可流動的可檢測試劑，通常稱為“共軛物”，共軛物特異地與分析物結合、或與一個結合了分析物的試劑結合。比如，這樣的共軛物可以是偶合了膠體金的分析物特異抗體或分析物特異抗原。可任選地，共軛物墊(13)還可包含與一個或多個對照帶(6，7)上的固定對照試劑特異結合的第二個可流動的可檢測試劑，比如如圖6所示。對于全血測定，樣本過濾器(12)包含有一種凝集素用來與全血樣本中的紅細胞凝集。第一個樣本吸收墊(15)設置在第一端(10)，在樣本過濾器(12)的遠離化學共軛物墊(13)或緩沖液墊(14)的一側靠近樣本過濾器(12)。也可以使用與第一個吸收墊(15)毛細作用接觸的第二個可任選吸收墊(16).。第二個吸收墊(16)(如果存在)可直接置于第一個吸收墊(15)之上或與第一個吸收墊(15)重疊。第一個吸收墊(15)和層析條(9)的第一端(10)有毛細作用接觸或者重疊。可任選地使用一個塑料襯墊(17)來支撐層析條(9)。層析條(9)還包含針對每一種要檢測分析物的至少一條捕獲帶(5)和一條或者多條對照帶(6，7)，比如如圖6所示。每條捕獲帶(5)上都包含有一種固定的抗體或者抗原，此抗體或抗原特異性地與樣本中要檢測的分析物發生反應。每條對照帶(6，7)中任選地都包含著一種固定的抗體或抗原，此抗體或抗原與樣本非特異性地發生反應，或者與共軛物墊(13)上的其他對照試劑發生特異性反應。
在用圖2所示的形式進行間接測定的過程中，含全血的樣本被加到窗口1(2)的樣本過濾器(12)上，如圖6所示。紅細胞滯留在樣本過濾器(12)上，而樣本中的液體從樣本過濾器(12)流到層析條(9)的第一端(10)，再從第一端(10)沿第一側流方向流向第二端(11)。在第一次液體流動的過程中，樣本液體流過捕獲帶(5)，捕獲帶(5)在艾滋測試條中含有HIV抗原或在丙肝測試條中含有HCV抗原，它們分別與樣本中的諸如HIV抗體或者HCV抗體的分析物反應的。在第一次液體側向流動的過程中，液體還會通過對照帶(6，7)。更進一步地，第一側向流方向(21)的液流，在最靠近共軛物墊的對照帶(7)和共軛物墊(13)之間需要并明顯地停止流動。樣本中的分析物(如果存在)會在液體流動的過程中主要沿第一側流方向(21)被捕獲帶(5)捕獲，在測試帶(5)上形成第一個免疫復合物，諸如HIV-抗人類HIV抗體復合物。全血樣本中存在的一些分析物和其他抗體，可在一條或者多條對照帶上非特異性地結合。然后向緩沖液墊(14)添加緩沖液，以釋放共軛物墊(13)里的共軛物。在一實施例中，所釋放的共軛物中包含至少一種或者兩種帶標記試劑，一種與測試帶(5)上的第一個免疫復合物特異性反應，比如帶標記的抗人IgG，以及可任選的，一種與對照帶(6，7)上的對照試劑發生反應。所釋放的共軛物再從層析條(9)的第二端(11)沿著第二側流方向(22)向第一端(10)流動。在第二側流方向(22)的液體流動過程中，在對照帶(6，7)上形成一種帶標記對照結合試劑和對照試劑的可檢測復合物，在捕獲帶(5)上形成帶標記的抗人IgG抗體和第一免疫復合物的第二個可檢測免疫復合物。在間接測定中，允許在第一次流動期間樣本中的分析物和捕獲帶(5)上的捕獲試劑之間發生反應形成第一免疫復合物，以在第二次流動期間檢測。
值得注意的是，當如圖2的測試帶配置被用于諸如血清或者血漿樣本的非全血樣本中分析物的測定時，樣本過濾器(12)中不需要包含凝集素。這樣的配置可用于夾心測定和間接測定。在夾心測定中，比如乙肝表面抗原(HBsAg)的檢測中，如果要達到最佳性能則需要樣本或者是緩沖液(在乙肝表面抗原(HBsAg)夾心測定的情形中，血清樣本可被同時加入窗口1和窗口2，也可只加入窗口2)。如根據本發明的測試帶執行的夾心測定和間接測定的區別如下。間接測定的定義是，帶標記的試劑并不與分析物直接發生反應，而是與免疫復合物發生反應。例如，如果在乙肝表面抗原(HBsAg)的測試中在窗口2加樣，則在測試帶上涂上一種乙肝表面抗原抗體，另一種乙肝表面抗原抗體被標記和涂在共軛物墊上，當在窗口2加樣時第一免疫復合物形成，然后在測試帶捕獲以形成夾心，用于固定和標記的化學試劑都是同樣的抗體或者抗原(即使抗原決定基不同)。另一方面，在如HIV或HCV抗體測試的間接測定中，捕獲帶中的固定試劑(HIV或HCV抗原)和共軛物墊上的帶標記試劑(如抗人IgG)不是同一反應物。固定捕獲試劑直接與分析物反應，帶標記試劑與分析物和捕獲試劑的復合物反應。如圖6所示，向窗口1(2)的樣本過濾器(12)加樣。液體將從樣本過濾器(12)流到層析條(9)的第一端(10)，再以第一側流方向(圖6的21)從第一端(10)流到第二端(11)，通過捕獲帶(5)和對照帶(6，7)；液體在到達共軛物墊之前停止流動(見“停流”模式)，或者可任選地，流體可流入共軛物墊(13)并溶解共軛物(如果期望改進測定的執行)。通常情況下，在根據本發明的測試帶進行的測定中，特別是間接測定中，最好使用停止流動模式，即不允許流體流過共軛物墊并接觸共軛物，尤其是在間接測定(抗體檢測)中，因為樣本中的抗體將與共軛物中帶標記的抗人IgG(或IgM)反應，在共軛物到達捕獲帶之前形成免疫復合物。這樣就會產生假陰性的結果。因此，在間接測定中，從窗口1流出的流體不能與共軛物接觸。然而，在夾心測定中，停止流動模式則不是必須的。
因此，在一實施例中，來自樣本的液體在對照帶(7)和共軛物墊(13)之間停止了沿第一次側流方向(21)的流動。如果在樣本中發現了正在檢測的分析物，例如乙肝表面抗原，則它將在包含比如固定的人抗乙肝表面抗原抗體(“固定捕獲抗體”)的捕獲帶捕獲。在液體在第一側流方向上流動的過程中，在捕獲帶(5)上形成了第一個免疫復合物，比如乙肝表面抗原和乙肝表面抗體的復合物。再一次，在液體在第二側流方向(22)上流動的過程中，如果在第一次流動后樣本中還剩有未結合的分析物，那么在第二次流動的過程中將會形成其它的第一免疫復合物。
樣本的第二份試樣被加到緩沖液墊(14)；在這個格式中，緩沖液墊含有紅細胞凝集素。樣本中的細胞被留在緩沖液墊，而來自樣本的液體流過共軛物墊(13)，共軛物被釋放。共軛物包含有與樣本中分析物反應的第一種帶標記的可流動試劑，例如共軛于一種例如膠體金的可檢測試劑的帶標記的人抗乙肝表面抗原抗體。可任選地，共軛物包含與對照帶(6，7)中的對照試劑發生反應的第二種可流動試劑。在液體在第二側流方向(22)流動的過程中，如果樣本中含有分析物，則諸如帶標記的抗人乙肝表面抗原抗體和乙肝表面抗原的第二種免疫復合物將形成，就從層析條(9)的第二端(11)在第二側流方向流到第一端(10)。當液流第二側流方向繼續時，帶標記的對照粘合試劑和對照試劑的可檢測復合物在對照帶(6，7)形成；并且在捕獲帶(5)上形成包含第一和第二免疫復合物的可檢測的第三免疫復合物。雙向側流有利于沖掉捕獲帶和對照帶上的污染物，從而減少背景干擾。
圖2的形式可用來檢測血清或血漿樣本中分析物的間接測定。在這種形式中，樣本過濾器(12)中可任選地不含凝集素。測定首先通過向窗口1(2)添加緩沖液或者其他液體試劑來預濕層析條(9)。然后向窗口2(3)添加血清或血漿樣本。來自樣本的液體從共軛物墊釋放共軛物。樣本中的分析物(如果存在)將與共軛物反應形成第一對抗原抗體結合體，即第一免疫復合物。第一免疫復合物與樣本液體一起按第二側流方向流到捕獲帶(5)和對照帶(6，7)。第一免疫復合物在捕獲帶(5)上在第二次抗原抗體反應時被捕獲以生成第二對結合物，即第二免疫復合物，該復合物可被檢測到并定量。
與上面所述的實施例(未示出)有所不同，不使用共軛物墊(13)，并且固定的可檢測試劑在第二端(11)結合于層析條(9)。在該實施例中，窗口2(圖1的3)設置有緩沖液墊(14)，位于層析條(9)的頂端或者與層析條(9)重疊。緩沖液墊(14)可置于固定的可檢測試劑的上方。
在上述實施例的另一種變體(未示出)中，不使用緩沖液墊(14)，共軛物墊(13)設置于層析條(9)的第二端的上方或與之重疊。可直接向共軛物墊(13)添加緩沖液。
在又一實施例中，如圖3所示，該測試條適于實現夾心測定，諸如用于檢測乙肝表面抗原和用于檢測對梅毒螺旋體即梅毒病原體的抗體。在這種形式下，還有第二個樣本過濾器(18)，一個液體收集器(19)，可任選的一個共軛物墊(13)，都置于層析條(9)的第二端(11)。在層析條(9)的第一端(10)還設置有一個第一樣本過濾器(12)和至少一個吸收墊(15)。第一個吸收墊(15)置于第一個樣本過濾器(12)的上方。圖4示出了一個變體，其中第一個和可任選的第二個吸收墊放置成在層析條(9)的第一端(10)靠近樣本過濾器(12)。圖4的形式適于執行夾心測定，諸如對前列腺特異性抗原(PSA)和促甲狀腺激素(TSH)的測定。
在如圖3所示的實施例的一個變體(該變體未示出)，不使用共軛物墊，但在層析條(9)的第二端(11)上結合有可流動的可檢測試劑。在這種結構下，液體收集器(19)直接與層析條(9)有毛細作用接觸，液體收集器可被完全設置在層析條(9)的第二端(11)的上方，或者與層析條重疊。
如圖3所示的實施例的另一個變體(圖上未示出)，用樣本墊來代替第一個樣本過濾器來施加諸如緩沖液的試劑。樣本墊包含能承載足以進行測定的緩沖液的吸收材料。
在使用圖3和圖4形式的測定的操作過程中，含有全血的樣本被加到圖1的窗口1(2)和窗口2(3)。在這個形式里，第一個樣本過濾器(12)和第二個樣本過濾器(13)最好是可過濾掉紅細胞的全血過濾器。圖7示出使用圖4的實施例來進行夾心測定。向層析條(9)的第一端(10)向第一個樣本過濾器(12)加入含紅細胞的樣本。來自樣本的液體沿第一側流方向從第一端(10)流到第二端(11)，途中流經捕獲帶(5)和對照帶(6，7)。分析物(如果存在)將在捕獲帶(5)被捕獲，從而分析物-抗體在捕獲帶(5)上形成第一免疫復合物。然后向窗口2(3)上的第二樣本過濾器(18)加入同一個樣本的第二試樣。來自第二樣本過濾器(18)的液體經過液體收集器(圖4的19)和共軛物墊(13)到達第二端(11)，然后再沿第二側流方向(22)從第二端(11)向第一端(10)移動，途中經過捕獲帶(5)和對照帶(6，7)。分析物(如果存在)將在捕獲帶(5)上被檢測試劑(諸如抗體)捕獲，從而分析物-抗體復合物形成夾心。在這個形式里，加入窗口2(3)的分析物(例如乙肝表面抗原)首先與來自共軛物墊的共軛物結合，例如帶標記的乙肝表面抗原抗體，比如共軛于膠體金的乙肝表面抗原抗體，以形成分析物-共軛物的復合物，然后該復合物流到捕獲區、并與固定在捕獲區上的乙肝表面抗原抗體發生反應，在那時加到窗口1(2)的樣本也已捕獲到了乙肝表面抗原。
在一種變體中，可省去向樣本過濾器(12)的第一端(10)添加樣本的步驟，并且樣本可直接向窗口2(3)上的第二個樣本過濾器(18)添加。在這種形式下，首先向窗口1加緩沖液以預濕測試帶，從而緩沖液按第一次側流方向(21)由第一端(10)向第二端(11)流動。接著向窗口2(3)加樣。來自樣本的液體經過液體收集器(19)和共軛物墊(13)到達第二端(11)，然后再從第二端(11)沿第二側流方向流過捕捉帶(5)和對照帶(6，7)。樣本中的分析物和共軛物結合以形成復合物，復合物然后流向捕捉帶和對照帶。分析物-共軛物復合物在捕獲帶(5)上被捕獲，從而形成夾心。
值得注意的是，當如圖3或圖4的測試帶結構用于諸如血清或者血漿樣本的非全血樣本中分析物的測定時，圖3中的樣本過濾器(18)或者圖4中的樣本過濾器(18或12)不包含凝集素。這種結構既可用于夾心測定也可用于間接測定。
樣本過濾器(12)放置在層析條(9)的第一端(10)上，從而在諸如從圖1測試盒的窗口1(2)向樣本過濾器(12)加樣時，樣本中的液體將會從樣本過濾器(12)流到層析條(9)的第一端(10)，并沿第一側流方向從層析條(9)的第一端(10)流到第二端(11)。樣本過濾器(12)中可任選地包含與去除某種物質相關的凝集素試劑，諸如從樣本中過濾掉細胞。例如，如果樣本含有紅細胞，則凝集素就可以是抗紅細胞抗體或者是任何可凝集紅細胞的血凝素。含有此類凝集素的樣本過濾器統稱為“全血過濾器”。這些可選方案描述如下。
在本文中使用時，“樣本墊”以及“樣本過濾器”指的是可用來承載樣本，如全血樣本、血清或者血漿的元件。術語“樣本墊”是指可用來承載樣本的吸水性元件，例如親水性的膜。當樣本是全血或者可以是全血時，樣本墊中可包含上述的凝集素。術語“樣本過濾器”一般指可類似地用于承載樣本的疏水性元件，比如玻璃纖維過濾器。樣本過濾器也可包含如上所說的凝集素。然而，樣本過濾器也可以是親水性元件，比如用抗紅血球抗體或其他凝集素預處理的樣本墊。在本文中使用時，術語“全血過濾器”指的是含有凝集素的樣本過濾器。然而，當圖2的測試帶配置用來測定除全血樣本外的其他樣本中的分析物時，諸如血清、血漿或者其他生物制劑，過濾器(12)上不需要凝集素。這個配置可適用于夾心測定和間接測定。在夾心測定中，例如乙肝表面抗原的測定中，如圖6所示，為了達到最好的效果，將樣本或者緩沖液加到窗口1(2)上的樣本過濾器(12)。在例如乙肝表面抗原這種夾心測定中，可向窗口1和窗口2加樣，也可以只向窗口2加樣。液體將會從樣本過濾器(12)流到層析條(9)的第一端(10)，再以第一側流方向從第一端(10)流到第二端(11)，通過捕獲帶(5)和對照帶(6，7)；液體在到達共軛物墊(13)之前停止流動(“停止流動”模式)，或者可任選地，如果需要改進實驗效果，則液體流入共軛物墊(13)并溶解共軛物。在間接測定中停止流動模式特別適用，因為樣本中的抗體被排除與共軛物中的帶標記的抗人IgG或者IgM相互作用，從而在共軛物流到捕獲帶之前就形成復合物，從而導致假陰性結果。
在本發明的一個實施例中，共軛物墊(13)置于層析條(11)的第二端，而緩沖液墊(14)置于共軛物墊(13)的上方。在該實施例中，共軛物墊(13)與層析條(9)的第二端(11)交迭，交迭的距離足以供液體從緩沖液墊(14)流過共軛物墊(13)到達層析條(9)上。交迭的距離可以是大約0.5mm到大約10mm之間，通常情況下為大約1mm到大約8mm，較佳的是大約2mm到大約5mm，更佳地為大約2mm到3mm。
緩沖液墊(14)可以是任何合適大小，只要它能如上所述吸收或承載足夠量的液體來溶解共軛物墊(13)里或者層析條(9)上的可檢測試劑即可。在一實施例中，緩沖液墊比共軛物墊大。在另一實施例中緩沖液墊與共軛物墊一樣大。在又一實施例中，緩沖液墊比共軛物墊小。
在本發明的另一實施例中，不使用共軛物墊(13)，并且當使用共軛物墊時，通常出現在共軛物墊上的可檢測試劑被結合到層析條(9)的第二端(11)。在這種實施例中，緩沖液墊(14)置于層析條(9)的上方。在一可選方案中，緩沖液墊(14)與層析條(9)的第二端(11)交迭，交迭的距離足以使緩沖液墊(14)上加入的液體通過毛細作用流到層析條(9)上以溶解層析條(9)第二端(11)上存在的可檢測試劑。在另一可選配置中，緩沖液墊(14)可置于緩沖液溶解層析條(9)第二端(11)的正上方，例如層析條(9)第二端(11)中可檢測試劑的上方。在該實施例中，添加到緩沖液墊(14)上的液體可溶解可檢測試劑，使可檢測試劑從層析條(9)的第二端(11)按第二流動方向向層析條(9)的第一端(10)移動。如果緩沖液墊(14)和層析條(9)交迭，則該交迭可在大約0.5mm到大約10mm之間的范圍內，通常情況下為從大約1mm到大約8mm，較佳的是從大約2mm到大約5mm，最佳為大約2mm到3mm。
第一個吸收墊(15)置于層析條(9)的第二端(10)上，在遠離共軛物墊(13)或者緩沖液墊(14)的一側靠近樣本過濾器(12)。還可設置與第一吸收墊(15)有毛細接觸的第二吸收墊(16)。在一實施例中，可任選的第二吸收墊(16)置于第一個吸收墊(15)的正上方。第一個吸收墊(15)與層析條(9)的第一端(10)交迭，交迭的距離足以使流體從層析條(9)向吸收墊流動。該距離為大約0.5mm到大約10mm之間，通常情況下為大約1mm到大約8mm，較佳的是大約2mm到大約5mm，最佳為大約2mm到3mm。此外，可任選地使用第三吸收墊。
即使某些層析條已經設置有背襯部分，也可任選地使用襯墊(17)來支撐層析條(9)。
在本發明的一個實施例中，如圖3所示，至少一個吸收墊(15)與第一樣本過濾器(12)有毛細接觸。可任選地，在第一吸收墊(15)的上方設置第二吸收墊(16)。在一個實施例(圖3)中，這兩個吸收墊(15，16)都置于第一樣本過濾器(12)的上方，但并不會阻擋向第一樣本過濾器(12)加樣本或者其他試劑。可任選地，還可使用第三吸收墊。
在本發明的另一實施例中，如圖4所示，吸收墊(15，16)放置成在層析條(9)的第一端(10)靠近第一樣本過濾器(12)，在第一樣本過濾器(12)的與樣本過濾器(18)相反的一端。如上所述，第一樣本過濾器(12)通常是包含凝集素的全血過濾器。但是，如以下所述，如果向窗口1添加緩沖液，則可用樣本墊來取代第一個樣本過濾器(12)。該樣本墊可如上所述是親水性的，也無需如上所述必須用抗紅血球抗體或者其他凝集素進行預處理。
圖4的配置尤其適用于執行免疫夾心測定，例如對前列腺特異性抗原(PSA)或者促甲狀腺激素(TSH)的測定。
如圖3或圖4的裝置可用幾種模式操作。在那些模式之一中，向窗口1和窗口2加入(全血)樣本。當全血作為樣本加入窗口1和窗口2時，第一樣本過濾器(12)和第二樣本過濾器(18)最好都是全血過濾器以阻止紅細胞(尤其是紅血球)進入層析條。或者，向窗口1加緩沖液，窗口2加作為樣本的全血。在這種可選方案中，第一樣本過濾器(12)就無需是全血過濾器，即它不必含有凝集素。但是一般情況下，最好第一樣本過濾器(12)和第二個樣本過濾器(18)都是全血過濾器，而不管在進行測定時向窗口1加的是樣本還是緩沖液。
在使用圖3和圖4的形式進行測定時，向圖1的窗口1和窗口2填加含全血的樣本。在這種形式下，第一樣本過濾器(12)和第二樣本過濾器(18)最好都是可以過濾紅細胞的全血過濾器。圖7示出了用圖4的實施例進行夾心測定的操作。向層析條(9)的第一端(10)使的第一樣本過濾器(12)上添加含紅細胞的樣本。來自樣本的液體沿第一側流方向從第一端(10)向第二端(12)流動，途經捕獲帶(5)和對照帶(6，7)。分析物(如果存在)將在捕獲帶(5)上被捕獲，分析物-抗體在捕獲帶(5)上形成了第一免疫復合物。向窗口2(3)上的第二樣本過濾器(18)添加同一樣本的第二試樣。來自第二樣本過濾器(18)的液體經過液體收集墊(圖4的19)和共軛物墊(13)到達第二端(11)，然后再沿第二側流方向從第二端(11)再流到第一端(10)，途經捕獲帶(5)和對照帶(6，7)。分析物(如果存在)在捕獲帶(5)上被檢測試劑(例如抗體)捕獲，從而分析物-抗體的復合物形成夾心。在這種形式下，添加到窗口2(3)的分析物(例如乙肝表面抗原)將首先與來自共軛物墊的例如帶標記的抗乙肝表面抗原抗體(例如共軛于膠體金的的抗乙肝表面抗原抗體)的共軛物結合，以形成分析物-共軛物的復合物。然后該復合物向捕獲區流動，并與固定在捕獲區上的抗乙肝表面抗原抗體反應，此時也已經從加到窗口1(2)的分析物中捕獲了乙肝表面抗原。
在一變體中，可省略向第一端(10)上的樣本過濾器(12)添加樣本的步驟，而直接將樣本添加到窗口2(3)的第二樣本過濾器(18)上。在這種形式下，先向窗口1添加緩沖液以預濕測試帶，緩沖液沿第一側流方向(21)從第一端(10)向第二端(11)流動。然后向窗口2(3)加樣。來自樣本的液體沿第二側流方向(22)經過液體收集器(19)和共軛物墊(13)流向第二端(11)，并從第二端(11)沿第二側流方向(22)流過捕獲帶(5)和對照帶(6，7)。樣本中的分析物與共軛物組合以形成復合物，該復合物再流向捕獲帶和對照帶。分析物-共軛物復合物將在捕獲帶(5)上被捕獲，并形成夾心。
值得注意的是，當如圖3或圖4中的測試帶配置用于測定諸如血清或者血漿樣本的非全血樣本中的分析物時，圖3中的樣本過濾器(18)或者圖4中的樣本過濾器(18或12)不包含凝集素。這種配置既可用于夾心測定也可用于間接測定。
根據本發明的測試帶可被配置成實現采用單向流動或雙向流動的測定。在本文中使用時，“單向流動”是指只在測試帶的一個部位加樣，通常情況下為窗口1。“單向流動”的概念中包括諸如“停止流動”的模式，即只加在測試帶一個部位的液體在層析介質的某一點停止流動；或者是“逆向流動”模式，即加在測試帶的一個部位上的液體在進行測定期間在層析內逆向流動。本領域普通技術人員可通過適當選擇加樣到測試帶的液體的量和測試帶吸收材料的大小以及吸收性能來選擇這些操作形式。在“雙向流動”中，在測試條的多個部位加樣，通常為窗口1端和窗口2；液體在雙向流動的過程中(即第一次流動方向和第二次流動方向)有足夠的毛細梯度。
本發明所涉及的材料和測試帶成分的設置使本發明有了獨特的優點，從而可使用較少量的樣本，有效地過濾包括紅細胞的細胞，有效地溶解可檢測試劑，并能得到測定分析物的存在和量的一致結果。
為了構建本測試帶，本發明的層析條(9)可由任意具有高蛋白結合能力和支持側流測定的適當材料構成。一般來說，層析條(9)為親水性膜，且蛋白結合為非共價結合。盡管發明人并不旨在為下述理論所限制，目前關于蛋白質和硝化纖維膜的結合理論是這樣表述的，最初的交互作用是靜電的，但隨后的疏水交互作用和氫鍵則被認為是增強了結合。層析材料的一個示例是常用的硝化纖維膜，對其已作了處理使之成為疏水性材質，例如由Millipore Corporation(Billerica，MA)制造的一種硝化纖維膜。層析膜的另一個示例是由某種聚合體的微粒(諸如聚乙烯)熔合在一起。這些微粒可以是球形微粒。POREX公司(POREX Corporation，Fairburn，GA)生產的POREX Lateral-Flo膜就是這種類型的膜。層析條的尺寸可以為任何適于實驗儀器或裝置讀取數據的尺寸。例如，為了與美國專利No.6,136,610的裝置一起使用，層析帶的大小為大約5mm×44mm。當將例如HIV抗原或者HCV抗原的抗原涂在層析條上時，這些抗原最好涂在含有海藻糖的溶液里。溶液中海藻糖的合適濃度為1.0％。可穩定諸如硝化纖維上的固定抗原的其它復合物是眾所周知的。
當抗原或者抗體涂在層析條(9)上時，由于其多孔性，蛋白質溶液將自身溶解到硝化纖維膜的整個厚度中。蛋白質與氣孔表面結合。由于這種加樣方法和結合的物理特性，與被提餾溶液浸濕的其他區域相比，更多的蛋白質在線的上部和中心被結合。
本發明所指的層析條(9)包括至少一條用來捕獲分析物的捕獲帶和至少一條對照帶，以及可任選的第二條對照帶。當結合圖1的測試盒使用時，可從測試窗口(4)中看到捕獲帶和一條或多條對照帶。捕獲帶包含能捕獲樣本中的分析物(如果存在)的材料。例如，如果側流測定旨在測量血液樣本中的乙肝(HBV)表面抗原(HBsAg)，則捕獲帶將包含固定在層析條上的乙肝(HBV)表面抗原(HBsAg)的抗體。如上所述，兩條對照帶之一是高對照帶(HC)，而另一條則為低對照帶(LC)。在本發明的一個實施例中，層析條(9)將在第二端(11)另外包含共軛物或者用來檢測所捕獲的分析物的其他可檢測試劑。
在圖2所例示的實施例中，樣本過濾器(12)最好是疏水性膜，或者是親水性膜，或者是比如通常用于側流測定中加樣的人工合成膜。這樣的樣本過濾器的示例，包括但不僅限于以下幾種疏水性過濾器，例如玻璃纖維過濾器(AhlstromFiltration，Inc.美國賓州Mount Holly Springs)；合成過濾器，比如Cytosep(AhlstromFiltration或者Pall Specialty Material，Port Washington，NY)；以及親水性過濾器，比如纖維素(Pall Specialty Material)。在一實施例中，單個樣本過濾器就足夠了。在另一實施例中，可使用一個以上樣本過濾器。本樣本過濾器(12)不需要使用成核劑或者成核粒子。然而，樣本過濾器也可包含凝集素，例如某種抗體或者化學復合物。當該測定作為雙向側流測定進行時，即只向窗口1(2)加樣時，而且有例如TWEEN 20的非離子清潔劑存在于用于釋放或溶解共軛物的緩沖液中時，凝集素就不一定是必需的。釋放共軛物的緩沖液中清潔劑的濃度應最少為大約0.1％。清潔劑和共軛物釋放緩沖液的結合有利于從捕獲帶和對照帶沖走紅細胞或者溶解了的紅細胞，并減少分析物和樣本過濾器的非特異性結合。圖3和圖4設備中的樣本過濾器(12，18)相似地構造。
在圖3和圖4中所例示的實施例中，第二樣本過濾器(18)通常是疏水性膜，例如玻璃纖維膜(Ahlstrom Filtration，Inc)。在本實施例的一方面中，該第二樣本過濾器(18)包含一凝集素。在本實施例的另一方面中，在加入該凝集素之前，對該疏水性器用某種非離子清潔劑進行處理，例如用濃度為大約0.002％的土溫20(TWEEN20)。第二樣本過濾器可用于向圖1中試劑盒(1)的窗口2(3)加樣。
樣本過濾器(12，18)的適當尺寸可以是適于在特定參數范圍內的測試條。例如，與美國專利No.6,136,610中的裝置一起使用時，樣本過濾器的尺寸為大約5mm×8mm。在一種實施例下，當樣本過濾器(12，18)中含有凝集素時，最好在加入凝集素之前用清潔劑，例如非離子清潔劑(比如濃度大約為0.002％的TWEEN20)進行預處理。
本發明的凝集素通常包括針對需要被過濾掉的細胞或者其他物質的抗體。例如，如果需要過濾掉的物質是血細胞，則本發明的凝集素包括抗紅細胞抗體或者抗白細胞抗體。該抗體可涉及一種細胞表面抗原。例如，抗紅細胞(抗-RBC)抗體包括抗紅細胞膜抗體，例如抗帶3抗體或者抗血型糖蛋白抗體(例如抗血型糖蛋白A抗體)。這些抗體可在市場上買到，例如適于測定的一定濃度的兔抗人紅細胞抗體(中國廈門Buo-shen Biotech)或者鼠抗人紅細胞抗體(中國安徽Rui-Tai-EnScientific LLC)，濃度的范圍為大約0.1mg/ml到大約1mg/ml，通常情況下為0.2mg/ml到大約0.8mg/ml，最好為0.25mg/ml到大約0.5mg/ml。
在本發明的另一實施例中，凝集素為一種化學復合物，例如外源凝集素。外源凝集素是可以粘著細胞的蛋白或者糖蛋白，包括例如刀豆球蛋白A、小麥胚芽凝集素、Glysine max和Phaseolus vulgaris的凝集素、紅豆因、大豆凝集素等，這些凝集素如在Goldstein等人(1980)Nature 28566和Schnebli，H.P.及Bachi，J.(1975)“外源凝集素和人紅細胞的反應”(Reactions of Lectins with human erythrocytes)Exot.Cell.Research 91中所述可單獨或者是組合使用。這些凝集素都可以在市場上買到。
本發明的共軛物墊(13)是由疏水性材料組成的，例如玻璃纖維(Pall SpecialtyMaterial)，并包含了可與樣本中的分析物發生反應、或與在捕獲帶使捕獲的分析物發生反應的共軛物或者可檢測試劑。可檢測試劑包括例如特別針對分析物的抗體或者抗原，它們與諸如有色物質、熒光物質、或化學發光物質的可檢測物質共軛。膠體金就是有色物質的一個例子。這里的共軛物墊的尺寸適于所述參數范圍內的的層析條。例如，如果與美國專利No.6,136,610中的裝置一起使用，共軛物墊為大約5mm×8.5mm。通常情況下，用含有海藻糖和酪蛋白的緩沖液對共軛物墊進行預封閉。一般情況下，該緩沖液里海藻糖的含量約為大約2.5％到大約7.5％，較佳地濃度約為大約5％。通常，緩沖液里酪蛋白的濃度約為大約0.25％到大約0.75％，較佳地濃度約為大約0.5％。更佳地，共軛物溶液含5％的海藻糖和0.5％的酪蛋白的溶液。通常情況下，涂在墊上的共軛物為海藻糖濃度為2.5％，酪蛋白的濃度為0.25％的溶液。海藻糖的目的是為了當共軛物在共軛物墊上變干時起穩定共軛物的作用，而不是阻止其與共軛物墊或者硝化纖維膜結合。通常情況下是用一種封閉蛋白來阻止結合。一種合適的封閉蛋白是濃度為0.5％的堿溶性的Hammarsten酪蛋白。可用合成聚合物粘合劑加工過的玻璃纖維膜達到阻止結合的目的。當共軛物在共軛物墊上變干時可穩定共軛物的其他試劑是眾所周知的，并且本發明并不局限于使用用海藻糖和酪蛋白預封閉過的共軛物墊。
本發明的緩沖液墊(14)是親水性膜或者是人工合成膜，例如Cytosep膜(Ahlstrom Filtration，Inc)。在圖2所例示的實施例中，緩沖液墊(14)可在測試盒(1)中進入，以在窗口2(3)上添加試劑。這里的緩沖液墊(14)的大小在所述參數范圍內與層析條相適應。例如，如果與美國專利No.6,136,610中的裝置一起使用時，緩沖液墊為大約5mm×13mm。
本發明的吸收墊(15，16)是一種可吸收液體的吸水性膜，例如纖維素(Whatman，Kent，UK)或者纖維素-玻璃纖維合成物(Whatman，Kent，UK)。這里的吸收墊的大小在所述參數范圍內與層析條相適應。例如，如果與美國專利No.6,136,610中的裝置一起使用時，緩沖液墊為大約5mm×27mm。
本發明的襯墊(17)可以是由任何可以起到支撐層析條作用的惰性材料制成的，例如塑料材質(G&L Precosion cutting，San Jose，CA)。襯墊(17)的大小在所述參數范圍內與層析條相適應。例如，如果與美國專利No.6,136,610中的裝置一起使用時，緩沖液墊的尺寸為大約5mm×60mm。
本發明的液體收集器(19)為疏水性膜，就像共軛物墊(13)的疏水性膜一樣。但是與共軛物墊(13)不同的是，液體收集器(19)不含任何可檢測試劑。液體收集器(19)的大小在所述參數范圍內與層析條相適應。例如，如果與美國專利No.6,136,610中的裝置一起使用時，緩沖液墊的尺寸為大約5mm×13mm。
或者，如果第一樣本過濾器(12)被樣本墊所取代，則該樣本墊在本發明中為如Cytosep膜(Ahlstrom Filtration，Inc)這樣的親水性膜，諸如圖3所示，樣本墊可用來添加試劑的，諸如向圖1的測試盒(1)的窗口1(2)添加緩沖液。在向樣本過濾器(18)添加樣本之前，樣本墊可用來添加緩沖液來預濕層析條(9)。樣本墊的大小在所述參數范圍內與層析條相適應。例如，如果與美國專利No.6,136,610中的裝置一起使用時，樣本墊的尺寸為大約5mm×18mm。可任選地，樣本墊可以用抗紅細胞抗體或者其他凝集素進行預處理，但如果緩沖液要施加到窗口(2)就沒有必要進行預處理。
在如圖4所例示的本發明的另一實施例中，當用樣本墊來取代第一樣本過濾器(12)時，樣本墊可以像樣本過濾器(18)的疏水性膜一樣也是疏水性膜。在該實施例中，樣本墊中也可含有凝集素。或者，樣本墊也可如上所述是親水性的，可含有也可不含有凝集素。
參看圖5，圖5示出了本發明的測試帶的平面俯視圖與可一起使用的測試盒之間的對應性。在該實施例中，可檢測試劑可被結合在層析條的第二端(11)、或者可呈現在共軛物墊(13)上。當該測試帶配置被用于夾心測定中時，要測定的樣本可添加到窗口1(2)和窗口2(3)。或者，可向窗口2(3)添加樣本，而可向窗口1(2)添加諸如緩沖液的試劑而不是樣本。當本測試帶結構被用于間接測定中時，可向窗口1(2)添加樣本，而向窗口2(3)添加緩沖液。
盡管本發明提供了可有效地從樣本的液體中把紅細胞分離出來，而且對細胞容積沒有依賴性的優點，但是當樣本中不存在細胞或者不存在紅細胞時，本發明也可以用作對樣本中的一種或者多種分析物進行檢測和定量測定。因此，要測試的樣本包括血清、血漿和全血。
圖8一般性地示出了根據本發明的測試帶的另一實施例。一般而言，圖8是在圖3中示出的測試帶的一個變體，但在該變體中樣本，至少是那些被加在共軛物墊上(通常通過窗口2加入)的樣本，在接觸到樣本過濾器之前與共軛物反應。在該實施例中，層析條(9’)有第一端(10’)和第二端(11’)、樣本過濾器(18’)、液體收集器(19’)以及共軛物墊，都置于層析條(9’)的第二端(11’)。同時還有第一樣本過濾器(12’)、至少一個吸收墊(15’)、以及可任選的與第一個吸收墊(15’)毛細接觸的第二吸收墊(16’)，都置于層析條(9’)的第一端(10’)。另外，可能還會可任選地使用第三吸收墊。圖8的測試條與圖3中一樣具有捕獲帶和對照帶(未示出)。樣品可加到共軛物墊(13)、也可加到第一樣本過濾器(12)。樣本過濾器(18’)和液體收集器(19’)都可以由同樣的大孔徑的材料組成，但不是必須的。樣本過濾器(18’)最好與共軛物墊(13’)的孔徑大小一樣，而液體收集器(19’)的孔徑則較小一些。因此，由于與層析條(9’)的接觸，毛細梯度就這樣形成了，(19’)＞(18’)＞(13’)。當如圖8的裝置被用于執行雙向測定時，可向共軛物墊(13’)和第一個樣本過濾器(12’)加樣。通常情況下，通過窗口1(2)向第一個過濾器(12’)加樣，并通過窗口2(3)向共軛物墊(13’)加樣。
圖9一般性地示出了根據本發明的測試帶的另一實施例。一般而言，圖9是在圖4中示出的根據本發明的測試帶的一個變體。在該變體中樣本，至少是如以上圖8所示的通常通過窗口2加在共軛物墊上的樣本，在接觸到樣本過濾器之前與共軛物反應。圖9的測試帶也與圖4的一樣具有捕獲帶和對照帶(未示出)。圖9中的測試帶的結構和圖8的相類似，區別在于，樣本墊(12’)與層析條(9’)直接接觸，而且比吸收墊(15’)和(16’)更遠離層析條(9’)的第一端(10’)。相比之下，在圖8的測試帶中，吸收墊(15’)和(16’)被堆疊在樣本墊(12’)的上面，從而樣本墊(12’)的表面部分地被吸收墊(15’)和(16’)所覆蓋。另外，還可任選地使用第三吸收墊。可向共軛物墊(13’)加樣，也可向第一樣本過濾器(12’)加樣。第一樣本過濾器(18’)和液體收集器(19’)可由同樣的大孔徑材料組成，但不是必須的。樣本過濾器(18’)最好與共軛物墊(13’)的孔徑大小相同，而液體收集器(19’)的孔徑則較小一些。因此，由于與層析條(9’)的接觸，毛細梯度就這樣形成了，(19’)＞(18’)＞(13’)。當圖9的設置用于進行雙向測定時，樣品可加在共軛物墊(13’)上，也可加在第一樣本過濾器(12’)上。通常情況下，通過窗口1向第一個過濾器(12’)加樣，并通過窗口2(3)向共軛物墊(13’)加樣。
圖10一般性地示出了根據本發明的測試條的另一實施例。一般而言，圖10是圖3所示的根據本發明的測試帶的一個變體。在該變體中，在層析條的第二端上依次疊加液體收集器、樣本過濾器、共軛物墊。通常情況下，液體收集器和樣本過濾器排成一條直線，而共軛物墊則偏置成它部分地與樣本過濾器交迭。在該實施例中，層析條(9”)有第一端(10”)和第二端(11”)、樣本過濾器(18”)、可任選地還有液體收集器(19”)和共軛物墊(13”)，都置于層析條(9”)的第二端(11”)；同時還有一個緩沖液墊(12”)，和至少一個吸收墊(15”)，可任選地還有與第一吸收墊有毛細接觸的第二吸收墊(16”)，都置于層析條(9”)的第一端(10”)。另外，可任選地還使用第三吸收墊。圖9的測試帶還包含捕獲帶和對照帶(未示出)。可向樣本過濾器(18”)加樣本。樣本過濾器(18”)和液體收集器(19”)可以由同樣的大孔徑材料組成，但不是必須的。樣本過濾器(18”)最好比共軛物墊(13”)的孔徑小一些，而液體收集器(19”)的孔徑則比樣本過濾器(18”)小一些。因此，由于與層析條(9”)的接觸，毛細梯度就這樣形成了，(11”)＞(18”，19”)＞(13”)。在操作中，遵從以下的順序；(1)可任選地由緩沖液墊(12”)在第一端預濕層析條(9”)；(2)向樣本過濾墊(18”)加樣本，允許液體流向可任選的液體收集器(19”)上或者直接在流向第二端(11”)的方向上流向層析條(9”)，途經捕獲帶和對照帶，并且允許分析物在捕獲帶上被捕獲(如果存在)；(3)向共軛物墊(13”)添加緩沖液以釋放共軛物，允許共軛物流過樣本過濾器(18”)，流向第二端(11”)，流過捕獲帶和對照帶，允許固定了的可檢測試劑檢測到在捕獲帶上捕獲的分析物。
相似地，圖11示出了一個與圖10相似的實施例，不同之處在于，緩沖液墊(12”)、吸收墊(15”，16”)、以及層析條(9”)的第一端(10”)之間的關系如圖4或者圖9所示。圖11的裝置的操作和圖10的基本相似。
因此，根據本發明的測試帶的另一實施例通常是用于側向流測定的測試帶，以便于檢測樣本中的至少一種分析物，該測試帶包括(1)層析條，包括第一端和第二端，以及至少一個捕獲帶和至少一條對照帶。捕獲帶包括用于捕獲至少一種分析物的固定捕獲試劑，而對照帶包括用于測定非特異結合的固定對照試劑；(2)共軛物墊，其中該共軛物墊與層析條的第二端有毛細接觸，并且其中共軛物墊包括可結合到至少一種分析物上，或者在捕獲分析物之后結合到捕獲試劑的一種可流動的可檢測試劑；(3)樣本過濾器，該樣本過濾器在更靠近第二端處與共軛物墊相鄰，其中樣本過濾器可任選地包括凝集素，并且與層析條有毛細接觸；(4)可任選地，液體收集器，置于樣本過濾器和層析條之間(如果存在)；(5)可任選地，緩沖液墊，置于層析條的第一端，并與層析條有毛細接觸；(6)第一吸收墊，置于層析條的第一端并與之有直接或者間接的毛細接觸；以及(7)可任選地，第二吸收墊，并與第一吸收墊有毛細接觸(如果存在)；其中測試帶允許對含全細胞的樣本中的分析物進行檢測和定量測定。
使用本發明的測試帶進行側向流試驗可參照圖6進行說明。圖6示出了本發明一實施例的平面俯視圖，顯示了在試驗中樣本和試劑的雙向側向流，如圖2的實施例所示。在這種實施例中，向樣本過濾器(12)加樣本。液體從樣本過濾器(12)流向層析條(9)的第一端(10)，并在第一側流方向(21)流向層析條(9)的第二端(11)，途經捕獲帶(5)和對照帶(6，7)。在對照帶(7)和共軛物墊(13)之間，來自樣本的液體在第一流動方向上停止流動；如果有過量的液體，則在第二次加樣到窗口2(3)后，第一次流動時的過量液體將回流、并在第二流動方向上流向層析條(9)的第一端(10)。樣本中的分析物(如果存在)將主要在液體在第一流動方向(21)流動的過程中在捕獲帶(5)上被捕獲，其次則在液體在第二流動方向(22)流動的過程中被捕獲。雙向側向流有利于預濕層析條，從而在帶標記的試劑流入該區域之前，層析條表面的化學物質可以溶解并均勻地分布；雙向側向流同樣有利于沖洗走捕獲和對照帶上的雜質，從而減少試驗中的背景噪聲。一種試劑，比如適合于試驗的緩沖液或者共軛物釋放緩沖液，可由窗口(2)添加到緩沖液墊(14)上，緩沖液的用量應足以溶解或者是釋放共軛物。合適的共軛物釋放緩沖液為1X PBS，含有0.1％的土溫20(TWEEN20)，0.01％的酪蛋白，0.3％的SDS，0.2mM EDTA以及0.1％的疊氮化鈉。所釋放的共軛物在第二流動方向(22)從層析條(9)的第二端(11)向層析條(9)的第一端(10)流動，并在捕獲帶(5)上與分析物發生反應。共軛物被制成相關于分析物。例如，為了檢測人類血樣中的人類抗體時，共軛物可以是抗人IgG(或在人類IgM檢測時是IgM)，諸如但不限于，共軛于膠體金的羊抗人IgG、兔抗人IgG、鼠抗人IgG。
在進行雙向側向流的試驗中樣本過濾器(12)中沒有凝集素時，存在于樣本中的紅細胞將有可能泄漏到層析條(9)上，從而產生高背景噪聲，因此導致降低了信噪比。發明人發現，如果共軛物釋放緩沖液中含有較高濃度(如0.1％)的某種清潔劑，諸如非離子清潔劑，比如TWEEN2O，則將能大大減小背景問題。清潔劑與共軛物釋放緩沖液的混合將有利于從捕獲和對照帶上沖洗走紅細胞或者溶血的紅細胞，從而降低分析物和樣本過濾器的非特異性結合。
如果樣本過濾器(12)中使用諸如抗紅細胞抗體的凝集素，以去除樣本中的紅細胞，則樣本過濾器(12)用諸如非離子清潔劑的清潔劑，例如土溫20(TWEEN20)，進行預處理。較低濃度的例如約0.002％的清潔劑被用于此目的。非離子清潔劑的添加有利于使樣本過濾器的疏水性表面變得具有微弱親水性，從而凝集素就可更充分地與樣本過濾器結合。
圖7示出了如圖4所示的本發明一實施例進行夾心法試驗。比如含紅細胞樣本的試樣在層析條(9)的第一端(10)上被添加到第一樣本過濾器(12)。來自這份試樣的液體在第一流動方向(21)上從層析條(9)的第一端(10)流向第二端(11)，流經捕獲帶(5)和對照帶(6，7)。分析物(如果存在)將在捕獲帶(5)上被捕獲。然后向層析條(9)的第二端(11)的窗口2(3)將同一樣本的第二試樣添加到第二樣本過濾器(18)上。第二樣本過濾器(18)中的液體流經液體收集器(未示出)和共軛物墊(13)到達層析條(9)的第二端(11)，然后再在第二流動方向(22)上從層析條(9)的第二端(11)流向第一端，流經捕獲帶(5)和對照帶(6，7)。分析物(如果存在)將在捕獲帶(5)上被捕獲，并且分析物與捕獲帶上的檢測試劑一起形成夾心。
或者，可略去樣本向層析條(9)的第一端(10)上的樣本墊的初始添加，而在層析條(9)的第二端(11)上直接將樣本添加到窗口2(3)的第二樣本過濾器(18)。樣本過濾器(18)中的液體流經液體收集器(未示出)和共軛物墊(13)到達層析條(9)的第二端(11)；然后在第二流動方向從層析條(9)的第二端(11)流向第一端，流經捕獲帶(5)和對照帶(6，7)。分析物(如果存在)將在捕獲帶(5)上被捕獲，并且分析物將與捕獲帶上的檢測試劑一起形成夾心。通常，在這種操作模式中，要向第一樣本過濾器(12)添加緩沖液，從而緩沖液也就可在第一流動方向上從測試帶的第一端流向第二端以預濕該測試帶。
用圖3所示的裝置可進行類似順序的操作。
如上所述，可使用根據本發明的測試帶在單一的測定中檢測多種分析物。例如，樣本可含有兩種分析物，而層析條可由兩條獨立的捕獲帶組成，每條捕獲帶上包含有一種固定的捕獲試劑，分別針對捕獲特定的一種分析物而不是另一種。或者，樣本可含有三種分析物，而層析條可由三條獨立的捕獲帶組成，每條捕獲帶上包含有一種固定的捕獲試劑，分別只針對捕獲特定的一種分析物，而不是其他兩種。本領域技術人員可針對單次測定所要測定的分析物的組合，根據分析物的性質和捕獲試劑的特點來選擇對分析物混合物合適的捕獲試劑，例如抗體。
如美國專利No.6,136,610所述，在捕獲帶上被捕獲的分析物可被量化的。然而，其他量化方法也是可能的。根據本發明的測試帶還可以用于定性或半定量的測定。
圖12-17中示出了根據本發明的具體實施例。圖12-17的設備都是使用羊抗DNP抗體和DNP-BSA抗體作為對照，并以雙向側向流模式運行。圖12是能對人類丙肝病毒(HCV)進行間接測定的一測試帶實施例的詳細側視圖。圖13是能對前列腺特異性抗原(PSA)進行夾心測定的一測試帶實施例的詳細側視圖。圖14是能對人體艾滋病病毒的抗體進行夾心測定的一測試帶實施例的詳細側視圖。圖15是能對人體艾滋病病毒的抗體進行間接測定的一測試帶實施例的詳細側視圖。圖16是能在同一樣本里同時對人體艾滋病病毒的抗體和丙肝病毒的抗體進行間接測定的一測試帶實施例的詳細側視圖。圖17是能在同一樣本里同時對乙肝表面抗原和梅毒抗原進行夾心測定的一測試帶實施例的詳細側視圖。
本文中使用的組件包括吸收墊，樣本過濾器，緩沖液墊，層析條以及共軛物墊，具有由各生產廠家指定的特性，分別列在表1里。但是，可使用其它替換組件，并且在本領域中是眾所周知的。
合適的分析物包括但不限于抗原、抗體、激素、藥物、細胞蛋白、DNA、心肌標記物、腫瘤或癌癥標記物、自身免疫性疾病標記物、或者其它可培育抗體的大分子。當分析物為抗原時，該抗原可以是與傳染原相關聯的抗原。該傳染原可以是病毒、細菌、真菌、或者蛋白感染素。當該傳染原為病毒時，病毒可從以下構成的組中選擇艾滋病病毒、甲肝、乙肝、丙肝、丁肝病毒、單純皰疹性病毒、細胞巨化病毒、乳突淋瘤病毒、埃博拉病毒、非典病毒、鼻病毒、疫苗病毒，但不僅限于這些病毒。當該傳染原為細菌時，該細菌可以是革蘭氏(染色)陽性或者革蘭氏(染色)陰性細菌。細菌可從以下構成的組中選擇炭疽桿菌、大腸桿菌、哈比特屬幽門菌、淋病奈瑟球菌、沙門氏菌、志賀氏桿菌，但并不僅限于這些細菌。當該傳染原為真菌時，該真菌可以是霉菌或者曲霉菌，但不僅限于這些菌類。
當分析物為激素時，通常情況下可從以下構成的組中選擇人絨毛膜促性腺激素、甲狀腺素、促甲狀腺激素、胰高血糖素、胰島素、恥骨松弛激素、泌乳刺激素、黃體素、促黑細胞激素、生長激素、促卵泡激素、胃泌激素、緩激肽、抗利尿激素或其他釋放因素；然而，其他一些生理學或者病理學上的感興趣的激素都可作為分析物。
當分析物為癌癥或者腫瘤標記物時，它一般從以下構成的組中選擇前列腺特異性抗原(PSA)、癌胚抗原(CEA)和胎蛋白。然而，其他的癌癥或者腫瘤標記物也可以作為分析物。
當分析物為心肌標記物時，該心肌標記物一般從以下構成的組中選擇肌鈣蛋白-I、肌鈣蛋白-T、肌酸激酶同功酶(CK-MB)、肌血球素、c反應蛋白(CRP)、脂肪酸結合蛋白(FABP)、糖原磷酸化酶BB型同功酶(GPBB)、B型鈉尿肽(BNP)、前腦排鈉利尿勝肽(pro-BNP)。然而，分析物還可以是其他心肌標記物。
根據本發明的測試帶和方法還可測定其他一些分析物。例如，可測定組織特異性細胞表面標記物。通過使用以下物質，可基于標記物來分離細胞群外源凝集素(Reisner和Sharon，Trends in Biochem Sci(TIBS)29，1980)、白血球表面糖蛋白(Gahmberg和Anderssen，NYAS(1978)312，Fibroblast Surface Proteins eds.Vahery，Ruslahti和Mosher)、雌激素類固醇受體(Thompson，癌癥治療報告，(1978)63(2)180)、紅血球胰島素受體(Bhathena等人，Horm Metab Res(1981)13179)、或者淋巴細胞情形中的多種標記物。在T淋巴細胞的情形中，還有可能基于用特定細胞功能標識的標記物進一步分離亞群(Reinberg和Schlossman，N Eng J med(1980)3031153)。
類似地，也可測定共用組織的細胞表面標記物。一些細胞表面標記物存在于多個細胞類型里。其一個示例為主要組織相容性復合物人淋巴細胞抗原(HLA)系統、LETS蛋白、P糖蛋白(Kartner等人，Science(1983)2211285)和鐵傳遞蛋白受體(Omary等人，Nature(London)(1980)286888)。
其他分析物包括與病毒相關聯的細胞表面標記物。細胞膜表面抗原也可因感染了病毒而產生。通過放射免疫測定(RIA)、免疫熒光法檢測、紅血球凝集抑制可檢測到的腮腺炎H-N糖蛋白代表了被感染細胞上的病毒標記物(Sever等人，Infect & Immun(1982)35(1)179)。類似地，因單純皰疹病毒1型和2型的感染而產生的標記物也可通過免疫熒光法在宿主細胞的表面上識別出來(Stewart和Herrmann，臨床免疫手冊中的“Herpes Simplex Virus”(單純皰疹病毒)一文，第二版，編者為N.R.Rose和H.Friedman，美國微生物學會，華盛頓，1980年出版)。
還有些分析物包括腫瘤特異性細胞表面標記物。致瘤性轉化和致癌性轉化導致了如在細胞表面蛋白質中所表達的細胞表型的改變。這些可觀察到以下幾種變化在細胞表面正常表達的細胞表面抗原的出現、“改變了的自體抗原”的出現、胚胎細胞表面抗原的出現、以及腫瘤特異性分子的出現等等。Felsted等人(CancRes(1983)432754)描述了在白血病早幼粒細胞的分化過程中細胞膜的變化。Poste的評論(Cancer Invasion and MetastasisBiologic Mechanisms and Therapy，由S.B.Day等人編輯，Raven Press 1977年在紐約出版)中綜述了細胞表型中因致瘤性轉化引起的改變。類似的評論文章描述了以下的表型白血病細胞(Greaves等人Proc of International Symposium on Human Lymphocyte DifferentiationItsApplication to Cancer，Seron和Rosenfeld編輯，North Holland Publishing 1978年在阿姆斯特丹出版)、B淋巴細胞(Thorsky等人，出處同上)、急性淋巴細胞性白血病細胞(Greaves等人，Science 234，1986)。鑒定腫瘤特異性抗原或標志物、以及它們與特定組織腫瘤之間的關聯可允許更清晰的診斷和隨后在治療中的監視。許多腫瘤表面蛋白質已被鑒定。若干示例包括突變了的大白鼠p21腫瘤淋巴細胞蛋白(Bos等人，Nature(倫敦)(1985)315726，和Clark等人PNAS(美國)(1985825280)；急性淋巴細胞性白血病相關聯的GP 100 Ph1抗原(Greaves等人，Blood(1983)61628)；人T細胞白血病相關聯抗原(HTLA)(Seon等人，J of Immunol(1981)127(6)2580)；人肺腫瘤相關聯抗原(Braatz等人，J Nat Cancer Inst(1978)61(4)1035)、雌激素24,000分子量人乳房癌標志物(Adams等人，Cancer Res(1983)434297)；人平滑肌肉瘤抗原(Deng等人，Lancet，1981年2月21日，403頁)；以及人乳腺癌抗原(Schlom等人，PNAS(1980)77(11)6841)。進一步關于腫瘤標志物，由Edelman提出的“改變了的自體抗原”概念(Science(1976)197218)描述了正常情況下為某一細胞類型固有的細胞表面抗原因致瘤性轉化而發生了變化。免疫監督系統將這些異常細胞視為不正常，并且它們能產生免疫響應(Burnet，Brit Med J(1957)1179，Nature(1970)226123)。細胞的致瘤性轉化后還觀察到胚胎細胞抗原的重新出現。致癌胚胎細胞抗原(CEA)、胎兒胚胎抗原(FEA)和腫瘤特異性移植抗原(TSTA)都在癌瘤和肉瘤的血液檢測中起了作用(Mitchison，“Immune Surveillance”in B and T Cells inImmune Recognition(在免疫識別中B和T細胞的“免疫監督”)，F.Loors和G.E.Roelants編輯，Wiley and Sons 1977年在紐約出版)。
其他分析物包括脂蛋白、酶、免疫球蛋白、淋巴因子、細胞活素和藥物，包括在半抗原化的過程中可針對其來制備抗體的任何藥物。在半抗原化過程中，在注射進可產生抗體的動物體內時因太小而不能產生抗體的分子可耦合到諸如蛋白質分子的較大的載體分子，比如鑰孔蟲戚血藍素，再以這種形式注入以產生抗體。
其他蛋白質分析物包括皮質(激)素傳遞蛋白、紅細胞沉淀素、鐵傳遞蛋白、各種球蛋白、甲狀腺激素結合球蛋白、A，B，C，D，E，M等各型的免疫球蛋白，各種補體因子、例如纖維蛋白原的血栓因子、第八因子、組織凝血激酶和凝血酶。
其他分析物還包括藥物，既包括治療藥物或者濫用和可能被濫用的藥物。在授予Ullman等人的美國專利3,996,345中公開的很多藥物可被視為分析物，此專利通過引用結合在此。這些藥物包括但不限于，生物堿、生物堿的代謝物(包括嗎啡、可卡因、酶斯卡靈、麥角酸)、以及合成鴉片。還有其它藥物包括，美沙酮、杜冷丁、安非他明、脫氧麻黃堿、苯乙哌啶酮、苯妥英和所有屬于苯并二氮雜環庚烷(benzdiazocycloheptane)、吩噻嗪、巴比妥酸鹽類別的藥物。其他藥物包括腎上腺素、麻黃素、左旋多巴和降腎上腺素。其他藥物還包括安定藥氨甲丙二酯、Tergitol、例如Ethoxsumide的琥珀酰亞胺。其他藥物還包括四氫大麻酚、大麻醇和相關的衍生物，主要為由大麻、其合成修飾物和代謝物衍生的復合物。其他藥物還包括類固醇的藥物，例如雌激素、助孕素、男性激素、腎上腺皮質激素、膽酸、強心苷、糖苷配基、皂角苷、皂角苷配基。通常情況下，如以上提到的，為了產生抗體，需要對例如類固醇、類固醇、縮氨酸等的一些小分子半抗原化。
盡管上面的討論集中在可根據抗原抗體反應確定為分析物的物質，但術語“分析物”并不視為將用根據本發明的設備和方法來測定的物質的范圍限制于只能根據抗原抗體反應來測定的物質。例如，如果存在可與分析物結合的特異性很好的特異性結合蛋白，則可用該合適的特異性結合蛋白來取代固定在層析條上的抗體、或者是用共軛物標記的抗體。這些特異性結合蛋白包括但不限于作為用來測定維他命B12的一對特異結合蛋白中的一員的內在因子蛋白；用來檢測葉酸的葉酸結合蛋白、作為用來測定碳水化合物的一對特異性蛋白中的一員的血凝素；或用來檢測相對應的細胞分裂素、淋巴激活素、生長因子的細胞分裂素受體、淋巴激活素受體、生長因子受體(例如Interleukin-1受體)。
另外，術語“分析物”還包括核酸，例如DNA或者RNA，只要有適合它們的特異性結合大分子即可。這些合適的特異性結合大分子可以是以序列特異性方式與核酸結合的蛋白，也可以是按照Waston-Crick堿基配對理論與要檢測的序列結合的核酸分子或者是核酸分子的相似物。如果要檢測的核酸有足夠的長度，那么要檢測的核酸可與固定的互補核酸在核酸分子內的一段序列上雜交，然后可在核酸分子內的另一段序列上與帶標記的核酸再進行雜交。該過程一般被稱為“夾心法雜交”，并在授予Manoharan等人的美國專利No.6,825,331中有更詳細的描述，此專利通過引用結合于此。
當在進行雙向測定時向窗口1加樣本，并且向窗口2加緩沖液以在第二方向上流動時，合適的緩沖液與添加到樣本里的樣本或任何試劑在pH值和離子強度方面相兼容。緩沖液不能與樣本中的任何分析物或大分子發生反應。合適的緩沖液包括但不限于磷酸鹽緩沖液、林格液(Ringer’s solution)、漢克液(Hank’s solution)或者(tris)hydroxymethylaminomethane(TrisTM)緩沖液。在向窗口1加緩沖液時可使用同一類型的緩沖液來預濕層析條，并向窗口2加樣本。
表1窗口2中膜的選擇的一覽表

工業實用性本發明可有利地應用于包括床邊檢測(POC)設備的診斷設備方面，例如醫生辦公室、診所或者是戰場，用來測定樣本中包含或者不包含細胞(比如紅細胞、白細胞或者其他細胞類型)的分析物的存在和量。本發明的材料和方法在檢測一些疾病因子或者抗體中有用途，包括HIV、HAV、HBV、HSV、CMV、SARS、疫苗病毒和其他一些分子，包括例如deoxypyrodinoline(一種骨骼吸收標記物)、人血清蛋白、亂用藥物、違禁藥物、蛋白標記物(例如前列腺特異性抗原(PSA)、例如L-乳酸脫氫酶的腎臟疾病蛋白、例如人體絨(毛)膜促性腺激素(HCG)的懷孕或者生育能力相關的激素、以及尿道感染標記物。血液攜帶的分析物的測定特別適于本發明，例如治療藥物、激素、諸如前列腺特異性抗原(PSA)的癌癥標記物、心肌標記物(包括肌鈣蛋白-I、肌鈣蛋白-T、肌酸激酶同功酶(CK-MB)、α胎蛋白)。另外，樣本可以是全血樣本。因此，雖然本發明的設備和方法適于測定各種體液，包括尿液、唾液、汗液或者其他黏液，但它特別適于測定那些含有紅細胞的測試液和測定只有很少量的樣本，例如采自手指的血。
示例旨在僅僅例示本發明，因此不應視為以任何方式來限制本發明的示例說明和詳述了本發明的上述詳細方面和實施例。這些示例并不代表以下試驗是所有或者唯一操作過的試驗。我們已經努力保證試驗數據的準確性(例如數量、大小等等)，但是應該考慮到一些試驗的誤差和偏差。
盡管已參照具體實施例描述了本發明，但那些本領域技術人員應該明白在不背離本發明的真實精神和范圍的情況下，可進行各種各樣的改動并可替代等效方案。另外，可進行許多修改以使具體情況、原料、實物組成、過程、過程步驟適于本發明的目的、精神或范圍。但所有這些修改旨在處于本發明權利要求的范圍之內。
為了找到最好的材料和條件以進行對包含細胞的樣本(比如含有紅細胞的全血樣本)中的分析物作出測定或定量的側向流測定，包括確定用來過濾樣本中細胞或液體(例如血漿)的膜和膜的組合，使用在美國專利NO.6,136,610和美國專利No.6,528,323中描述的和并如在本文中做了改進的儀器(“ReLIA”)和檢測盒進行以下實驗。
示例一在沒有凝集素的情況下膜的過濾性能如圖2所示的測試帶采用不同膜作為樣本過濾器。所有測試的過濾膜都從美國Ahlstrom Filtration公司購買并包括111級纖維素吸收劑，#141級和#142級玻璃纖維，1660、1661、1662和1663級Cytosep。如圖1所示，含全血的樣本被加到窗口1。血漿在硝基纖維素層析條上的流動速度可被觀察記錄。結果如表2所列。
表2沒有人紅細胞抗體的濾血膜

例二用抗-人紅細胞抗體預處理后的膜的濾血能力將1克土溫20(TWEEN20)加到9ml的去離子水中，將溶液混勻，在室溫下存儲大概一周，可配制成10％的土溫20(TWEEN20)溶液。
在1.35升的去離子水里加入9.0825克的三(羥甲基)氨基甲烷(Trizma Base)(最終濃度為6.055克/升)，1.7625ml的HCL(最終濃度為1.7625毫升/升)以及1.8克的乙二胺四乙酸二鈉(EDTA.Na2)(最終濃度為1.2克/升)，可配制成兔抗人紅細胞抗體溶液。緩慢地攪拌混合物大約一個小時直到所有加入的化學試劑都完全溶解。配制好的溶液放在室溫下儲存4個小時，或者在4℃下過夜。向溶液里添加鹽酸將溶液pH值調節到pH8.5±0.1。在溶液里加兔抗人紅細胞抗體(anti-hRBC)直到最終濃度為大約0.25毫克/毫升。將0.3毫升的10％濃度的土溫20(TWEEN20)加入到anti-hRBC直到最終濃度為0.002％。將最終配制好的溶液在4℃存放24小時。用anti-hRBC處理每種可能用作樣本過濾器的不同膜，并以圖2所示的配置來測試它們過濾加到窗口1的新鮮的人全血樣本的能力。結果記錄在表3中。
表3經抗人紅細胞抗體預處理后的濾血膜


表三(繼續)

實驗結果顯示不同的膜在結合諸如anti-hRBC抗體的凝集素一起使用時，可用來過濾紅細胞，并且50μl的樣本量足以檢測。
示例三使用全血和使用血漿之間的對比準備如示例二的測試帶，并將全血或血漿樣本加入窗口1的樣本過濾器，且比較結果，如表4所示。
表4 全血和血漿的測試結果的比較

實驗結果顯示無論是全血還是血漿樣本都可使用本發明的測試帶，兩者都可得到基本上一致的定量結果。
示例四不同的膜作為樣本過濾器用于在窗口2加樣的比較在這個示例中，構建了如圖2所示的測試帶，但是用從以下膜中選擇的一種或兩種樣本過濾器替換了圖2的緩沖液墊美國Ahlstrom Filtration公司的1661級Cytosep(“1661”)、1660級Cytosep(“1660”)、#142級玻璃纖維(“142”)、#141級玻璃纖維(“141”)、或者111級纖維素(“111”)。這些樣本過濾器都已經測試過它們過濾紅細胞的能力。同樣還使用了Millpore公司生產的共軛物墊以及硝基纖維素膜，如圖2所示。向窗口2加入一定量的血液樣本。表5上示出的結果顯示Cytosep 1661、#141級玻璃纖維、#142級玻璃纖維都能過濾樣本，以允許血漿滲透到硝基纖維素膜上，同時發現#141級玻璃纖維、#142級玻璃纖維所需的過濾時間最短。
表5 不同膜單獨用作樣本過濾器的比較

注“-”是指沒有血漿濾出和遷移到硝基纖維素膜。
表6 雙層過濾樣本的不同膜的比較

表6中示出的結果顯示所測試的所有膜的組合都允許血漿以不同的速度從組合的樣本過濾器里濾出。
示例5在窗口2加樣時#141和#142級玻璃纖維作為樣本過濾器的測試在這個示例中，構建了如圖2所示的測試帶，不同之處在于圖2中示出的緩沖液墊被樣本過濾器所替代，用于加樣。本實驗中所使用的樣本過濾器是單層玻璃纖維膜，使用之前用0.5毫克/毫升的兔抗人紅細胞抗體(中國安康生物生產，簡稱anti-hRBC)或者鼠抗人紅細胞抗體預處理(由星號*標志)的#141級或者#142級膜。而且，共軛物墊(CP)和玻璃纖維膜一起測試。CP預先用0.5毫克/毫升的兔抗人紅細胞抗體(“anti-hRBC”)、或鼠抗人紅細胞抗體預處理，或不作預處理。硝基纖維素膜(“NC”)如前所述地使用。向窗口2加特定量的全血樣本(200微升)。
實驗結果如表7所示。
實驗結果顯示所測試的所有膜，不管是單獨的CP墊(共軛物墊，下同)還是#141或者#142與CP墊的組合，無論是否用人抗紅細胞預處理過或沒有預處理過，都能允許血漿濾出到NC膜(硝基纖維素，下同)上。血漿滲透到NC的時間過程，對于#141*+CP墊*的組合為大約124秒，對于#142*+CP墊*的組合為大約126秒，對于#141*+CP墊的組合為大約130秒，對于#142*+CP墊的組合為大約140秒。從單一的CP墊濾出的時間為大約138秒。最好的過濾/遷移結果為#142+CP墊的組合。
如果只有CP墊，則紅細胞可相對比較快地從CP墊里泄漏，約需159秒，并且在實驗開始30分鐘之后可很明顯地在NC膜上觀察到。相反，在對#142*+CP墊組合的實驗過程中，宏觀上紅細胞的泄漏不明顯；對于這種組合，在實驗開始后30分鐘的時間點，在NC膜上宏觀上紅細胞的泄漏不明顯。相比較而言，#141*+CP墊*的組合的效果略差，紅細胞泄漏大約需要1350秒(22.5分鐘)，并且在30分鐘的時間點宏觀上一些紅細胞可在NC膜上明顯觀察到。
再作進一步的比較，#142*+CP墊的組合效果也較差，其中CP墊未用抗紅細胞抗體作預處理，在約1150秒(19.2分鐘)紅細胞開始從這些過濾器中濾出，實驗開始之后的30分鐘點可在NC膜上看到一些紅細胞。對于#141膜*+CP墊的組合，在680秒(11.3分鐘)上可觀察到有紅細胞漏出，并且可在NC膜上看到一些紅細胞。在這個實驗中，血漿在所測試的所有膜上的流動速度都大于16毫米/分鐘。
表7膜的組合在過濾紅細胞中的比較

注“*”表示用0.5毫克/毫升的兔抗人紅細胞抗體(鼠抗人紅細胞抗體)預處理。
“-”表示加血樣后30分鐘內無紅細胞泄漏到測試窗口示例1-5的實驗結果表明當把樣本加到窗口2時，單層膜的孔徑不是決定該膜是不是適合作為分析物的樣本過濾器的決定因素。在所測試的膜中，纖維素111的孔徑最小為1微米(見表1)，并且能使紅細胞不漏出(表5)。然而，如表5所示，血漿不能從膜中濾出。CytoSep 1660膜和玻璃纖維膜#141的孔徑均為3微米(見表1)，但是血漿從玻璃纖維膜#141中濾出、但卻不能從CytoSep 1660膜中濾出。區別在于，玻璃纖維膜是疏水性的，而CytoSep 1660的疏水性則較弱而親水性較強。
類似地，與上面的假設一致，即孔徑并不是決定某種膜是否可作為過濾器的決定因素，玻璃纖維膜#141的孔徑為3微米，小于玻璃纖維膜#142的孔徑為6微米，然而血漿從較小孔徑膜#141中濾出的速度更快，即為90秒，而相比之下對于較大孔徑膜#142則為98秒(表5)。紅細胞從#141膜濾出得比#142膜快，即280秒對395秒。血漿的遷移速度對#141膜(16.8毫米/分)而言比#142(16.1毫米/分)膜快。
使用兩個樣本過濾器而不是一個可減緩血漿在玻璃纖維膜中的遷移速度，從約16毫米/分(表5)降低到約1.95毫米/分到約5.87毫米/分的范圍(表6)。紅細胞仍然可從這些雙層過濾器中濾出(表6)。對于#141+#141的組合，紅細胞需要1015秒(16.9分鐘)濾出到NC膜上；血漿需要135秒(2.3分鐘)濾出(表6)。對于#142+#141的組合，當#142膜在#141膜之上的時候，紅細胞濾出需要686秒(11.4分鐘)，但是血漿濾出則需要更長的時間，為640秒(10.7分鐘)(表6)。對于#141+#142膜的組合，當#141膜在#142膜之上的時候，血漿更快地濾出，只需要113秒(1.9分鐘)，紅細胞濾出的速度也快得多，為238秒(約4分鐘)(表6)。
當抗人紅細胞anti-hRBC抗體與任一種所測試的樣本過濾器膜(表3)一起使用時，所有所測試的膜都表現出良好的過濾紅細胞的能力，因為在30分種內沒有明顯的紅細胞泄漏。在NC膜上的背景噪聲也低。血漿的遷移速度低于16毫米/分。對于CytoSep 1663膜，血漿過濾不明顯。這樣就有可能采用用抗紅細抗體胞預處理過的#142玻璃纖維膜去定量分析含有HIV抗體的血液(表3)。表3也示出50微升的樣本大小足以從測定中獲得定量結果。
#141*+CP墊的組合(表7)，其中#141膜用抗紅細胞抗體進行了預處理，在濾出紅細胞方面表現比單獨使用沒有預處理過的#141膜好(表5)。類似地，#142*+CP墊的組合在濾出紅細胞方面表現比單獨使用沒有預處理過的#142膜好。在這個實驗里，#142*+CP墊的組合在濾出紅細胞和血漿方面是最有效的。
示例六血液樣本中存在抗凝劑時測試血漿和紅細胞過濾的效率在本實驗里玻璃纖維膜#142用做樣本過濾器。如前所述，用0.25毫克/毫升的兔抗人紅細胞抗體對#142膜進行預處理。然后再用抗凝劑(1.5毫克/毫升的乙二胺四乙酸二鈉、3.5毫克/毫升的檸檬酸三鈉、或者0.1毫克/毫升的肝素鈉)進行預處理該膜，或者不進行預處理也可以。血液樣本在加樣到樣本過濾器前也同樣用抗凝劑(1.5毫克/毫升的乙二胺四乙酸二鈉、3.5毫克/毫升的檸檬酸三鈉、或者0.1毫克/毫升的肝素鈉)做預處理或者不進行預處理。血液樣本如上所述地加到窗口2的樣本過濾器上。實驗結果如表8和表9所示。
表8 #142上沒有抗凝劑時過濾血漿的效率

表9#142上有抗凝劑的過濾血漿的效率


實驗結果顯示在雙向流測定中，是在血液樣本中還是在樣本過濾器中填加抗凝劑并不影響血漿過濾效率。
示例七定量測定中紅細胞容積的影響以下實驗是為了確定紅細胞容積對側向停止流動測定是否有影響而進行的。乙肝表面抗原呈陽性、所測血細胞比容為44％的全血樣本被分裝為每管1毫升。把這些分裝管的紅細胞容積都看成是100％。同一個血液樣本進行15分鐘的800×g的旋壓，通過取出或加入血漿后血細胞比容增加或減少40％。用0.5毫克/毫升的鼠抗人紅細胞抗體對玻璃纖維膜#142進行預處理，并將其用做乙肝表面抗原檢測盒的窗口2上的樣本過濾器。向窗口2中的樣本過濾器加樣以進行側向流測定。該側向流測定如上所述地進行。在該配置中，測試帶中樣本過濾器的下面設置有一液體收集器，如圖3所示，其中該液體收集器由一層類似共軛物墊的玻璃纖維膜組成，但是卻沒有共軛物墊的用膠體金標記的抗原或抗體。試驗結果如表10所示。
表10 紅細胞容積在HBsAg定量測定中的影響


某一特定血漿容積的乙肝表面抗原濃度在4次獨立測定中確定，并取其平均值以產生均值1。將所測試的不同血漿容積的每一個中乙肝表面抗原的平均濃度再取平均值，得到均值2。所觀察到的變化系數(CV)值小于5％，表明不同紅細胞容積對測定結果幾乎沒有影響。
類似地，來自促甲狀腺激素(TSH)異常病人的全血樣本，經放射性免疫測試時促甲狀腺激素的濃度為28μlU/ml，測得血細胞比容為44％，將該全血樣本分裝成每管1毫升。視這個紅細胞容積為100％。同一個血液樣本進行15分鐘800×g的旋壓，通過取出或加入血漿后來紅細胞容積增加或減少40％。用0.5毫克/毫升的鼠抗人紅細胞抗體對玻璃纖維膜#142進行預處理，并將其用作促甲狀腺激素測試盒中窗口1和窗口2上的樣本過濾器。按照表11所指定的量，首先向窗口1加樣，然后向窗口2加樣。在這個例子里，每個樣本用同批測試盒平行檢測4次，并且如圖3所示，在每條測試帶的樣品過濾器的下方設置有液體收集器，此液體收集器由一層類似共軛物墊的玻璃纖維膜組成，但是卻沒有共軛物墊的用膠體金標記的抗原或抗體。
表11 紅細胞容積在促甲狀腺定量測定中的影響


某一特定血漿容積的促甲狀腺濃度在5次獨立測定中確定，并取其平均值為均值1。將所測試的不同血漿容積的每一個的促甲狀腺平均濃度再取平均值，得到均值2。所觀察到的變化系數(CV)值小于8％，表明不同紅細胞容積上對TSH測試結果幾乎沒有不同。
示例八 紅細胞容積在定量測定中的影響以下試驗是為了驗證紅細胞的存在是否會影響雙向側向流測定中的定量或定性檢測的準確度而進行的。HIV陽性的全血樣本分裝成每管1毫升，樣本的血細胞比容為45.3％。將該紅細胞容積視為100％。同一個血液樣本進行15分鐘800×g的旋壓，通過取出或加入血漿后紅細胞容積增加或減少40％。用0.25毫克/毫升的兔抗人紅細胞抗體對玻璃纖維膜#142進行預處理，將其用作HIV測試盒中窗口1上的樣本過濾器。試驗結果記錄在表12中。
表12 紅細胞容積對HIV測定的影響

對高濃度對照帶、低濃度對照帶和測試帶報告的結果是反射密度(DR)。結果顯示紅細胞的存在對信噪比沒有明顯影響(S指信號，CO指截止值)。在非定量測定，即定性測定中，信噪比＞1意味著陽性，因為截止值(CO)是由大量陰性樣本的平均值決定的。當在雙向流測定中樣本加到窗口1上用anti-hRBC預處理的#412膜時，這代表與施加血漿樣本相比施加全血樣本時HIV測試上的背景(在HIV測試中)。測試帶被測試為作為所使用基本度量的RI(定量的相對反射密度)。為了避免同一批次產品的測試盒間的差，對照帶(高對照帶和低對照帶)之一的反射密度值(Dr)被用來計算測試帶的RI，公式如下RI(測試帶)＝測試反射密度值(Test Dr)/高對照帶(HC Dr)或低對照帶(LC Dr)。這提供了更好的重復性，這是因為測試帶和高低對照帶上的變化由RI來平衡。
示例九膠體金涂敷方法對測定精度的影響為了確定將共軛物涂敷在共軛物墊上的不同涂敷方法的效果，下面的實驗用清洗涂敷過程或者Bio-Jet噴射涂敷方法使用用膠體金標記的人抗IgG、或者膠體金標記的乙型肝炎表面抗體涂敷的共軛物墊進行。將0.25毫克/毫升的兔抗人紅細胞預處理過的玻璃纖維膜#142用作樣本過濾器，用清洗或者Bio-Jet噴射法涂敷在玻璃共軛物墊(Pall Specialty Materials)上的膠體金標記的人抗IgG或者膠體金標記的乙肝表面抗體可從Pall Specialty獲得。實驗在HIV測試盒中用HIV陽性全血來進行，并在乙肝表面抗原測試盒中用HBsAg全血來進行。對乙肝表面抗原測定(如示例七所述)在窗口2上的樣本過濾器上添加血液樣本，對于HIV測定(如示例三所述)在窗口1的樣本過濾器上添加血液樣本，測定操作如上所述地進行，實驗結果在表13和14中示出。
表13HIV測試(用清洗或者Bio-Jet噴射涂敷的共軛物)

表14HBsAg測試(用清洗或者Bio-Jet噴射涂敷的共軛物)

Dr代表的是反射密度，它和光密度值(OD)的計算方法一樣，不同的是DR指的是光反射密度。DR值是由ReLIA儀器生成的原始數據。對于清洗或者Bio-jet噴射涂敷的共軛物的有關ng/ml的CV值都一樣，所以測試精度也一樣。
示例十樣本量對測定的影響。
為了確定樣本量對本測定的精度的影響，進行了以下實驗。在窗口1上用0.25毫克/毫升的兔抗人紅細胞預處理過的玻璃纖維膜#142被用作樣本過濾器。血細胞容積為45.3％的HIV陽性全血樣本被添加到HIV測試盒中。血細胞比容為44％的乙肝表面抗原陽性全血樣本被添加到HBsAg測試盒中。向窗口2上的樣本過濾器添加變化的樣本量。測定如前所述地進行。簡而言之，通過向窗口1加樣來進行對全血的HIV測定。窗口1中的樣本過濾器由用0.25毫克/毫升的兔抗人紅細胞預處理過的玻璃纖維膜#142組成。當樣本在測試帶上往下流并停止時，向窗口2加緩沖液。實驗結果記錄在表15中。
表15變化血樣量的HIV測試的比較

在該HIV檢測實驗中，樣本量的范圍為30微升-70微升。30微升的樣本量沒有產生任何可讀實驗結果。超過30微升的樣本量則可產生可讀實驗結果。40微升的樣本量，無論實驗是持續20分鐘還是30分鐘，都可獲得可讀結果。無論樣本量為多少，NC膜上的背景都是干凈的。因此，40微升的樣本量足夠進行測定，而且實驗結果與50、60或者70微升的樣本量的結果沒有明顯的不同。
表16 HBsAg檢測中不同測定時間內變化樣本量的比較

來自乙肝表面抗原HbsAg檢測的結果顯示150微升的樣本量產生了高的CV值。對于超過150微升的樣本量，例如200微升、250微升、300微升，在20分鐘的實驗中CV值處于6％-9％的比較低的范圍；在30分鐘的實驗中CV值為3％-9％；在40分鐘的實驗中CV值為4％到19％。對于250微升的樣本量，無論實驗時間是20、30、還是40分鐘，CV值都低于處于4％到6％的比較低的范圍。因此250微升的樣本量足夠進行實驗，但是如果實驗時間為20分鐘或30分鐘，則200微升、250微升、300微升的樣本量的實驗結果沒有明顯的差異。如果實驗時間為40分鐘而非20分鐘或者30分鐘，則200微升的實驗CV值(19％)較高。
以上提到的一般形式的若干可選方案，例如吸收墊的放置、使用或者不使用樣本過濾器或者其對樣本墊的代替、使用或者不使用凝集素、用親水性膜取代疏水性膜、在共軛物墊或者測試帶本身上涂敷可檢測試劑、或者省略在測試帶上涂敷可檢測試劑、使用或略去緩沖液墊，或者共軛物墊的放置，都可以應用到特定形式中，如圖2、3、4、8、9、10或11所示，只要這些可選方案的變化與這些特定形式的配置保持一致即可。
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權利要求
1.一種用于側向流測定的測試帶，所述側向流測定用于檢測或定量含液體樣本中的至少一種分析物，所述測試帶包含(a)第一膜，其中所述第一膜包括樣本過濾器，并且所述樣本過濾器包括第一孔徑和可任選的第一粘合劑；(b)可任選地，第二膜，其中所述第二膜包括第一液體收集器，并且所述第一液體收集器包括第二孔徑，其中所述第二膜，如果存在的話，與所述第一膜成毛細作用接觸；(c)可任選地，第三膜，其中所述第三膜包含共軛物墊，并且所述共軛物墊，如果存在的話，直接或間接地與層析條成毛細作用接觸，且其中所述共軛物墊包括至少一種可流動的可檢測試劑，并且所述至少一種可流動的可檢測試劑是第一可流動的可檢測試劑；(d)第四膜，其中所述第四膜包括層析條，所述層析條包括第一端和第二端、至少一個捕獲帶、至少一個可任選地包含對照劑的對照帶、以及可任選的至少一個可流動的可檢測試劑，其中所述至少一個可流動的可檢測試劑是第二可流動的可檢測試劑，其中所述至少一個捕獲帶包含用于捕獲至少一種分析物的固定捕獲試劑，其中所述層析條允許液體從第一端向第二端、或從第二端向第一端的側向流動，并且其中所述層析條與所述第一、第二或第三膜的至少之一成直接或間接地毛細作用接觸；(e)可任選地，第五膜，包括用于施加樣本、緩沖液、或試劑的緩沖液墊，其中所述第五膜，如果存在的話，與所述第四膜成毛細作用接觸、并可任選地包含第二粘合劑；(f)第六膜，其中所述第六膜包含第一吸收墊，并且所述第一吸收墊與所述層析帶成直接或間接地毛細作用接觸；(g)可任選地，第七膜，其中所述第七膜包括第二吸收墊，并且所述第二吸收墊，如果存在的話，與第六膜成毛細作用接觸；以及(h)可任選地，第八膜，其中所述第八膜包括第二液體收集器，并且所述第二液體收集器，如果存在的話，與所述第四膜和第五膜，如果存在的話，成毛細作用接觸；以及其中所述測試帶被配置成允許樣本中至少一種分析物的檢測或定量，并且所述樣本包含紅細胞。
2.如權利要求1所述的測試帶，其特征在于，所述測試帶包含所述第二膜，并且第二孔徑與第一孔徑的比小于約20并大于約1。
3.如權利要求2所述的測試帶，其特征在于，第二孔徑與第一孔徑的比小于約10。
4.如權利要求2所述的測試帶，其特征在于，第二孔徑與第一孔徑的比約為7。
5.如權利要求1所述的測試帶，其特征在于，所述測試帶包括所述第二膜，并且其中所述第一膜的至少一部分置于所述第二膜之上。
6.如權利要求1所述的測試帶，其特征在于，所述測試帶包括所述第二膜和共軛物墊，并且所述第一膜通過所述第二膜與所述共軛物墊成毛細作用接觸、但不與所述共軛物墊物理接觸。
7.如權利要求1所述的測試帶，其特征在于，所述測試帶包含所述第五膜，并且所述第五膜包含第二粘合劑。
8.如權利要求1所述的測試帶，其特征在于，所述第一吸收墊與所述第五膜成直接或間接地毛細作用接觸。
9.如權利要求1所述的測試帶，其特征在于，所述測試帶包括所述第五膜，所述第五膜包含所述第二粘合劑，并且其中所述測試帶被配置成將樣本施加至所述第五膜、并將緩沖液施加至所述第一膜。
10.如權利要求1所述的測試帶，其特征在于，所述第一膜包含所述第一粘合劑，所述測試帶包含所述第五膜，并且其中所述測試帶被配置成將樣本施加至所述第一膜、并將緩沖液施加至所述第五膜。
11.如權利要求1所述的測試帶，其特征在于，所述測試帶包含所述第五膜，所述第一和第五膜分別包含所述第一和第二粘合劑，并且其中所述測試帶被配置成將樣本施加至所述第一和第五膜。
12.如權利要求1所述的測試帶，其特征在于，所述測試帶被配置成以圖6所示的方式工作。
13.如權利要求1所述的測試帶，其特征在于，所述測試帶被配置成以圖7所示的方式工作。
14.如權利要求1所述的測試帶，其特征在于，所述第六或第七膜置于毗鄰所述樣本過濾器、并置于與所述緩沖液墊相對的一側上。
15.一種用于側向流測定的測試帶，所述側向流測定用于檢測含液體樣本中的至少一種分析物，所述測試帶包含(a)包括樣本過濾器的第一膜，其中所述樣本過濾器可任選地包含粘合劑；(b)包括層析條的第二膜，其中所述層析條包含第一端和第二端、至少一個包含用于捕獲至少一種分析物的固定捕獲試劑的捕獲帶、至少一個對照帶、以及可任選的第一可流動的可檢測試劑，其中所述層析條支撐液體從第一端向第二端或從第二端向第一端的側向流動，并且其中所述層析條與所述樣本過濾器成毛細作用接觸；(c)可任選地，包括共軛物墊的第三膜，其中所述共軛物墊包含第二可流動的可檢測試劑，并且所述共軛物墊，如果存在的話，與所述層析條成毛細作用接觸；(d)包括緩沖液墊的第四膜，其中所述緩沖液墊與所述共軛物墊或所述層析條成毛細作用接觸；(e)包括第一吸收墊的第五膜；(f)可任選地，包括第二吸收墊的第六膜；以及(g)可任選地，包括第一液體收集器的第七膜；其中所述測試帶被配置成允許對樣本中至少一種分析物的檢測或定量，并且所述樣本包含紅細胞。
16.如權利要求1或15所述的測試帶，其特征在于，所述樣本過濾器、第一液體收集器、第二液體收集器、共軛物墊或第五膜，如果存在的話，包含玻璃纖維材料。
17.如權利要求1或15所述的測試帶，其特征在于，所述第一膜完全位于所述第二膜上。
18.如權利要求1或15所述的測試帶，其特征在于，所述測試帶包含共軛物墊，并且其中所述共軛物墊接收來自所述樣本過濾器的液體、并與所述層析條重疊一足以使液體從所述共軛物墊流向所述層析條的距離。
19.如權利要求1或15所述的測試帶，其特征在于，所述測試帶包括第一液體收集器，并且所述第一液體收集器與所述層析條重疊一足以使液體從所述樣本過濾器流向所述層析條的距離。
20.如權利要求1或15所述的測試帶，其特征在于，所述樣本過濾器包含所述第一粘合劑。
21.如權利要求20所述的測試帶，其特征在于，所述第一粘合劑從由凝集素和抗-血細胞抗體組成的組中選擇。
22.如權利要求21所述的測試帶，其特征在于，所述抗-血細胞抗體是抗-帶3抗體或抗血型糖蛋白抗體。
23.如權利要求1或15所述的測試帶，其特征在于，所述樣本過濾器能在樣本中使液體與細胞分離。
24.如權利要求23所述的測試帶，其特征在于，所述細胞是紅細胞。
25.如權利要求1或15所述的測試帶，其特征在于，所述捕獲試劑是特異性結合所述分析物的抗體或抗原。
26.如權利要求1或15所述的測試帶，其特征在于，所述層析條包含至少兩個對照帶。
27.如權利要求1或15所述的測試帶，其特征在于，所述層析條包含硝基纖維素膜。
28.如權利要求1或15所述的測試帶，其特征在于，所述層析條包含熔合在一起的聚合體的微粒。
29.如權利要求28所述的測試帶，其特征在于，所述聚合體是聚乙烯。
30.如權利要求1或15所述的測試帶，其特征在于，所述第一或第二可流動的可檢測試劑包含從由以下物質組成的組中選擇的試劑金、有色試劑、熒光試劑、化學發光試劑、生物發光試劑，以及可與另一種試劑組合以產生顏色、熒光、化學發光或生物發光的試劑。
31.如權利要求30所述的測試帶，其特征在于，所述可流動的可檢測試劑包含膠體金。
32.如權利要求1或15所述的測試帶，其特征在于，所述第一或第二可流動的可檢測試劑包含抗體或抗原。
33.如權利要求1或15所述的測試帶，其特征在于，所述測試帶以如圖2、3、3、4、5、8或9中之一所示的方式配置。
34.如權利要求1或15所述的測試帶，其特征在于，所述測試帶包含所述第三膜。
35.如權利要求1或15所述的測試帶，其特征在于，所述測試帶沒有所述共軛物墊，并且所述層析條包含第二可流動的可檢測試劑。
36.如權利要求1或15所述的測試帶，其特征在于，所述測試帶被配置成支撐單向或雙向液體流動。
37.如權利要求36所述的測試帶，其特征在于，所述測試帶被配置成支撐單向流動。
38.如權利要求37所述的測試帶，其特征在于，所述測試帶被配置成使單向流動是停流。
39.如權利要求37所述的測試帶，其特征在于，所述測試帶被配置成使單向流動是逆流。
40.如權利要求36所述的測試帶，其特征在于，所述測試帶被配置成支撐雙向流動。
41.如權利要求1或15所述的測試帶還包含支撐測試帶的襯墊。
42.如權利要求41所述的測試帶，其特征在于，所述襯墊包含液體不可滲透的襯墊。
43.如權利要求1或15所述的測試帶，其特征在于，所述層析膜是高容量蛋白結合膜。
44.如權利要求15所述的測試帶，其特征在于，所述緩沖液墊懸突于共軛物墊之上。
45.如權利要求15所述的測試帶，其特征在于，所述測試帶被配置成如圖2所示。
46.如權利要求1或15所述的測試帶，其特征在于，所述樣本包含兩種分析物，并且所述層析條包含兩個分離的捕獲帶，每個捕獲帶都包含固定的捕獲試劑，所述固定的捕獲試劑專用于捕獲一種分析物但不是另一種。
47.如權利要求1或15所述的測試帶，其特征在于，所述樣本包含三種分析物，并且所述層析條包含三個分離的捕獲帶，每個捕獲帶都包含固定的捕獲試劑，所述固定的捕獲試劑專用于捕獲一種分析物但不是另兩種。
48.如權利要求1或15所述的測試帶，其特征在于，所述分析物是從以下物質組成的組中選擇的分析物抗原、抗體、激素、藥物、細胞蛋白、DNA、心臟標記物、腫瘤標記物、配體、受體和自身免疫疾病標記物。
49.如權利要求48所述的測試帶，其特征在于，所述分析物是抗原，并且所述抗原是與感染性試劑相關聯的抗原。
50.如權利要求49所述的測試帶，其特征在于，所述感染性試劑是從病毒、細菌、真菌、或蛋白感染素組成的組中選擇的。
51.如權利要求50所述的測試帶，其特征在于，所述感染性試劑是病毒，并且其中所述病毒是從包含HIV、甲型、乙型、丙型、丁型肝炎病毒、單純瘡疹病毒、細胞巨化病毒(CMV)、絨毛狀瘤病毒、埃博拉病毒、SARS病毒、鼻病毒、和牛痘病毒的組中選擇的。
52.如權利要求50所述的測試帶，其特征在于，所述感染性試劑是細菌，并且所述細菌是從由革蘭氏陽性細菌和革蘭氏陰性細菌中選擇的。
53.如權利要求52所述的測試帶，其特征在于，所述細菌是從由炭疽芽孢桿菌、大腸桿菌、幽門螺旋桿菌、鼠疫桿菌、沙門氏菌類和志賀氏菌屬類組成的組中選擇的。
54.如權利要求48所述的測試帶，其特征在于，所述分析物是從包含hCG、甲狀腺素、TSH的組中選擇的激素。
55.如權利要求48所述的測試帶，其特征在于，所述分析物選自包含腫瘤標記物、心臟標記物、和自身免疫疾病標記物的組。
56.如權利要求55所述的測試帶，其特征在于，所述分析物是腫瘤標記物，并且所述腫瘤標記物是從包含前列腺特異性抗原、癌胚抗原和α-胎蛋白的組中選擇的。
57.如權利要求48所述的測試帶，其特征在于，所述分析物是細胞蛋白。
58.如權利要求48所述的測試帶，其特征在于，所述分析物是心臟標記物，并且所述心臟標記物是從包含以下物質的組中選擇的肌鈣蛋白I、肌鈣蛋白T、肌酸激酶MB同功酶(CK-MB)、肌紅蛋白、C反應蛋白(CRP)、脂肪酸結合蛋白(FABP)、糖原磷酸化酶同功酶BB(GPBB)、B型利鈉肽(BNP)和Pro-BNP。
59.如權利要求1或15所述的測試帶，其特征在于，所述樣本過濾器在結合粘合試劑之前用清潔劑預處理。
60.一種用于側向流測定的測試帶，所述側向流測定用于檢測樣本中的至少一種分析物，所述測試帶包含(a)具有第一端和第二端的層析條，所述測試帶包括用于捕獲分析物的捕獲帶；(b)與所述層析條的第一端可操作接觸的液體傳遞元件，所述液體傳遞元件從包含樣本墊和第一樣本過濾器的組中選擇，所述液體傳遞元件被放置成使施加到所述液體傳遞元件的液體流過所述液體傳遞元件并被施加到所述層析條；(c)至少一個與所述液體傳遞元件可操作接觸的吸收墊；(d)可任選地，與所述層析條的第二端可操作接觸的共軛物墊，所述共軛物墊包含所述分析物的帶標記的特異性結合配偶體；(e)與所述共軛物墊，如果存在的話、或者與所述層析條的第二端，如果不存在所述共軛物墊的話，有效接觸的液體收集器，以使施加到所述液體收集器的液體流過所述液體收集器并流至所述共軛物墊，如果存在的話、或流至所述層析條的第二端，如果共軛物墊不存在的話；(f)與所述液體收集器可操作接觸的第二樣本過濾器，以使流經第二樣本過濾器的液體被施加到所述液體收集器；以及(g)可任選地，與所述層析條的一側相接觸的襯墊，所述襯墊被設置成使液體能無障礙地從與所述層析條第一端可操作接觸的液體傳遞元件、和從與所述層析條第二端可操作接觸的液體收集器或共軛物墊流入所述層析條。
61.如權利要求60所述的測試帶，其特征在于，所述液體傳遞元件是第一樣本過濾器。
62.一種用于側向流測定的測試帶，所述側向流測定用于檢測樣本中的至少一種分析物，所述測試帶包含(a)具有第一端和第二端的層析條，所述測試帶包含用于捕獲分析物的捕獲帶；(b)與所述層析條的第一端有效接觸的第一樣本過濾器，所述第一樣本過濾器被放置成使施加到所述第一樣本過濾器的液體流經所述第一樣本過濾器并被施加到所述層析條；(c)至少一個與所述第一樣本過濾器的至少一部分可操作接觸的吸收墊，從而所述至少一個吸收墊能在層析條的第一端從所述層析條中抽出液體，所述液體經由所述樣本過濾器被抽回；(d)可任選地，與層析條的第二端可操作接觸的共軛物墊，所述共軛物墊包含所述分析物的可流動的帶標記特異性結合配偶體；(e)與所述共軛物墊，如果存在的話、或者與所述層析條的第二端，如果不存在所述共軛物墊的話，可操作接觸的液體收集器，以使施加到所述液體收集器的液體流過液體收集器并流至所述共軛物墊，如果存在的話、或流至所述層析條的第二端，如果共軛物墊不存在的話；(f)與所述液體收集器可操作接觸的第二樣本過濾器，以使流經所述第二樣本過濾器的液體被施加到所述液體收集器；以及(g)可任選地，與所述層析條的一側相接觸的襯墊，所述襯墊被設置成使液體能無障礙地從與所述層析條第一端可操作接觸的第一樣本過濾器、和從與層析條第二端可操作接觸的液體收集器或共軛物墊流入層析條。
63.如權利要求62所述的測試帶，其特征在于，所述分析物的可移動的帶標記的特異性結合配偶體位于所述層析條內并毗鄰所述層析條的第二端，從而它可被流經所述液體收集器的液體移動。
64.一種用于側向流測定的測試帶，所述側向流測定用于檢測樣本中的至少一種分析物，所述測試帶包含(a)包含第一端和第二端的層析條、至少一個包含用于捕獲至少一種分析物的固定捕獲試劑的捕獲帶、以及至少一個包含用于確定非特異性結合的固定對照試劑的對照帶；(b)共軛物墊，其中所述共軛物墊與所述層析條的第二端成毛細作用接觸，以及其中所述共軛物墊包含固定的可檢測試劑，所述可檢測試劑能結合至少一種分析物或在捕獲所述分析物后結合所述捕獲試劑；(c)在靠近第二端的一側上毗鄰所述共軛物墊的樣本過濾器，其中所述樣本過濾器可任選地包含粘合試劑，并且所述樣本過濾器與所述層析條成毛細作用接觸；(d)可任選地，液體收集器，如果存在的話，位于所述樣本過濾器和所述層析條之間；(e)可任選地，置于所述層析條第一端處、并與所述層析條成毛細作用接觸的緩沖液墊；(f)置于所述層析條第一端處、并與所述層析條成直接或間接地毛細作用接觸的第一吸收墊；以及(g)可任選地，第二吸收墊，如果存在的話，與所述第一吸收劑墊成毛細作用接觸；其中所述測試帶允許含全細胞的樣本中的分析物的檢測或定量。
65.如權利要求64所述的測試帶，其特征在于，所述第一吸收墊與所述層析條成直接毛細作用接觸。
66.如權利要求64所述的測試帶，其特征在于，所述第一吸收墊與所述層析條成間接毛細作用接觸。
67.包含如權利要求1、15、60、62或64所述的測試帶的測試盒，其特征在于，所述測試盒適于在設備中被讀取。
68.如權利要求67所述的測試盒，其特征在于，所述測試盒包含用于施加樣本或緩沖液的窗口-1和窗口-2。
69.如權利要求68所述的測試盒，其特征在于，窗口-2允許將樣本施加至所述測試盒的測試帶的樣本過濾器。
70.如權利要求68所述的測試盒，其特征在于，窗口-1允許將樣本施加至所述測試盒的測試帶的緩沖液墊。
71.如權利要求68所述的測試盒，其特征在于，窗口-1允許將緩沖液施加至所述測試盒的測試帶的緩沖液墊。
72.一種用于實施側向流測定的方法，所述側向流測定用于檢測含液體樣本中的分析物，所述方法包含以下步驟(a)提供如權利要求1所述的測試帶；(b)將樣本的第一等分試樣施加至所述第一膜上；(c)允許來自第一等分試樣的液體溶解可檢測試劑；(d)允許可檢測試劑和來自第一等分試樣的液體流至所述層析條上的捕獲帶；以及(e)允許樣本中的分析物，如果有的話，以及可檢測試劑在所述捕獲帶上被捕獲。
73.如權利要求72所述的方法，其特征在于，所述方法還包含在施加第一樣本前預先濕潤所述層析條的步驟。
74.如權利要求73所述的方法，其特征在于，預先濕潤層析條的步驟包含將緩沖液施加到所述第五膜上。
75.如權利要求74所述的方法，其特征在于，所述緩沖液從包含磷酸鹽緩沖鹽、林格氏溶液、Hank氏溶液、和Tris的組中選擇。
76.一種用于實施側向流測定的方法，所述側向流測定用于檢測含液體樣本中的分析物，所述方法包含以下步驟(a)提供如權利要求15所述的測試帶；(b)將樣本的第一等分試樣施加至所述第五膜上，其中所述第五膜毗鄰所述吸收墊；(c)將樣本的第二等分試樣施加至所述第一膜上；(d)允許來自第二等分試樣的液體溶解可檢測試劑；(d)允許可檢測試劑和來自第二等分試樣的液體流至所述層析條上的捕獲帶；(e)允許來自第二等分試樣的液體流至所述層析條上的捕獲帶；(f)允許樣本中的分析物，如果有的話，以及可檢測試劑在所述捕獲帶上被捕獲。
77.一種用于實施側向流測定的方法，所述側向流測定用于檢測含液體樣本中的分析物，所述方法包含以下步驟(a)提供如權利要求60所述的測試帶；(b)將樣本施加至所述第一膜上；(c)允許來自所述第一膜的液體從所述層析條的第一端流向所述層析條的第二端；(d)將緩沖液施加至所述緩沖液墊；(e)允許緩沖液溶解可檢測試劑；(f)允許可檢測試劑流至所述層析條上的捕獲帶；以及(e)允許樣本中的分析物，如果有的話，以及可檢測試劑在所述捕獲帶上被捕獲。
78.如權利要求72、76、或77中任一項所述的方法，其特征在于，所述可檢測試劑存在于所述共軛物墊中。
79.如權利要求72、76、或77中任一項所述的方法，其特征在于，所述可檢測試劑存在于所述層析條上。
80.如權利要求72、76、或77中任一項所述的方法，還包含對在所述捕獲帶上捕獲的可檢測試劑進行定量的步驟。
81.如權利要求80所述的方法，其特征在于，定量在所述捕獲帶上捕獲的可檢測試劑的步驟是通過反射能力測量執行。
全文摘要
本發明涉及包含測試帶的側向流測定和系統，用于檢測和定量樣本中的分析物，諸如包含細胞和液體的樣本，其中測定與容積不相關，并且樣本大小少于約100μl，其中測試帶包含例如樣本過濾器的第一膜，其與可任選擇的諸如液體收集器的第二膜毛細作用接觸，第二膜(如果存在)與可任選的第三膜或第四膜毛細作用接觸，該第三膜諸如是包含可流動的可檢測試劑的共軛物墊，該第四膜是可任選的包含可流動的可檢測試劑的層析條，所有這些膜都與諸如緩沖液墊的第五膜、諸如吸收劑墊的第六膜、可任選的也是吸收劑墊的第七膜液體接觸，或者該層析條取代共軛物墊包含可流動的可檢測試劑，其中測試帶被配置成支撐從樣本中去除紅細胞、以及允許液體從樣本過濾器到捕獲帶的單向或雙向流動以保留在其中并在其上得到檢測。
文檔編號A01N1/02GK101035429SQ200580025931
公開日2007年9月12日 申請日期2005年6月2日 優先權日2004年6月2日
發明者周思亮, W·J·若特, 劉寧 申請人:瑞萊診斷體系有限公司