專利名稱：防治煙草花葉病毒病的方法
技術領域：
本發明屬于植物保護，尤其涉及一種利用雙鏈RNA干擾技術防治煙草花葉病毒病的方法。
技術背景煙草花葉病毒引起的花葉病是煙草、番茄等作物上的花葉病是十分重要的 病害，世界各地發生普通，損失嚴重。如在煙草上自苗期至大田期可連續發生， 幼苗被侵染后，新葉的葉脈顏色變淺，呈半透明的"明脈癥"，而后形成黃綠相間 的花葉癥；苗期侵染的植株發育緩慢，幾乎沒有經濟價值。大田期植株發病， 除顯示明脈、花葉癥狀以外，病葉上會形成皰斑，厚薄不勻；葉形也會出現各 種畸形，如葉緣反巻、皺縮扭曲.葉緣缺刻或成帶狀。病毒致病功能被認為與 衣殼蛋白進入葉綠體有關，衣殼蛋白上個別氨基酸的改變導致癥狀的較大變異。 煙草花葉病毒寄主范圍廣，屬于世界性分布；自然傳播不需要介體生物，靠植 株間的接觸(或有時種子)傳播；對外界環境的抵抗力強。煙草花葉病毒形態為 直桿狀，直徑18nm，長300nm;粒體分子量為40xl06u。 TMV是研究相當深 入的植物病毒典型代表，其體外存活期一般在兒個月以上。在干燥的葉片中可 以存活50多年；鈍化溫度9(TC左右。TMV主要靠病汁液接觸傳播，在農事操作中沾染了病株汁液的手或工具通過接觸煙苗的微傷口侵入。由于病毒的抗逆 力很強，混有病株殘體的肥料、種子、土壤和帶病的其它寄主植物及野生植物， 甚至烤過的煙葉、煙末都可以成為病害的初侵染來源。這些初侵染源或移入大 田的病苗，通過各種接觸媒介引起再侵染，使病害在田間擴展蔓延。目前，煙草花葉病毒的防治主要利用化學農藥和轉基因煙草方法。化學農 藥的大量使用使病毒的抗藥性日益明顯，人們不得不加大藥量，這是一種惡性 循環，結果造成了高量的農藥殘留。殘留的農藥不但會危害煙草使用人員的健 康，而且直接影響了我國煙草的出口創匯。同樣，雖然轉基因技術可以高效的 控制病毒病的發生和發展，其生物安全性卻引起了國內外專家和政府的高度重 視，轉入的基因及其附帶成分具有插入人類基因組的可能性，因此轉基因產品 在大多數國家都有法律限制。根據這些情況，人們必須找到一種更為安全和有 效的抵御植物病毒病的方法。
RNA干擾(RNA interference ,RNAi)是一種古老而保守的生物現象，由21 23個核苷酸雙鏈siRNA介導產生的轉錄后基因沉默可以顯著控制病毒的復制 增殖，達到防治煙草病毒病的目的。siRNA由較大的雙鏈RNA經Dicer酶的降 解產生,然后再以單鏈siRNA為引物以mRNA為模板合成長dsRNA ,再由Dicer 酶切割形成siRNA，以此反復進行實現RNAi的放大效應。多種蛋白酶參與RNAi 過程，包括Dicer酶、RDRP、 RDE-1、 Argonaute家族、螺旋酶和核酸酶等。其 中Dicer酶非常重要，一些參與siRNA的形成,而另一些則參與RNA誘導的沉默 復合體的形成。Dicer酶有l個螺旋結構域、2個RNA酶III結構域、2個dsRNA 結合域以及1個PZA結構域，進化上很保守,以二聚體的形式起作用，有類似 RNasein酶的活性，被認為是RNaseIII家族成員之一。在植物、線蟲、果蠅和哺 乳動物體內均存在Dicer酶的同源體,這些蛋白結構相似,而且具有相似的生化功 能,提示RNA干擾具有進化保守的相似的生化功能。目前，雖然已有多家單位 正在研究如何利用siRNA防治植物病毒病，但是因該RNA化學合成方法的成本 很高，而且將RNA注射進大量的植物體內很難實現，所以其成果難以產業化。那么，如果人們能夠利用發酵生產的辦法大量制造siRNA,而且不必將 siRNA注射進煙草植株內部就可以控制煙草花葉病毒的復制和增殖，這將是-一 種十分理想的方法。發明內容本發明的目的是提供一種利用雙鏈RNA干擾技術防治煙草花葉病毒病的方法。為實現上述目的，本發明采用如下技術方案 一種防治煙草花葉病毒病的 方法，包括以下步驟提取錄煙草花葉病毒的RNA基因組；利用煙草花葉病毒的RNA基因組，反轉錄得到煙草花葉病毒運動蛋白的cDNA;利用PCR技術分 離煙草花葉病毒運動蛋白cDNA上150-800bp內21-23bp長的片斷；將上述片段 克隆入可表達RNA的質粒載體；使克隆的片段在缺失RNA酶的大腸桿菌內表 達成RNA;粉碎細胞，并將其制成濃度為2-20ng/ml懸浮溶液；將懸浮液稀釋 1000倍后噴施于煙草的葉面上。在煙草上的噴施量為10-100 ng/畝。本發明與現有技術相比，具有以下優點和效果本方法生產簡便、成本低 廉、對人畜和高等動物無害，適于在煙草上大量施用，具有廣闊的產業化前景。 制成的懸浮劑克服了可濕性粉劑和乳油劑的缺陷，助劑易于分散，田間施用更 方便，沒有殘留和環境污染。
具體實施方式
實施例l:利用酚氯仿法提取煙草花葉病毒的RNA基因組；以煙草花葉病毒的基因組RNA為模板，反轉錄得到煙草花葉病毒運動蛋白的cDNA;利用PCR 技術分離煙草花葉病毒運動蛋白cDNA上150-800bp范圍內21-23bp長的片斷； 將得到的上述片段克隆入可表達RNA的質粒載體；使克隆的片段在缺失RNA 酶的大腸桿菌(￡.co/f)內表達成對應的RNA;粉碎表達有目的RNA的細胞， 并將其制成懸浮溶液；該溶液中RNA的含量為2-20 n g/ml，光保護劑芳香族氨 基酸色氨酸占溶液體積的0.01-0.1%，分散劑1-2%,甘油2-5%，無菌水 96.99-92.9%。分散劑為L602或LH656。配制時，依次在粉碎的細胞中加入甘油、 芳香族氨基酸色氨酸、分散劑和滅菌水，攪拌均勻得到懸浮劑，然后分裝即可。 試劑要避光保存在棕色試劑瓶里，若長時間存放需保存在4攝氏度以下。田間 施用時，將懸浮液稀釋1000倍后，在早晨9點前或下午5點后噴施于煙草的葉 面上，在煙草上的噴施量為10-100 ng/畝。實施例2:在本實施例中，懸浮溶液的成份為RNA的含量為5ng/ml，光 保護劑芳香族氨基酸色氨酸0.05%， L602分散劑1.5%，甘油3.5%，無菌水 94.95%。其它與實施例l相同。實施例3:在本實施例中，懸浮溶液的成份為RNA的含量為15ng/ml, 光保護劑芳香族氨基酸色氨酸0.08%， LH656分散劑1.8%，甘油4%，無菌水 94.72%。其它與實施例l相同。實施例4:在本實施例中，懸浮溶液的成份為RNA的含量為20ng/ml， 光保護劑芳香族氨基酸色氨酸0.03%， LH656分散劑1.8%，甘油4.5%，無菌水 94.95%。其它與實施例1相同。實施例5:在本實施例中，懸浮溶液的成份為RNA的含量為2ng/ml，光 保護劑芳香族氨基酸色氨酸0.07%, L602分散劑1.2%，甘油2.5%，無菌水 94.72%。其它與實施例l相同。實施例6:在本實施例中，懸浮溶液的成份為RNA的含量為3ng/ml，光 保護劑芳香族氨基酸色氨酸0.01%， LH656分散劑1%，甘油2%，無菌水96.99%。 其它與實施例l相同。實施例7:在本實施例中，懸浮溶液的成份為:RNA的含量為12ng/ml， 光保護劑芳香族氨基酸色氨酸0.1%， L602分散劑2。/。，甘油5%，無菌水92.9%。
其它與實施例l相同。實施例8:在本實施例中，懸浮溶液的成份為RNA的含量為18ng/ml， 光保護劑芳香族氨基酸色氨酸0.02%， L602分散劑1.4%，甘油4%,無菌水 94.95%。其它與實施例l相同。實施例9:在本實施例中，懸浮溶液的成份為RNA的含量為8ng/ml，光 保護劑芳香族氨基酸色氨酸0.02%，L602分散劑1.7%，甘油3%，無菌水94.72%。 其它與實施例l相同。
權利要求
1. 一種防治煙草花葉病毒病的方法，其特征在于包括以下步驟提取錄煙草花葉病毒的RNA基因組；利用煙草花葉病毒的RNA基因組，反轉錄得到煙草花葉病毒運動蛋白的cDNA；利用PCR技術分離煙草花葉病毒運動蛋白cDNA上150-800bp內21-23bp長的片斷；將上述片段克隆入可表達RNA的質粒載體；使克隆的片段在缺失RNA酶的大腸桿菌內表達成RNA；粉碎細胞，并將其制成濃度為2-20ng/ml懸浮溶液；將懸浮液稀釋1000倍后噴施于煙草的葉面上。
2、 如權利要求1所述的防治煙草花葉病毒病的方法，其特征在于在煙草 上的噴施量為10-100 ng/畝。
全文摘要
本發明公開了一種防治煙草花葉病毒病的方法，包括以下步驟提取錄煙草花葉病毒的RNA基因組；利用煙草花葉病毒的RNA基因組，反轉錄得到煙草花葉病毒運動蛋白的cDNA；利用PCR技術分離煙草花葉病毒運動蛋白cDNA上150-800bp內21-23bp長的片斷；將上述片段克隆入可表達RNA的質粒載體；使克隆的片段在缺失RNA酶的大腸桿菌內表達成RNA；粉碎細胞，并將其制成濃度為2-20ng/ml懸浮溶液；將懸浮液稀釋1000倍后噴施于煙草的葉面上。本方法生產簡便、成本低廉、對人畜和高等動物無害，適于在煙草上大量施用。制成的懸浮劑克服了可濕性粉劑和乳油劑的缺陷，助劑易于分散，田間施用更方便，沒有殘留和環境污染。
文檔編號A01N63/00GK101209055SQ20061016000
公開日2008年7月2日 申請日期2006年12月29日 優先權日2006年12月29日
發明者張小霞, 戚元成, 梁振普, 邱立友, 高玉千 申請人:河南農業大學