專利名稱：組合物和方法
本申請為分案申請，母案為申請日為2001年10月30日、申請號“01820994.7”，發明名稱為“組合物和方法”的申請。
背景技術：
寵物如狗和貓面臨衰老的問題。這在俗語中也有一定的體現。其中之一是“老狗學不會新花樣”。該俗語得自如下的觀察隨著狗的衰老，它們的智力和體力同樣降低。與學習和記憶有關的智力活動似乎降低(Cummings BJ，Head E，Ruehl W，Milgram NW，Cotman CW 1996犬作為衰老和癡呆的動物模型Neurobiology of aging 17259-268)。此外，在老齡動物中可以顯現與智力改變有關的行為變化。引起此類能力降低的原因很多。
現已表明在年老寵物的飲食中顯著水平的至少一種抗氧劑的存在抑制年老寵物智力的衰退。
發明概述按照本發明，提供了一種符合年老寵物一般營養要求的寵物飲食，且其中進一步含有有效量的抑制年老寵物智力衰退的一種抗氧劑或其混合物。
本發明的另一方面是抑制年老寵物智力衰退的方法，該方法包括給所述寵物喂食水平足以完成此抑制的一種抗氧劑或其混合物。
本發明還提供了符合年老寵物一般營養要求的年老寵物飲食，其中進一步含有選自如下的抗氧劑維生素E、維生素C、α-硫辛酸、1-肉毒堿及其任何混合物，其含量足以抑制所述年老寵物智力的衰退。
本發明的另一方面是提高年老寵物智力的方法，其中包括給所述年老寵物喂食用量足以增加提高智力的抗氧劑或其混合物。
在所有這些方法中，需要在這些動物的飲食中加入抗氧劑或其混合物。
發明詳述給年老寵物如犬和貓喂食的飲食是喂給該年齡的動物的標準正常飲食。下面是至少7歲的犬的典型食物。
表1
向所述寵物食物中加入有效量的抗氧劑或其混合物可以給老年寵物中行為，特別是智力帶來顯著和明顯的變化，特別如解決問題的能力所示。術語年老一般指至少7歲的犬和至少7歲的貓。
對犬和貓智力的喪失已觀察了數年。此種智力喪失以若干途徑顯示。例如，對于犬，可以顯示為失去方向感、室內便溺、睡眠-清醒方式改變、與人及其它寵物交往減少或改變、以及學習能力喪失和無法集中注意力。這些情況也可表現在貓中。在犬和貓中沒有發現如人所患有的早老性癡呆。
對于此類智力喪失，出現了很多理論。迄今，本發明人沒有發現抑制此類智力喪失或者可以確實帶來如通過目標參數檢測的智力良性變化的任何飲食作用途徑。
本發明人在此方面獲得了成功。通過使用其發明的飲食，可以表明年老寵物智力的衰退得以抑制，且正如解決問題能力測試所示該能力有所提高。智力的這種衰退基本上可以逆轉。需要此治療的年老寵物的智力可以提高。正如記憶力及學習能力顯示，解決問題可以改善。整體智力水平得以提高。與年老相關的認知能力下降可以減緩。對于認知障礙綜合征，在年老的狗中其進展可被減緩，且與該綜合征有關的臨床癥狀可得到控制。需要預防和需要這些組分的寵物是目的組。
飲食中完成此作用的組分是某種抗氧劑或其混合物。抗氧劑是能減少自由基的物質。此類物質的實例包括食物如銀杏葉、柑橘果肉、葡萄醬、番茄醬、胡蘿卜和菠菜(所有這些優選干燥的)，以及其它物質如β-胡蘿卜素、硒、輔酶Q10(泛醌)、葉黃素、生育三烯酚類、大豆異黃酮、S-腺苷甲硫氨酸、谷胱甘肽、牛磺酸、N-乙酰基半胱氨酸、維生素E、維生素C、α-硫辛酸、1-肉毒堿等。維生素E可以以生育酚或生育酚混合物以及其多種衍生物如酯的形式使用，如維生素E醋酸酯、琥珀酸酯、棕櫚酸酯等。優選α形式，但是可以包括β、γ、δ形式。優選d型，但是外消旋混合物是可以接受的。寵物攝入后，這些形式和衍生物將發揮維生素E樣活性。可以在此飲食中以抗壞血酸及其衍生物的形式使用維生素C，衍生物如磷酸鈣鹽、膽固醇基鹽、2-單硫酸鹽等，在寵物攝入后，它們將發揮維生素C樣活性。它們可以是任何形式，如液體、半固體、固體和熱穩定形式。α-硫辛酸可以以α硫辛酸或美國專利5621117中的硫辛酸衍生物、其外消旋混合物、鹽、酯或酰胺的形式使用于食物中。在飲食中可以使用L-肉毒堿，可以使用肉毒堿的多種衍生物如鹽酸鹽、富馬酸鹽和琥珀酸鹽，以及乙酰化的肉毒堿等。
在飲食中的用量，都以該飲食的重量百分數(基于干重)表示，以活性物質計算，特別是以游離物質計算。最大用量不會帶來毒性。可以使用至少約100ppm或至少約150ppm的維生素E。可以使用的優選范圍是約500至約1000ppm。雖然不是必需的，但是最大值一般不超過約2000ppm或約1500ppm。對于維生素C，使用至少約50ppm，優選至少約75ppm，并更優選至少約100ppm。可以使用無毒的最大量。α硫辛酸的量可以為至少約25ppm，優選約50ppm，更優選約100ppm。最大量可以為約100ppm至600ppm或者對寵物無毒的量。優選的范圍為約100ppm至約200ppm。對于L-肉毒堿對犬來說約50ppm，優選約200ppm，更優選約300ppm是有用的最小值。對于貓，L-肉毒堿可以使用的最小值稍高，如約100ppm、200ppm、及500ppm。可以使用無毒的最大量，例如，小于約5000ppm。對于犬，可以使用較低量，例如，小于約5000ppm。對于犬優選范圍是約200至約400ppm。對映貓優選范圍是約400ppm至約600ppm。
可以使用約1-15ppm的β-胡蘿卜素。
可以使用約0.1至約5ppm的硒。
可以使用至少約5ppm的葉黃素。
可以使用至少約25ppm的生育三烯酚類。
可以使用至少約25ppm的輔酶Q10。
可以使用至少約50ppm的S-腺苷甲硫氨酸。
可以使用至少約1000ppm的牛磺酸。
可以使用至少約25ppm的大豆異黃酮。
可以使用至少約50ppm的N-乙酰基半胱氨酸。
可以使用至少約50ppm的半胱氨酸。
可以使用至少約50ppm的銀杏葉提取物。
下列是具有高ORAC(氧自由基吸收能力)的原料。當以1％的含量(對于ORAC低的組分如玉米總含量代之以5％)加入時，它們增加了整個飲食的ORAC，并增加了食用含這些組分食物的動物的血漿ORAC值。如果以1％的量并與其它四種1％組分聯合共占5％，加入到飲食中，優選可以使用ORAC值大于25umol的每克干重Trolox當量的任何組分。
菠菜醬番茄醬柑橘果肉葡萄醬胡蘿卜顆粒花莖甘藍綠茶銀杏葉玉米麩質粉實施例1所有的狗為小獵兔犬且為7歲或更大。對照組的營養組分和被測飲食基本上與表1公開的飲食相同。但是，對照組食物含有59ppm維生素E和小于32ppm的維生素C。被測食物含有900ppm維生素E和121ppm維生素C、260ppm的L-肉毒堿和135ppm的α硫辛酸。
在分配到對照組或被測組富含抗氧劑飲食組之前，給12歲的小獵兔犬一組基礎解決問題任務。在學習(反向識別)或記憶(延遲的對位置的非匹配[DNMP]和延遲的對物品的非匹配[DNMS])方面年老動物匹配性相同。用T檢驗比較兩組狗對反向識別學習、DNMP和DNMS任務的基礎學習。結果無顯著性。因此，在飲食介入前狗的識別基礎是相同的。開始此種飲食約1個月后，給狗安排的第一個解決問題的任務是標記識別學習任務，這是空間注意力試驗(Milgram等，1999，Milgram，N.W.，Adams，B.，Callahan，H.，Head，E.，Mackay，B.，Thirlwell，C.，& Cotman(1999)，C.W.，狗對標記的識別學習，Learning &Memory，654-61)。
標記識別學習要求對象根據近似的目標選擇特定的目標。但是，最初的學習是基于狗學習目標識別任務的能力。我們首先發現年齡對識別學習的作用依賴于任務的難易程度，我們發現目標識別學習在能力狗中顯著降低。
當比較被測抗氧劑富集飲食或對照飲食組年老動物的標記識別學習任務時，它們之間具有非常高的顯著性差異(p＜02)。抗氧劑富集飲食組動物比對照飲食組動物為完成任務所犯錯誤少。在40個單元中，抗氧劑富集飲食組的所有6個動物能夠符合學習標準，而對照飲食組6只動物中只有3只能夠符合學習標準。此外，這3只狗解決問題時所犯的錯誤比接受抗氧劑富集飲食的狗要多。
完成標記識別學習后，對照組或抗氧劑富集被測飲食組的狗，接受單數任務試驗。該任務給狗出示由3個目標物覆蓋的3份食物。其中兩個目標物相同而一個是不同的。為了獲得食物，狗必須選擇單數的目標。抗氧劑富集飲食組的狗學習該任務時犯的錯誤比食用對照飲食的狗明顯要少(所有4個單數試驗評分結合p＜.003)。
實施例2小獵兔犬(n＝28)先接受大小識別任務并在此學習任務中按照與標準的偏差排序。然后，按照排序按照層次分為3組，并基于先前的識別評分隨機分配3種飲食之一。該試驗中登記的所有狗年齡都大于7歲。給狗安排維生素E的含量不同的3種干食物之一，并開始目標識別方案。維生素E含量及其它組分見下表2。
表2
該目標識別方案由3個試驗階段組成(目標0、1、2)組成，其中在開始下一階段試驗前要求狗達到通過標準(兩天一排8/10正確，接下來三天平均7/10)。讓狗在40天內每天試驗10次來學習每個階段。重復MANOVA表明了飲食對標準級別的錯誤產生了顯著的整體作用(P＜0.05)。目標1+2的錯誤總和對該飲食的維生素E含量的回歸分析給出了顯著(P＜0.05)的回歸斜率，其中最高E飲食的狗犯錯最少(平均＝65次)，而E含量最低飲食的狗犯錯最多(評均＝170次)。
實施例3將30只隨機來源的成年狗用于此研究。這些狗至少10個月大，沒有懷孕、沒有授乳且在試驗開始前體重合理。將動物隨機粉為5組進行飲食試驗，每組3只雄性和3只雌性。
在喂養期前2周內，所有的狗喂食對照食物(0ppm d1-α-硫辛酸)，該食物符合或超出由美國飼料控制職員協會(AAFCO 2000)推薦的所有營養標準(表1)。此喂養前期后，將它們隨機分為5個試驗組，其中d1-α-硫辛酸目標含量(基于干重)分別如下0ppm、150ppm、1500ppm、3000ppm、4500ppm。在所有飲食中，對照和α硫辛酸組在都加入維生素E，含量600-1000國際單位，并以100-200ppm的含量加入維生素C。
除了水以外，被測食物是營養的唯一來源。隨意提供新鮮水。選擇狗并稱量了起始體重后，基于食物預計的ME為每只狗計算食物量。起始食物量計算基于狗的維持能量需求(MER)，并用考慮正常活動的因素修正，由下式計算MER(kcal/天)＝1.6×RER(靜止能量需求)其中RER(kcal/天)＝70×體重(kg)0.75每周給狗稱重并按照需要調整食物量以便給與足以維持它們的最佳體重的食物。最佳體重以3比5的比例確定。如果一只狗在調整食物量后不能維持在體重降低在起始體重的約10％以內，則從該研究中將其排出。記錄體重或食物攝入的所有檢測值。
將樣本磨碎并用5.0ml磷酸鹽緩沖液(10mM磷酸氫二鈉、2mM乙二胺四乙酸(EDTA)、0.9％氯化鈉，pH 7.4)4兩次提取0.100±0.001g樣本。將250μL的提取物加入到帶有特氟龍帽的5ml玻璃離心管中。加入15μL EDTA溶液(100mM EDTA、用約1M氫氧化鈉調節pH至7.8)和50μL新制備的5mM二硫赤蘚糖醇(DTE)。攪動溶液并在室溫下孵育5分鐘。然后加入10μL的1M磷酸和2.0mL的乙醚。室溫下蓋上試管，搖動，并以1500×g離心3分鐘。將醚層轉移至另一個5ml玻璃離心管中，同時用1.5mL乙醚再將水層萃取兩次。將該樣本的所有萃取物合并。然后在室溫下水浴中的氮氣蒸發器中干燥提取物。此時，將樣本蓋上蓋并冷凍。
然后，將干燥的提取物解凍并用70μL SDS/EDTA溶液(0.11％十二烷基硫酸鈉(SDS)、15mM EDTA、0.9％氯化鈉)和5μL新制備的1mMDTE再溶解。然后，向各試管中加入新制備的硼氫化鈉50μL。搖動試管并在室溫下孵育10分鐘。10分鐘后，將樣本在-70℃下冷凍。該溶液解凍前，加入20μL 2M HCl。將溶液解凍后，加入800μL 100mM碳酸氫銨。搖動溶液并加入5μL的100mM Momobromob imane的乙腈溶液(mBBr)。然后，將溶液在暗處室溫下孵育90分鐘。
孵育后用1.5ml二氯甲烷提取，從樣品中除去過量的mBBr和DTE衍生物。將水層置于HPLC。用30％乙腈、1％乙酸、用約2M氫氧化銨調節至pH3.95的流動相并每次上樣以流速1.0mL/min用無梯度洗脫液洗脫15分鐘分離硫辛酸。此制備假設擠出食物的密度為1g/ml。
無菌采集血樣以進行完全血細胞計數，在開始前2周并在該研究的第0、28、56、84、112、140和168天進行血液生化分析。此外，在食物干預的第0、28和84天采集15mL全血以分離淋巴細胞。
將肝素抗凝的全血加入到50ml Accuspin圓錐形離心管(SigmaChemical)中分層并加入等量的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)。以700g將樣本離心30分鐘，不剎車。收集單核細胞層，轉移至15ml圓錐形離心管中，再懸浮于1-3ml的PB中，并如以前那樣離心(第一次洗滌)。如第一次洗滌所述進行第二次洗滌。最后，收集細胞并懸浮于過氯酸(10％w/v)中，并在-70℃下冷凍直到分析。
將樣本從-70℃冷凍箱中轉移至干冰冷藏箱中。在低溫離心機中以12000rpm離心5分鐘。將1等份谷胱甘肽(GSH)分析用上清液轉移至圓錐形試管中。
用由Jones(Jones等)改良的Reed及其同事(Fariss等)的方法將酸溶性提取物的衍生化。
簡言之，將150μl提取物或內標物加入到1.5ml微量離心管，接著加入20μl的γ-glu-glu內標物和50μl IAA，接著混合。用氫氧化鉀-碳酸氫鉀工作液調溶液pH為約10(紫色)。室溫下在暗處將溶液孵育1小時。加入與總體積相同的Sanger氏試劑，并將溶液在暗處孵育過夜(20小時)。
孵育后，以12000rpm將溶液離心5分鐘，將上清液轉移至另一個1.5ml微量離心管中。將200μl上清液加入到琥珀自動瓶(amberautovial)中，其帶有一個300μl入口，頂部用折皺器固定以進行HPLC分析。
溶劑和分離條件如上所述(Fariss，Jones)。相對于可靠標準定量測定GSH和GSSG水平。用γ-glu-glu作為內標物評價衍生化效率。
通過Windows SAS軟件成對t檢驗分析臨床化學、血液學和體重對基線值的數值比較，其顯著性差異P＜0.05。每個檢測時間點的平均值通過單側ANOVA分析，顯著性差異P＜0.05。組別間第84天和基線值之間GSH∶GSSG的差異用Windows SAS軟件以單側ANVOA分析，顯著性P＜0.05。
結果在7個連續檢測(0、28、56、84、112、140、168天)所得的食物中的硫辛酸(ppm)濃度在預計的檢測靈敏度內，而產生參數一般與我們的儀器相符(表1)。
食物攝入數據不值得注意。平均而言，在所有組別中大多數動物在第6個月比試驗開始時攝入更多的食物。除了在4500ppm濃度組中起初發生的一些體重減少(但是6個月時該變化似乎逆轉)，體重數據不直到注意。
常規體檢沒有發現與營養有關異常或d1-α-硫辛酸毒性的任何證據。在該試驗群體中所有動物在整個研究過程中保持正常。在該研究過程中觀察到若干動物偶爾嘔吐；但是，沒有觀察到得出此種嘔吐可能歸因于硫辛酸的推論的傾向。在含量最高的組別中，在試驗第21天被排除，原因是體重減輕和白細胞增多。此動物中的白細胞增多直到試驗結束時也沒有解決，懷疑是由于一些其它疾病引起的。
對于同一組狗，當第28、56、84、112、140和168天的血清生化數值與起始數值比較時，一些統計學差異值得注意，但是，這些都不能被看作具有生物學顯著性，因為這些數值都在試驗室參考范圍內或非常接近，并注意到幾個月內一致性傾向。每個時間段中對照組與其它處理組之間的比較，也揭示出若干統計學差異；但是，這些都不能被看作具有生物學顯著性，因為這些數值都在試驗室參考范圍內或非常接近，并且不存在任何傾向。
對于同一組狗，當第28、56、84、112、140和168天的血液學數值與起始數值比較時，一些統計學差異值得注意，但是，這些都不能被看作具有生物學顯著性，因為這些數值都在試驗室參考范圍內或非常接近，并注意到幾個月內一致性傾向。每個時間段中對照組與其它處理組之間的比較，也揭示出若干統計學差異；但是，這些都不能被看作具有生物學顯著性，因為這些數值都在試驗室參考范圍內或非常接近，并且不存在任何傾向。
GSH∶GSSG比在飼養84天內GSH∶GSSG比的變化表現出飲食的顯著整體作用(P＝.024)，其中所有強化食物組該比例升高(表2)。ANOVA表明含量最低和最高組與基礎食物組相比表現出顯著差異，但是在最低含量水平中數量增加最大。就是說，最高含量和最低含量組中GSH∶GSSG比的變化與同樣時間段在基礎食物中觀察到的變化顯著不同。在第84天無法檢測4個點(1個對照組，3個處理組)的比例，因為在這些樣本中檢測不倒GSSG。照此，強化組可能顯示出更高的GSH∶GSSG比，如果該檢測靈敏度足以檢測出在第84天的低水平GSSG。
Table 1 Factors and levels of the orthogonal experiment
Table 2 The plan of the orthogonal experiment and result
考慮到實際給藥量，由表2極差分析結果可見，正交試驗優化的最佳工藝是HP-β-CD與藥物的質量比(2.5∶1)、包合溫度(回流溫度)、包合時間(24h)、溶劑(95％乙醇)、HP-β-CD濃度為500mg·mL-1。。驗證實驗結果為包合率為(4.06±0.14)％，載藥量為(1.62±0.06)％(n＝3)，高于試驗設計中的其他工藝條件，進一步驗證工藝條件的合理性。
權利要求
1.抑制老年寵物智力衰退的方法，其中包括給所述寵物使用用量能夠達到此種抑制的某種抗氧劑或其混合物。
2.權利要求1所述的方法，其中所述寵物是犬。
3.權利要求2所述的方法，其中所述犬至少7歲。
4.權利要求1所述的方法，其中所述寵物是貓。
5.權利要求4所述的方法，其中所述貓至少7歲。
6.權利要求1所述的方法，其中給該寵物喂食至少約100ppm的維生素E，維生素E含量通過檢測飲食測定。
7.權利要求6所述的方法，其中給該寵物喂食選自維生素C、1-肉毒堿、α-硫辛酸或其混合物的抗氧劑。
8.權利要求1所述的方法，其中給該寵物喂食選自維生素C、1-肉毒堿、α-硫辛酸或其混合物的抗氧劑。
9.權利要求8所述的方法，其中存在至少約50ppm的維生素C喂食給所述寵物。
10.權利要求8所述的方法，其中至少約25ppm的α-硫辛酸喂食給所述寵物。
11.權利要求8所述的方法，其中至少約50ppm的1-肉毒堿喂食給所述寵物。
12.提高老年寵物智力的方法，其中包括給所述寵物喂食足以提高所述寵物智力量的抗氧劑或其混合物。
13.權利要求12所述的方法，其中所述寵物是犬。
14.權利要求13所述的方法，其中所述犬至少7歲。
15.權利要求12所述的方法，其中所述寵物是貓。
16.權利要求15所述的方法，其中所述貓至少7歲。
17.權利要求12所述的方法，其中給該寵物喂食至少約100ppm的維生素E，維生素E含量通過檢測飲食測定。
18.權利要求17所述的方法，其中給該寵物喂食選自維生素C、1-肉毒堿、α-硫辛酸或其混合物的抗氧劑。
19.權利要求12所述的方法，其中給該寵物喂食選自維生素C、1-肉毒堿、α-硫辛酸或其混合物的抗氧劑。
20.權利要求19所述的方法，其中存在至少約50ppm的維生素C喂食給所述寵物。
21.權利要求19所述的方法，其中至少約25ppm的α-硫辛酸喂食給所述寵物。
22.權利要求19所述的方法，其中至少約50ppm的1-肉毒堿喂食給所述寵物。
23.改善寵物老年期抗氧化損傷能力的方法，其中包括給所述寵物在其老年期喂食符合營養要求的飲食，所述飲食含有至少約25ppm的硫辛酸，且所述飲食喂食至少一個月。
全文摘要
符合普通營養要求的老年寵物飲食，并進一步含有抑制所述寵物在其老年智力衰退足夠量的某種抗氧劑或其混合物。
文檔編號A23K1/18GK1853496SQ20061008472
公開日2006年11月1日 申請日期2001年10月30日 優先權日2000年10月31日
發明者S·C·茲克爾, K·J·維德金德 申請人:高露潔-棕欖公司