專利名稱：：轉基因雞的制作方法轉基因雞相關信息本發明在USDASBIR2003-0卯58和NIHR44GM064261、R43GM073306-01、R44HD039583和R43HD047995-01之下通iti^資助而作出的。i^在本發明中具有某些權利。
背景技術：
：轉基因動物在高價值藥物產品比如抗體的可持續生產中提供可以推動極大進步的潛力。然而，轉基因動物的生產涉及明顯的技術障礙，這些障礙只在幾種物種中得以克服。將編碼蛋白質的遺傳修飾摻入一種物種的DNA中以進行特異性表達的能力需要幾種明顯不同的技術，這些技術必須針對每個物種來開發。改變動物的遺傳和身體特征的一種方法是將細胞引入動物的受體胚胎。這些細胞具有有利于從所述受體胚胎產生的動物的組織以及有利于所得動物轉基因后代的基因組的能力。人們已經花費了大量時間和資源致力于細胞系的研究和開發、細胞基因組的操作、以及使這些工程化細胞在培養中維持的細胞培養技術。盡管已作了4艮多嘗試，在培養中保持工程化細胞多能性的能力只在幾個物種中得以實現。如果可持續的細胞培養物易于獲得并且易于被遺傳工程處理同時保持多能性，新技術將可以得到廣泛應用。在某些情形中，可用含編碼外源產物比如蛋白質或者抗體的DNA的轉基因將細胞工程化^t。所述轉基因包含產生所述蛋白質的藍本并且包含足夠的編碼和調節元件以使該蛋白質能夠從將所述細胞插入受體胚胎而產生的動物的組織中表達。在一些情形中，期望所"達是普遍存在的以j更于所ii^達發生在所有組織類型中。然而，在另一些情形中，比如收集有價值的抗體，所i^達必須被限制于有利于收集所表達蛋白質的某些特定組織類型。例如，在牛中，在乳中表達蛋白質4吏得通過簡單的收集牛乳和分離外源蛋白質能夠4艮容易地收集所述蛋白質。在雞中，在雞卵白中大量生產抗體也提供用于表達和收集抗體的有吸引力的媒介。此外，在組織特異性表達特異性針對雞輸卵管的情形中，所W達產生具有某些特異性期望化學性質的抗體，其可增加所述抗體在用于治療人類患者時的治療應用。因此，一個特別吸引人的研究和商業開發領域是在其卵中選擇性表達抗體以便于分離和收集具有期望化學性質的蛋白質的經遺傳&造的雞。對于生產外源抗體而言，鳥類生物系統具有很多優點，這包括高效的農場飼養、快速生長和生產經濟性。此外，對于大量合成抗體以及易于分離和收集產物，鳥卵提供理想的生物學設計。此外，如本發明下文所述，與例如脊推動物、植物或細菌細胞系統相比，轉基因雞表達系統對于大量抗體生產的好處很容易證明并且可用于產生獨具優勢的化學性質。創建轉基因雞的目標科學家已尋找了許多年。盡管在其它物種，比如小鼠、牛和豬中已實現了該目標，但是除了采用逆轉錄病毒技術之外，還沒有創建轉基因雞，而逆轉錄病泰技術對于可引入轉基因動物DNA的轉基因大小方面受到了與生倶來的限制。然而，如果細胞培養物足夠穩定使得大轉基因整合于細胞的基因組中，那么可通過依賴于靶細胞和用作轉基因的特定構建體的幾種不同技術將編碼組織特異性表達抗體的轉基因傳送入轉基因生物。可通過細胞雜交轉移整個基因組，通過」敞細胞轉移完整染色體，通過染色體介導的基因轉移來轉移亞染色體片段，以及通過DNA介導的基因轉移來轉移千堿基范圍的DNA片段(Klobutcher,L.A.andF.H.Ruddle,Annu.Rev.Biochem"50:533-554，1981)。完整染色體的轉移可通過微細胞介導的染色體轉移(MMCT)來實施(Fournier，R.E.andF,H.Ruddle,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，74:319-323，1977)。轉基因的特異性設計還必須考慮編碼抗體的DNA序列的內含物、靶細胞系、在其中靶向表達的特異性組織、在其中發生表達的宿主生物以及待表達的抗體。設計用于組織特異性表達的轉基因必須滿足幾個參數，從而使之能夠成功地整合入細胞的基因組中并且確保在宿主生物的選定組織中成功地表達。插入能實現組織特異性表達的轉基因可能會威脅細胞的多能性，除非小心地設計轉基因并優化培養條件。因此，當用遺傳構建體轉染細胞時，適用于轉基因的細胞系必須在培養中是穩定的并保持多能性，所述遺傳構建體足夠大和復雜從而在期望時可包含組織特異性高水平表達必需的所有元件。在所得的轉基因動物中，轉基因可任選地在設計用來表達轉基因的特定個體組織類型中選擇性表達。根據轉基因的遺傳內含物，如果動物的存活性或者所得蛋白質的有利化學性質受到影響，該轉基因可能不在其他組織中表達。
發明內容本發明包括轉基因雞和實現遺傳改造轉基因鳥的技術，以及用來創建轉基因雞的PGC的長期培養物。本發明還涉及在雞中生產的抗體以及它們的獨特化學性質。具體說，這些抗體具有在某些應用中增強其治療效用的有利化學性質。與在脊推動物、植物或細菌細胞系統中產生的抗體相比，由雞產生的抗體具有獨特的化學修飾模式，使得在施用給患者以實現將毒素結合至靶組織比如腫瘤時，所治療靶組織的治療效果增加。在一個實施方案中，用專門設計的遺傳構建體改造PCG的長期培養物以將遺傳4務飾引入鳥中，這包括插入產生外源蛋白質組織特異性表達的轉基因。本發明的轉基因鳥還可以在輸卵管中表達源于轉基因的抗體，該抗體大量沉積于卵中。在優選實施方案中，外源抗體蛋白質由人DNA序列編碼，從而在雞輸卵管中表達天然的人抗體并且可從其卵中收集該抗體。本發明包括表現出組織特異性表達抗體的鳥群體，能實現外源抗體表達的轉基因構建體，由雞產生的并且具有特定化學性質的抗體的分離組合物，以及用于創建所述鳥、生產所述抗體和它們在人類中治療性應用的相關方法。本發明采用長期原始細胞培養物(primordialcellcultures)和專門技術來生產源于長期細胞培養物的嵌合體或者轉基因鳥，其中PGC的基因組具有穩定整合的表達外源蛋白質的轉基因，使得所述培養細胞的后代含有該穩定整合的轉基因。當通過以下描述的方法將其引入宿主鳥胚時，那些修飾的供體細胞產生鳥，其將轉基因表達于所得動物的特異性、選定的體細胞組織。本發明還包括在轉基因雞中表達的并且與脊稚動物、植物或者細菌細胞系統相比具有某些期望化學性質的外源蛋白質的組合物。具體說，這些蛋白質，尤其是抗體，含有更低濃度的巖藻糖、半乳糖、N-乙酰神經氨酸、N-乙醇酰基神經氨酸以及更高濃度的甘露糖。當將具有一些或所有這些性質的抗體施用給人時，它們表現出治療效用增加。具體來說，這些抗體組合物表現出增強的抗體依賴性細胞毒作用(ADCC)。因此，本發明的方法包括，通過在轉基因雞中表達抗體而應用轉基因雞來增加抗體組合物基于ADCC作用的治療效用。本發明還包括在輸卵管組織中表達外源抗體的轉基因雞，該外源抗體具有本文所定義的有利化學性質，使得外源抗體以確定的量集中于卵白中。在一個優選實施方案中，所述外源蛋白質是由摻入轉基因鳥基因組的轉基因構建體所編碼的人序列單克隆抗體。編碼該人單克隆抗體的多核苷^列包含在專門構建用于在輸卵管中表達的轉基因中，該轉基因還包含適宜的啟動子和調節序列以促進組織特異性表達。本發明還涉及鳥原始生殖細胞(avianprimordialgermcells,PGC)的長期培養物以及能夠通過創建長期培養物而實現的另外幾項發明，在其中鳥PGC增殖并且其中PGC培養物可通過多次傳代而擴充，從而延長培養物的存活超過40天、60天、80天、IOO天或更長。本發明的PGC在長期培養物中增殖并且當其被注射入受體胚時產生種系嵌合體(germlinechimerasX圖1A:在培養物中維持54天的PGC。注意細胞沒有附著并且保持圓形。箭頭所指是在該培養物中可見的幾個分裂細胞。圖IB:在培養物中維持234天的PGC。這些細胞培養在輻照處理的STO細胞的飼養層上。圖2:根據生殖細胞標記物CK/7和Z)^;/的RT-PCR確定的基因表達。細胞培養32天。泳道1顯示在PGC等分試樣中CKH和ZMz/的表達。如缺少肌動蛋白所確定的，泳道2中的第二樣品沒有足夠的mRNA。也分析了CES細胞；表達肌動蛋白但是cES細胞不表達CKfT而且僅弱表達Da仏圖3:對維持培養166天的PGC進行Western分析。睪丸,皮用作陽性對照，肝被用作陰性對照。應用兔抗雞CVHIgG作為第一抗體。圖4:端粒重復序列擴增方案(TelomericRepeatAmplificationProtocol,TARP)分析。維持培養兩種不同PGC細胞系(13和16)的不同稀釋度的細胞提取物146天。陽性對照由轉化的人腎細胞系293組成，陰性對照僅是裂解緩沖液而未添加模板。在PGC和陽性對照的泳道中，重復序列是可見的，這指示端粒酶的存在。圖5A:源于維持培養的PGC的cEG細胞。5B:雞胚胎干細胞。注意兩種細胞類型中的小細胞，其具有大細胞核(淺灰色)和明顯的核仁。圖6:從源于PGC的cEG細胞獲得的嵌合體。EG細胞源于有黑羽毛的BarredRock胚胎。用有白羽毛(WhiteLeghorn)的胚胎作為受體。從黑色羽毛明顯可知體細胞嵌合性。圖7:公雞IV7-5和它的后代。WhiteLeghorn在顯性白色基因座上是純合顯性的(1/1)。當與BarredRock母雞(i/i)交配時，來自WhiteLeghorn的所有后代將是白色(I/i)。黑色雞證明所注射的PGC(源于BarredRock胚胎(i/i))已ii^WhiteLeghorn公雞的種系。圖8:在原始生殖細胞系(PGC)中cx-neo轉基因的Southern分析。圖9:用抗雞vasa同源物(chickenvasahomologue，CVH)和1B3的抗體染色，對DT40細胞(陰性對照群)、ES細胞、EG細胞和PGC進行FACS分析。DT40、ES和EG細胞對兩種標記物都是陰性，而大部分PGC對CVH和1B3染色為陽性。所用的細胞系是PGC102、ES439和EG455。圖10:在2個原始生殖細胞PGC系中對HS4-(5-actin-neo轉基因的Southern分析。圖11:Southern印跡分析，表明克隆性來源的轉染PGC系可貢獻給(contributeto)嵌合體雞的種系并分化成EG細胞。上圖基因組DNA用限制性內切酶進行消化處理以檢測轉基因插入的內部(f/7/zI)和連接片段(iVc^I,4/7II),所述基因組DNA來自用HS4bactin國eGFP-bactin-puro構建體轉染的PGC、源于用所述轉染PGC制得的嵌合體^^雞的三個胚胎、和源于轉染PGC的EG細胞。消化后DNA在0.7。/。瓊脂糖^MJi分離，印跡到尼龍膜上，并用放射性標記的eGFP序列進行檢測。雜交片段的大小在PGC、EG細胞和兩個顯示出綠色熒光的胚胎(GFP+胚胎)中是一致的。第三個無熒光的胚胎(WT胚胎)未顯示雜交。下圖構建體的示意圖，其中標出限制性位點的位置并在下面顯示預期限制性片段的大小。有兩個/T/ml位點，產生5.3kb的片段。TVcoI和4/^1在構建體內切割一次，由此觀測到的限制性片段是連接構建體與插入位置側翼基因組DNA的連接片段。圖12:顯示所有染色體為二倍體的G-09核型。在GGA2的一個拷貝中，p臂的大部分或者缺失或者易位至另一染色體。另一拷貝的CGA2是正常的。細胞是ZZ(雄性)。圖13:在發育18天時用DAPI染色的睪丸的切片。GFP陽性生殖細胞在生精小管中清晰可見。圖14:DAPI染色的圖顯示經過E18睪丸生精小管的切片。圖15:來自攜帶有與卩肌動蛋白-GFP轉基因一起穩定轉染的PGC之嵌合體的轉基因后代。胚胎表明從階段x(EG&K)到階段34(H&H)在所有組織中表達GFP。圖16:在步驟1中，經重組工程通過在大腸埃希氏菌中同源重組將抗-IL-2RaIgL/IgH盒插入OvBAC。隨后抗體處在Ov調節元件的轉錄控制之下。在步驟2中，用Flp重組酶去除在重組工程中所用的卡那霉素基因。圖17顯示設計用來相互退火以產生如所示全長輕鏈V區的輕鏈V基因寡聚體的設計。每個寡聚體用指向3，方向的箭頭表示。圖18顯示具有Ov結構基因5，端110kb序列和Ov結構基因3，端30kb側翼序列的OvBAC構建體。發明詳細說明本文所用的術語"雞胚胎干(cES)細胞，，表示表現出ES細胞形態的細胞，并且其貢獻給源于階段X(E-G&K)胚胎透明區(areapellucida)(大致相當于小鼠胚泡)的受體胚胎中的體細胞組織。CES細胞共享小鼠ES細胞的幾種體外特征比如SSEA-l+、EMA-l+和端粒酶+。ES細胞具有定居(colonized)于所有體細胞組織的能力。本文所用的術語"原始生殖細胞(PGC)"表示表現出PGC形態的細胞，并且其完全貢獻給受體胚胎的種系，PGC可以來源于采自階段12-17(H&H)胚胎的全血。PGC表型可通過以下方法來確立(1)種系特異性基因CVH和Dazl在該細胞系中強烈轉錄，(2)所述細胞強烈表達CVH蛋白質，(3)當把所述細胞注入階段X而非階段12-17(H&H)的受體胚胎時，所述細胞并不對體細胞組織有貢獻，(4)所述細胞產生EG細胞(見下)，或者(5)當把所述細胞注入階段12-17(H&H)的胚胎時，所述細胞經種系傳遞PGC基因型(Tajimaetal.(1993)Theriogenology40，509-519;Naitoetal"(1994)Mol.Reprod.Dev.，39，153-161;Naitoetal"(1999)JReprod.Fert,117，291-298)。本文所用的術語"雞胚胎生殖(cEG)細胞"表示源于PGC并且在功能上與鼠EG細胞類似的細胞。cEG細胞的形態與eES細胞相似并且當cEG細胞注入階段X(E-G&K)受體時其對體細胞組織有貢獻。本文所用的術語"轉基因動物"表示在其體細胞和生殖細胞中編碼轉基因并且能將轉基因性狀傳遞給其后代的動物。盡管本文的實施例是針對雞來說明的，但在試驗中可用其它鵓雞類(gallinaceous)物種比如鵪鵓、火雞、雉等替換雞，并且可以合理預期將能成功地實施本文公開的方法。通過插入設計用于在培養ES細胞中進行組織特異性表達的DNA構建體，產生在其卵白(eggwhite)中表達有價值藥物產品比如單克隆抗體的雞。見PCTUS03/25270WO04/015123Zhuetal.。實現這種動物的關鍵4支術是建立并維持真正長期的ES細胞培養物，以使其保持存活足夠長的時間，用于在培養中工程化改造克隆細胞的基因型。然而不同于ES細胞，原始生殖細胞(PGC)只能短期培養。一旦延長培養時間超出了較短天數，這些細胞就喪失僅貢獻給種系的能力。典型地，用當前的培養技術維持培養的PGC不能增殖和倍增。在缺少健壯(robust)生長的情形中，培養物是"終極的(terminal)"并且不能無限期維持。隨著時間推移，這些終極的細胞培養物發生退化并且這些細胞喪失它們獨特的PGC形態并回復到EG細胞。在注入早期階段的發育胚胎時，胚胎生殖細胞獲得不同于PGC的形態，失去作為種系的限制性，并獲得貢獻于體細胞組織的能力。為向受體胚胎的種系引入預定基因型，由此使動物能將期望基因型傳遞給未來的世代，PGC具有特別的吸引力，這是因為已知它們是精子和卵的始祖。PGC的長期培養物提供幾種重要的優點，比如維持禽肉蛋生產工業中所依賴的重要雞繁殖系(breedingline)的有價值遺傳特征。目前，采用特別的措施以防止由于突發事件或者疾病造成有價值繁殖系喪失。這些措施需要保持大量的種系成員作為繁殖種禽并在全世界很多地方復制這些繁殖種禽。以儲備為目的維持大量有價值動物是必需的，因為在繁殖系中保持遺傳多樣性也是重要的。通過在PGC細胞培養物中保持這些遺傳特征，可使得大M^莫儲備繁殖種群的花費得以避免。PGC的長期培養物對于從遺傳改造雞的卵生產藥物產品也具有極高的價值。應用PGC生產遺傳改造的雞需要在培養物中維持PGC的同時將遺傳修飾引入PGC的基因型。許多遺傳操作培養物中靶細胞的技術是眾所周知的。然而，主要的一個困難是，為了改變培養物中PGC的基因型，培養物必須保持存活足夠長的時間，以引入遺傳修飾并成功選擇轉化細胞，并且被轉染細胞在培養物中生長和增殖。能夠增殖的成功轉化細胞通過在克隆或接近克隆衍生之后的幾天至幾周內產生大量細胞(例如104至107個細胞)的能力來區分。創始細胞(foundercells)將是攜帶期望遺傳修飾的稀有細胞。典型地，在應用7>知的遺傳修飾技術(例如脂質體轉染法或電穿孔法)之后這些細胞在培養物中以10-4至10-7的頻率產生。因此，在培養物中生產細胞需要細胞傳代，為細胞增殖和產生足量細胞提供空間和營養，以允許選擇稀少的、經遺傳修飾的培養細胞。此外，培養條件必須足夠健壯(robust)以允許細胞從單個遺傳修飾細胞生長成104至107個細胞的集落，從而用于體外遺傳分析和用于生成嵌合體。因此，如果培養的時間長度可以被延長，而同時保留與真正PGC一樣的細胞基因型和表型，在當具種系嵌合能力的細胞(germlinecompetentcells)遷移入生殖腺時在胚胎發育的某一點上所述細胞就可以被工程化并且引入受體胚胎。在成熟時這些工程化的PGC將完全貢獻給所得動物中的精原細胞或者卵原細胞(即，精子和卵)的新生類群。在所得的這種動物中，全部體細胞組織將源于受體胚胎并且種系將包含來自供體細胞和受體胚胎的貢獻。由于對種系的混合貢獻，這些動物被稱為"種系嵌合體"。根據嵌合性程度，種系嵌合體的后代將或者源于供體細胞或者源于受體胚胎。雞種系起始是從進入新生內胚層的階段X(E-G&K)胚胎的外胚層而來的細胞(Kagamietal"(1997)MolReprodDev48，501-510;Petitte，(2002)JPoultrySci39，205-228)。隨著內胚層向前進，前原始生殖細胞被向前推入生殖新月(germinalcrescent)，在此它們可以i皮鑒定為大糖原裝載細胞(largeglycogenladencells)。才艮據這些形態標準在種系中對細胞的最早鑒定是在孵育開始后約8小時(階段4,由Hamburger和Hamilton,(1951)JMorph88,49-92所建立的分階段系統)。原始生殖細胞居于來自階段4(H&H)的生殖新月，直至它們在階段12-17(H&H)期間遷移通過脈管系統。在此時，原始生殖細胞是約200個細胞的小群體。從脈管系統，原始生殖細胞遷移入生殖脊并且隨著生殖腺分化而被并入卵巢或者睪丸(Swift,(1914)Am.,LAnat.15，483-516;Meyer,(1964)DevBiol.10，154-190;Fujimotoetal.(1976)Anat,Ree,185，139-154)。在迄今為止所有檢測過的物種中，原始生殖細胞還沒有在培養中長期增殖卻不分化成EG細胞。為了產生足量的細胞以便于通過傳統的電穿孔或者脂質體轉染法引入遺傳修飾，需要長期培養。典型地，這些方法需要105至107個細胞，并且因此從單個前體生成這些細胞需要17-24次倍增，假定所有細胞分裂是(1)同步的并且(2)產生兩個活的子細胞。向細胞基因組引入遺傳修飾是偶發事件，通常在1x104至1x106個細胞中有一個會發生。在遺傳修飾之后，細胞必須能夠從攜帶和/或表達遺傳修飾的單個細胞建立集落。該集落必須能夠擴大為105至107個細胞的群體，其可以通過PCR或者Southern分析以評估轉基因的忠實度并且提供隨后將注入受體階段13-15(H&H)胚胎的足量細胞。因此，需要另外17-24次細胞分裂以產生所述細胞群體并且需要總共34-58次倍增以產生遺傳修飾細胞的群體。假定細胞周期是24小時，需要最少34天和通常58天培養以產生用于注入階段13-15(H&H)受體胚胎的遺傳修飾原始生殖細胞。隨后所注入的細胞必須能夠定居于種系，形成功能性配子并在受精后發育成新個體。為了建立雞PGC的長期培養細胞系的幾次嘗試已經被才艮道過，但是沒有一次嘗試產生了可以持續的細胞系。在所有這些情況中，PGC的培養物已分化成EG細胞，iWO00/47717;WO99/06533;WO99/06534;Parketal.，(2003)Mol.Reprod.Dev.65,389-395;ParkandHan，(2000)Mol.Reprod.Dev.56，475-482，或者具有ES細胞表型的細胞，^WO01/11019。在另外一些情況中，PGC培養物只能維持5天(Changetal.,(1997)CellBiologyInternational21，495-499;Changetal.，(1995)CellBiologyInternational19，569-576)或者10天(Parketal"(2003)Biol.Reprod.68，1657-1662)。在另一情況中，PGC被維持培養了2個月，但是該細胞僅非常緩慢地增殖并且培養物不能傳代(Hanetal.,(2002)Theriogenology58，1531-1539)。PGC培養物的傳代能力是用于PGC遺傳修飾和用于最有價值的農業和繁育技術的長期培養物的關鍵性質。PGC細胞培養物的增殖能力對于選擇已通過轉基因的隨機整合或者通過位點特異性修飾而改變其基因組的細胞是必需的。在這兩種類型的遺傳修飾中，細胞獲得作為穩定整合入培養細胞基因組的遺傳修飾的比例非常低，其介于一萬至一億個細胞中有一個細胞(即1x104至1x108)的數量級上。由此，為了獲得來源于在培養細胞基因組中創建所述遺傳修飾的稀有事件的足夠細胞群體，需要建立快速生長培養物的能力。在從階段11-15胚胎分離后幾個小時內采用逆轉錄病毒載體已經遺傳^f務飾了雞原始生殖細胞(Vicketal.，(1993)Proc.R.Soc.Lond.B251，179-182)。然而，轉基因的大d、一般被限制在小于約15kb，通常小于10kb并且最常見是小于8kb,并且使用此技術不能建立基因組的位點特異性改變。在此之前還沒有報道過需要向培養鳥PGC基因組中插入大于15kb外源DNA的穩定遺傳〗務飾。對于可以穩定引入長期培養PGC細胞培養物的外源DNA轉基因大小的任何限制是對于在培養PGC基因組中實現有價值遺傳修飾之能力的關鍵限制，并且進而限制可通過種系傳遞給受體胚胎后代的遺傳修飾的類型。例如，向轉基因雞的基因組中引入編碼蛋白質的外源DNA是非常期望的遺傳修飾。如果可以創建成群的這種轉基因雞，則可以在這些雞中表達并從卵中收集大量有價值的蛋白質。鳥卵提供了生物活性蛋白質的理想貯藏所，并且提供了可以從中分離蛋白質的方便的環境。對于大量的轉基因技術，鳥類動物也是有吸引力的候選者。然而，對于鳥類物種應用全部的哺乳動物轉基因技術還沒有成功，這是由于缺少可以向其引4因修飾并且傳遞入種系的培養細胞群體。在最近的論文中，Sangetal.聲稱"PGC能夠在培養中維持并且在對鑒定基因打靶事件所必需的長時間中增殖而不在轉移后喪失其遷移至發育中生殖腺的能力是不可能的。"ProspectsforTransgenesisintheChick，MechanismsofDevelopment,121，1179-1186，(2004).因此，至今為止，還沒有創建遺傳轉染的PGC并且還沒有證明將引入鳥PGC的遺傳修飾傳遞至成熟的活動物。原始生殖細胞(PGC)是精子和卵的前體并且在大多數動物中在發育早期階段與體細胞組織分離。根據本發明，分離、培養并遺傳修飾雞PGC，同時維持它們定型至種系。此夕卜，誘導PGC分化成胚胎生殖細胞(EGC)，其類似于定型于體細胞組織的雞胚胎干細胞(ESC)。這些PGC定型于體細胞組織和種系并且提供有關雞基因組遺傳修飾的獨特來源。在本文所述的培養物中維持的PGC在維持培養時保持了特征性PGC形態。可以通過直接觀察來觀察PGC形態，并且通過常規技術來評估培養細胞的生長以確保細胞在培養中增殖。增殖的細胞培養物被定義為非終極的(non-terminal)并且在兩個不同時間點的后者上觀察到具有更大量的培養細胞。本發明培養物中的PGC在任何特定培養物中可以具有1xio5或者更多的細胞并且可以觀察到此數字隨著時間而增加。因此，本發明包括增殖中的PGC培養物，與培養期較早時間點相比，其在幾天、幾周或者幾個月之后含有更多數目的細胞。理想地，所述培養物包含有至少lx105個細胞并且在培養任何時間長度之后可以觀察到更高數目。而且，可以觀察到在培養物中PGC是優勢種，使得當考慮由非雞的飼養細胞所作的最小貢獻時，細胞培養物的增殖組分基本由雞原始生殖細胞組成，從而基本排除了其它的雞源細胞。所述培養物還表現出允許通過傳代而增殖的特性，使得可以從現有培養物分離細胞樣品或者等分試樣并且當其置于新培養基中時將表現出健壯的生長。通過定義，細胞培養物傳代的能力是指細胞培養物正在生長和增殖并且是非終極的。此外，本發明的細胞證明了在幾次傳代后建立種系嵌合體并且保持PGC形態的能力。如本文所述，這樣的增殖是適于穩定整合外源DNA序列的任何細胞培養物的基本特征。本發明的PGC可通過任何7>知技術獲得并且可以在本文所述的培養條件下生長。然而，優選地是，從階段15胚胎中獲取全血并將其直接置于下文所述的培養基中。這種方法不同于文獻中所描述的其它方法，在這些文獻所描述的方法中PGC在培養之前須經處理和分離步驟。不象常規的培養技術，為了在此描述的培養中提供大群的PGC，本發明的培養物和方法依賴于在來自全血的PGC和其它細胞之間的穩健的差異生長，這些細胞初始時可以在培養基中共存。因此，本發明提供直接源于全血的PGC培養物，其在培養中生成很大的細胞濃度，并且可以進行無限量的傳代，還表現出穩健的生長和增殖，4吏得培養中的PGC基本上是僅有的生長和增殖細胞。這些培養條件提供了本發明重要的優點，由此使得培養PGC的收集、保存和維持特別簡單和有效，并且提供餘沐細胞的易于獲得的來源，以建立將培養PGC細胞的基因型傳給后代的種系嵌合體。由本發明人在培養中維持的PGC已經證明了非終極培養物的存在并且目前其在培養中已存在了至少327天。在40、60、80或100天(和其中所有的整數值天數)觀察這些細胞時，它們以相同方式生長和增殖并且這些細胞如下所述繼續貢獻于種系嵌合體，并且因此，顯示出真實PGC的主要區別特征，即，當引入受體胚胎時全部貢獻于種系。本發明的培養方法包括采用全血，其包含紅細胞和其它的代謝活性細胞類型，將細胞混合物連同原始生殖細胞一起置于培養物中，以及讓培養物發展至基本由表現出本文所述長期培養物特征的鳥PGC所組成。本文所述的細胞培養技術避免了任何的細胞分離過程或技術并且僅僅依賴于差異生長條件以在培養中產生PGC優勢。在建立所述培養物和應用所述細胞用于農業或者轉基因目的的效率和效用方面，采用全血作為所建立和培養的PGC細胞的來源提供了有實用價值的優點。因此，在本發明的一個方面中，培養基用BRL細胞(布法羅大鼠肝，BuffaloRatLivercells)條件化處理，包含有成纖維細胞生長因子、干細胞因子和雞血清。以下將更加詳細地說明所述培養基的具體特征。在本發明的一個方面中，建立了具有大量PGC的培養物，這些PGC遺傳一致的并且其增殖產生長期細胞培養物。通過將PGC從增殖的長期培養物引入受體胚胎可以反復使用這些PGC建立種系嵌合體。在之前嘗試應用PGC來建立種系嵌合體中，能夠建立的嵌合體的數目受到根本性限制，這是因為不能培養保持PGC表型的真正PGC的長期培養物。因為通過本發明能夠實現長期培養物，就可以從同樣的細胞培養物建立任何數量的種系嵌合體并且可以建立具有遺傳一致性、源于PGC種系的完整群體的種系嵌合體。因此，本發明的一個方面是建立大量的，包括大于3、大于4、大于5、10、15和20個種系嵌合體動物，它們全都在其種系中具有遺傳一致性的PGC源的細胞。本發明的另一方面是建立在其種系中具有遺傳一致性PGC源的細胞的種系嵌合體群體，其在所ii^體中具有齡期差異，這反應了使用相同的長期細胞培養物來建立種系嵌合體。齡期差異超出了在一段時間中培養原始生殖細胞的目前可達到的能力并且無需冷凍就可以高達l卯天。因此，本發明包括在其種系中具有一致的PGC源細胞的兩種或者更多種種系嵌合體，其齡期差異超過40天、60天、80天、100天、l卯天等或者其中任何的整數值天數，而無需冷凍細胞。本發明還包括存在性成熟的種系嵌合體，所述嵌合體在其種系中具有遺傳一致的PGC源的細胞，以及存在用來建立這些種系嵌合體的非終極PGC培養物，并且從中可以建立另外的種系嵌合體。因為可以以絕對穩定的方式在培養中維持PGC，所以也可以冷凍保藏和解凍細胞，從而建立用于建立種系嵌合體的長期貯藏方法，這些種系嵌合體有能力產生由在培養中保持的PGC表型所定義的后代。產生大量種系嵌合體的能力還提供了將PGC源的基因型傳給種系嵌合體后代的能力。因此，本發明不僅包括在種系中具有遺傳一致性的PGC源細胞的種系嵌合體群體，還包括所述種系嵌合體的后代，其基因型和表型完全由在培養中生長的PGC的基因型所決定。PGC源的表型通過種系傳遞已在超過20種鳥中被觀察到，傳遞百分率高達86%。因此，本發明包括通過在培養中保持的原始生殖細胞的基因型的種系傳遞所建立的種系嵌合體的后代。因此，本發明包括以下每種都存在含有規定表型之PGC的原始生殖細胞培養物、具有同樣原始生殖細胞作為其種系一部分的種系嵌合體，和具有由培養PGC規定之基因型和表型的種系嵌合體的后代。如之前已描述的，長期PGC培養物的存在使得有能力用編碼外源蛋白質的或者引入其它期望的遺傳操作比如轉基因動物的基因插入和敲除的DNA穩定轉染培養細胞。因此，所有的上述培養PGC群體、種系嵌合體和種系嵌合體的后代也可以包含DNA構建體，所述DNA構建體穩定整合入原始生殖細胞基因組、傳遞給種系嵌合體的種系、以及傳遞給包含種系嵌合體后代的未來世代。原始生殖細胞可以包含幾乎任何工程化的遺傳構建體并且可以用來將超過當前由逆轉錄病毒技術所規定之大小限制的遺傳修飾引入鳥，包括對基因組的位點特異性修飾和/或插入編碼全長外源蛋白質比如單克隆抗體的轉基因。在一個優選實施方案中，遺傳工程化雞以組織特異性方式在輸卵管中表達外源蛋白質，從而在卵中表達外源蛋白質。本發明的PGC培養物是足夠穩定的從而使轉基因穩定地整合入PGC的基因組，從而在培養物中從未修飾的細胞中分離出遺傳修飾的細胞，以及從而將修飾細胞引入受體胚胎，而同時保持培養PGC貢獻于所得嵌合體中種系的能力。在由組織特異性啟動子控制轉基因表達的情況下，在PGC中將不表達所述轉基因。在這些情況中，轉基因將在種系嵌合體的轉基因后代的選定組織中進行表達。通過細胞雜交可以轉移整個基因組，通過微細胞可以轉移完整的染色體，通過染色體介導的基因轉移可以轉移亞染色體片段，以及通過DNA介導的基因轉移可以轉移千堿基范圍內的DNA片段(Klobutcher，LA.andFH.Ruddle,Ann.Rev.Biochem.,50:533-554,1981)。通過微細胞介導的染色體轉移(MMCT)可以轉移完整的染色體(Fo畫ier，R.E.andRuddle，F,H.P匿,NatLAcad.Sci"USA74:319-323，1977)。產生遺傳工程化雞的PGC的穩定長期培養物對于在鳥轉基因中的幾種應用來說是必需的，這幾種應用包括生產用于制藥工業的蛋白質，生產在其卵中沉積有人單克隆抗體的雞，以及對鳥基因組進行位點特異性改變用于任何的其他應用包括人序列多克隆抗體。可以改變在受體胚胎中供體源和受體源PGC的比率以有利于種系在PGC源嵌合體中的定居。在發育中的雞和鵪鶉胚胎中，隨著原始生殖細胞群體從生發新月向生殖腺脊的遷移，暴露于白消安將或者極大降低或者消除原始生歹直細胞的群體(Reynaud(1977a)BullSoc.Zool.Francaise102，417-429;Reynaud(1981)ArchAnat.Micro.Morp.Exp.70,251-258;Aige-GilandSimkiss(1991)Res.Vet.Sci.50，139-144)。當在醉育24至30小時后將白消安注入卵黃和在孵育50-55小時后將原始生殖細胞重引入脈管系統時，種系中重新群聚供體源的原始生殖細胞并且隨后產生供體源的配子(Vicketal.(1993)J.Reprod.Fert.98，637-641;Bresleretal.(1994)Brit.PoultrySci.35241-247)。本發明的方法包括從雞中比如從階段15胚胎的全血中獲取PGC,培養PGC,增殖PGC以增加它們的數量并使其大量傳代，從這些長期細胞培養物中建立種系嵌合體，以及獲得具有由培養PGC所提供基因型的種系嵌合體的后代。本發明的方法還包括在培養PGC群體中插入遺傳修飾以建立穩定轉染的PGC，從攜帶穩定整合轉基因的群體中選擇細胞，向受體胚胎注射攜帶該穩定整合轉基因的遺傳修飾細胞，使胚胎發育成在種系中含有該遺傳修飾的種系嵌合體，飼養該種系嵌合體至性成熟，以及繁殖該種系嵌合體以獲得轉基因后代，其中遺傳修飾是源于培養PGC。以下描述的是意想不到的發現可以從階段12-17(H&H)胚胎的血中分離PGC，細胞將快速增殖并保持它們的PGC表型，PGC可以以每天或者每2天或者每3天的間隔進行傳代，在培養至少110天后PGC將定居于種系而不是體細胞組織，可從已培養110天的細胞中獲得活的后代，通過用轉基因轉染可以遺傳修飾PGC，以及可以分離經遺傳修飾的PGC并且繁殖成遺傳修飾PGC的集落。根據本發明，已從采自具有大、圓形的階段14-16(H&H)胚胎(圖1)的血中獲得雞PGC細胞系。通過它們長期培養后的形態以及它們產生PGC源后代的能力證實這些細胞是雞PGC。此外，該PGC培養物表達種系特異性基因Dazl和CVH(圖2)并且培養細胞產生CVH蛋白質(圖3)。培養的PGC還表達端粒酶(圖4)，這表明它們具有永生化表型。此外，PGC在適宜的培養條件下將產生胚胎生殖(EG)細胞(圖5)。通過類比，當以類似方式進行處理時，小鼠和人的PGC將產生EG細胞。小鼠EG胞將貢獻于體細胞組織以及雞EG細胞也貢獻于體細胞組織，如在嵌合體中黑色羽毛著色所示(圖6)。雞PGC已經過遺傳修飾，如Southern分析所示(圖7)。在此實施方案中，CX啟動子穩定地整合入PGC基因組并且被用來促進編碼^Jj瞎苷磷酸轉移酶(APH)基因的表達，該基因也被整合于PGC基因組中并且被用來賦予對添加到培養基中以便于選擇遺傳修飾PGC的新霉素的抗性。實施例1.雞PGC培養物的來源采自階段14-17(H&H)胚胎終竇(sinusterminalis)的2-5血被培育在96孔板的培養基中，所述培養基含千細胞因子(SCF;6ng/ml或者60ng/ml)、人重組成纖維細胞生長因子(hrFGF;4ng/ml或者40ng/ml)、10%胎牛血清和80%KO-DMEDM條件培養基。優選地，從階段15-16(H&H)胚胎的脈管系統取1-3jiL。用輻照處理的STO細胞以3x104個細胞/cm2的濃度接種96孑L板的孔。通過在補充有10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素、2mM谷氨酰胺、1mM丙酮酸、1x核苷、lx非必需氬基酸和0.1mMp-巰基乙醇并含有5%胎牛血清的DMEM中培養BRL細胞3天直至匯合，來制備KO-DMEM條件培養基。24小時后，取出培養基并且條件處理新批次培養基3天。這被重復3次并且合并這3個批次來制備PGC培養基。培養約180天后，在包含40。/oKO-DMEM條件培養基、7.5%胎牛血清和2.5。/。雞血清的培養基中培育一個PGC細胞系。在這些^Hf下，PGC的倍增時間約為24-36小時。當開始培養時，優勢細胞類型是胎兒紅細胞。在三周內，優勢細胞類型是PGC類型。從個體胚胎起始的18種培養物中獲得兩種PGC細胞系。PGC系已經培養超過9個月，其保持圓形形態，并且保持不貼壁(圖1A&B)。在含有10%血清和10%DMSO的非C02依賴性培養基中超低溫保藏之后，已成功地解凍了PGC。實施例2.培養PGC表達CVH和Dazl07/(其是在果蠅中種系特異性基因VASA的雞同源物)的表達只限于雞的種系內的細胞并且由生殖新月中約200個細胞所表達(Ts匿ki畫etal.,2002)。對于雄性種系的正常功能來說，CW7表達是必需的；喪失CVH功能在雄性小鼠中引起不育(Tanakaetal，2002)。Z)"z/的表達在蛙(HoustonandKing,2002)、蠑螈(Johnsonetal"2001)、小鼠(Schrans-Stassenetal"2001)、大鼠(Hamraetal"2002)和人(Lifschitz-Merceretal.，2000)中限于種系。缺失導致在轉基因小鼠中的精子發生缺陷(Reijoetal.，1995)。32天后，用PBS清洗PGC，并沉淀，用OligotexDirectmRNA試劑盒(Qiagen)從組織樣品中分離mRNA。隨后采用用于第一鏈cDNA合成的SuperscriptRT-PCRSystem(Invitrogen)從9pi的mRNA合成cDNA。在隨后的PCR反應中使用2nl的cDNA。源于CTi/序列(登記號AB004836)、Dm/序列(登記號AY211387)或者(3-肌動蛋白序列(登記號NM—205518)的引物序列是V-1GCTCGATATGGGTTTTGGAT(SEQIDNO.1)V-2TTCTCTTGGGTTCCATTCTGC(SEQIDNO.2)Dazl-1GCTTGCATGCTTT丁CCTGCT(SEQIDNO.3)Dazl-2TGCGTCACAAAGTTAGGCA(SEQIDNO.4)Act-RT-1AACACQCCAGCCATGTATGTA(SEQIDNO.5)Act-RT-2T"ITCATTGTGCTAGGTGCCA(SEQTDNO.6)應用引物V-l和V-2擴增CKK轉錄物的751bp片段。應用引物Dazl-1和Dazl-2擴增Dflz/轉錄物的536bp片段。應用Act-RT-1和Act-RT-R擴增內源性雞(5-肌動蛋白轉錄物的597bp片段。用AmpliTaqGold(AppliedBiosystems)依照4吏用i兌明書實施PCR反應。實施例3.PGC表達CVH蛋白應用T-Per組織蛋白質提取試劑盒(Pierce)從新分離的PGC中提取蛋白質。通過在1%NP40;0.4%脫氧膽酸鹽化的66mMEDTA;lOmM，Tris,pH7.4中裂解細胞^1_取來自細胞的蛋白質。在4-15%Tris-HC1預制膠(Bio-Rad)上對樣品進行跑膠。轉移到膜上之后，如說明書所示用SuperSignalWestPico化學發光底物試劑盒(Pierce)實施Western印跡。用兔抗-CVH抗體作為第一抗體(1:300稀釋度)和用HPR-結合的山羊抗-兔IgG抗體(Pierce,1:100,000)作為第二抗體(圖3)。實施例4.培養的PGC表達端粒酶沉淀并用PBS清洗原始生殖細胞，在分析之前將其冷凍在-8ox:下。制備細胞提取物，并應用TRAPeze端粒酶檢測試劑盒(SerologicalsCorporation)根據使用說明進行分析，該試劑盒是基于端粒重復序列擴增方案(TRAP)(Kimetal"1994)，圖4。實施例5.可以從PGC培養物獲得胚胎生殖(EG)細胞通過讓細胞附著于板子，去除FGF、SCF和雞血清并在用于培養ES細胞的相同條件下培養所述細胞，已從PGC中獲得雞EG細胞(vandeLavoiretal"2006HighGradeSomaticChimerasfromChickenEmbryonicStemCells,MechanismsofDevelopment12，31-41;vandeLavoirandMather-Love(2006)ChickenEmbryonicStemCells;CultureandChimeraProduction,MethodsinEnzymology，inpress)。cEG細胞的形態與cES細胞的形態非常相似(圖5A、B)。當把cEG細胞注射入階段X(E-G&K)胚胎時，它們具有定居于體細胞組織的能力并且產生嵌合體，作為幼體，其看起來與用cES細胞制得的嵌合體相一致(圖6)。在新衍生的和克隆衍生的轉基因PGC系中觀察到雞EG細胞。對源于GFP陽性PGC的EG細胞的Southern分析(圖11)表明EG細胞源于PGC。實施例6.培養的雄性PGC在公雞中產生功能性配子從個體BarredRock胚胎中獲得雄性原始生殖細胞系。所述細胞系建立后，將細胞注射入階段13-15(H&H)的胚胎中。在表型上，醉出的雞類似于WhiteLeghorns。將雄性雞飼養至性成熟并且讓其與BarredRock母雞交配(表l)。黑色后代表現出注射PGC的種系傳遞。公雞種系傳遞率從<1%至86%變化(表1)。表l:注射入階段14-15(H&H)胚胎脈管系統的雄性原生殖細胞的種系傳遞<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>*每個值表示一個嵌合體的種系傳遞率也可以將PGC注射入階段X胚胎的胚下腔。在培養209天后將10冊或5000個PGC注射入經輻照處理的胚胎。使孵出的雄性小雞生長至性成熟并讓其繁殖以用于檢測種系傳遞。在用來檢測種系傳遞的4只公雞中，觀察到3只的頻率在0.15-0.45%之間變化。這指示當在原腸胚形成之前注射PGC時，其可以定居于種系。在"只雌性嵌合體的l625只后代中，沒有觀察到雄性PGC的種系傳遞。實施例7.培養的雌性PGC在母雞中產生功能性配子來自培養了66天的BarredRodk胚胎的雌性PGC被注射入階段13-16(H&H)WhiteLeghorn胚胎中，并且所有孵出的雞具有WhiteLeghorn的表型。將母雞飼養至性成熟并且讓其與BarredRock公雞交配(表1)。雌性PGC以最高為69%的頻率通過雌性嵌合體傳遞。(表1)。表2:注射入階段14-15(H&H)胚胎脈管系統的雄性原生殖細胞的種系傳遞<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>*每個值表示一個嵌合體的種系傳遞率也將雌性PGC注射入雄性受體WhiteLeghorn胚胎中。將雄性嵌合體飼養至性成熟并讓其與BarredRock母雞交配。在所檢測3只公雞的506只后代中沒有觀察到雌性PGC的種系傳遞。實施例8.源于PGC的后代在生殖上是正常的三只雄性和4只雌性非轉基因PGC源的后代在一起交配。有53至100%的卵有生育力(表3)并且有79至100。/。的受精卵產生孵化的胚胎(表3)，i^4明PGC源的后代在生殖上是正常的。表3:從種系嵌合體公雞獲得的PGC后代的生殖參數<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>實施例9.PGC對新霉素和噤呤霉素的敏感性確定PGC對新霉素和嘌呤霉素的敏感性，以確定允許在CX-啟動子控制下表達抗生素抗性的細胞生長所必需的新霉素和嘌呤霉素濃度，所述CX-啟動子在所有組織中都強烈表達(OrigenTherapeutics,未發表)。這些試驗證明，為了排除所有非轉染細胞，300網/ml濃度的新霉素維持10天時間是必需的。0.5網/ml濃度的嘌呤霉素在7-10天內足以排除PGC。實施例10.PGC的遺傳^旁飾將20微克(20nl)的Notl線性化cx-neo轉基因(見圖8)加入5.8x106已培養167天的PGC群體中。將細胞和DNA重懸于800pi電穿孔緩沖液中，并且施加8個672伏持續時間為100微秒的方波脈沖。10分鐘后，將細胞重懸于培養基中并等分于24孔板中。電穿孔后2天，每亳升培養基添加300ng新霉素以選擇表達cx-neo轉基因的細胞。細胞在選捧條件下保持19天。19天后，從選擇物中取細胞并擴增用于分析。一部分PGC在300ng/ml條件下再保持31天，這證明該PGC在功能上對所述抗生素具有抗性。參考圖8,對于質粒對照而言，cx-neo質粒DNA用Notl線性化，接著用EcoRI或者BamHI消化以產生片段，該片段比用HindIII消化所呈現的完整質粒稍小(5kb)。通過用Styl或Ncol消化釋放cx-neo質粒的約2kb內部片段。通過用EcoRI和Kpnl消化釋放約2.6kb的較大內部片段。用EcoRI、BamHI和HindIII消化來自PGC系的基因組DNA顯示大于6kb的帶，這表明cx-neo轉基因摻入到PGC基因纟且中。在用Styl、Ncol和EcoRI與Kpnl消化之后，在質粒DNA中所揭示的內部片段也存在于PGC的基因組DNA中，這指示cx-neo轉基因沒有變化地整合于PGC基因組中。采用常規轉基因構建技術，可以摻入另外的元件比如實例有調控元件、組織特異性啟動子和編碼蛋白質的外源DNA。單克隆抗體是由外源DNA編碼的蛋白質的優選實例并且人單克隆抗體是其中優選的。如上所述，只在非常少的物種中證明了在PGC中實施遺傳修飾來產生轉基因動物。通過參照在小鼠中應用ES細胞所實現的，可以在雞PGC中實現類似的遺傳操作。在小鼠中，為了產生嵌合體和轉基因后代，獨立應用同源重組然后將染色體轉移至胚胎干(mES)細胞中是眾所周知的。現已研發出位點特異性同源重組或者基因打靶的強大技術(見Thomas,K.R.andM.R.Capecchi，Cell51:503-512,1987;綜述見Waldman，A.S"Crit.Rev.Oncol.Hematol.12:49-64,1992)。插入克隆的DNA(Jakobovits,A.，Curr.Biol.4:761-763，1994)和通過Cre-IoxP系統技術操作和選擇染色體片段(見Smith,A.J.etal"Nat.Genet.9:376-385,1995;Ramirez畫Solis，R.etal.，Nature389:720-724，1995;USPatents4，959,317;6,130,364;6,130，364;6,091,001;5,985,614)可用于操作和轉移基因至mES細胞中以產生穩定的遺傳嵌合體。如果能獲得所必需的培養物的話，已證明可用于哺乳動物系統的許多這樣的技術將可用于雞PGC。通常認為原始生殖細胞基因組處于靜息狀態并因此染色質可處于高度凝聚的狀態。對常規電穿孔方法的大量試驗表明需要專門的方法將遺傳修飾引入到PGC的基因組中。如下所述，可以用源于雞p-珠蛋白基因座的絕緣元件(insulatorelement)圍繞轉基因以增強表達。(5-珠蛋白絕緣元件內含物通常產生可以進行生長、分析和注射入受體胚胎的克隆。用來驅動表達抗生素(例如新霉素、嘌呤霉素、潮霉素、his-D、殺稻痘菌素、zeocin和gpt)抗性基因的常規啟動子被普遍地表達。典型地，所述啟動子是源于"管家"基因比如p-肌動蛋白、CMV、或者泛素。盡管因為組成型啟動子通常在所有細胞中都以高水平表達而使得它們是可用的，但是它們在雞的整個一生中，如果不是全部的話也是在大部分組織中持續表達。一般來說，表達應當被僅限于需要表達的組織和發育階段中。為了選擇原始生殖細胞，需要表達的期間是培養基中存在有抗生素而它們居于體外的時候。一旦細胞被插入胚胎，優選終止選擇標記(即抗生素抗性基因)的表達。為限制抗生素抗性基因的表達，采用"神經誘導早期應答，，(earlyresponsetoneuralinduction,ERNI)啟動子。ERNI是一種在發育早期階段(例如階段X(E-G&K))和在培養期間選擇性表達的基因，因此應用該啟動子來驅動抗生素抗性基因的表達以選擇攜帶有遺傳修飾的PGC。因為ERNI只在發育的早期階M達，所以賦予抗生素抗性的基因不在成熟動物中表達。實施例11.長期性PGC細胞培養物的同質性為了在長期培養后確定PGC培養物的同質性，用抗-CVH抗體(一種抗雞vasa同源物的抗體)和1B3抗體對ES、EG、DT40(雞B細胞系)和PGC進行染色(Halfter，W"Schurer，B.，Hasselhorn,H.M.,Christ,B.,Grmpel,E.，andEpperlein，H.H.，Anovomucin-likeproteinonthesurfaceofmigratingprimordialgermcellsofthechickandrat.Z)eve/op附ew《122,915-23.1996)。抗CVH抗體的表達被限制于生殖細胞，因此對于它們而言抗CVH抗體是可靠的標記物。1B3抗原識別在雞PGC遷移并定居生殖腺期間存在于雞PGC表面上的卵粘蛋白樣蛋白質。在CMF/2。/。FBS中清洗細胞，在4%低聚曱醛中固定5分鐘，并再次清洗。用0,1%TritonX-100對有待進行vasa染色的細胞等分試樣進行透化處理1-2分鐘。加入第一抗體20分鐘后，清洗細胞兩次并與第二抗體(針對CVH和對照的Alexa488抗兔IgG以及針對1B3的Alexa488抗兔IgM)一起孵育15分鐘。作為對照，細胞的等分試樣只用第二抗體進行染色。在另外清洗2次后，制備細胞用于FACS分析。參照圖9，當用CVH和1B3Ab染色時，DT40、ES和EG細胞都顯示背景。然而，對于PGC而言，用CVH和1B3抗體染色則強得非常多。有一小群PGC，其不染色CVH或者1B3，這表明這一小群細胞不顯示PGC表型。用vasa和1B3抗體對兩個親代PGC系(PGC13和102)和源于PGC13親代細胞系的4種轉染細胞系(G-09、P84、P97/6和P97/33)進行染色。它們都顯示出同樣的模式，這表明各種PGC培養物包含同樣高比例的表達PGC表型的細胞。實施例12:原始生殖細胞的遺傳修飾用環狀CX-GFP質粒實施電穿孔揭示在PGC中的瞬時轉染率在1-30%間變化。應用100孩吏秒和800V的8個方波脈沖，我們獲得攜帶有CX-neo構建體的PGC細胞系，其#皮命名為G-09。見圖8。采用Southern印跡分析評估構建體的整合。然而，此穩定轉染細胞系的分離是不真實的事件，在接下來的試驗中沒有重現。除了G-09之外，在應用方波和指數式衰減脈沖的37個轉染試驗中，在用線性化構建體電穿孔17x107個PGC之后，沒有實現PGC的穩定轉染。在每個試驗中，PGC的量從lxl(^至10xl(^變化。對以下被廣泛地應用于小鼠、雞和人的ES細胞研究中的啟動子進行檢測CX啟動子，也稱為CAG(Niwa,H.,Yamamura，K.，andMiyazaki,J.，Efficientselectionforhigh-expressiontransfectantswithanoveleukaryoticvector.Gene108,193-9.1991)，其包括具有CMV增強子的雞P-肌動蛋白啟動子；PGK啟動子；MCI啟動子和Ubc啟動子。這些啟動子中沒有一個可以增加轉染效率。為允許表M擇標記以及遺傳修飾細胞系的克隆衍化，已經將絕緣子與整合構建體一起使用。絕緣子是DNA序列，其將活動的與不活動的染色質結構域分開并且使基因對鄰近增強子的活化效應、或者鄰近凝聚染色質的沉默效應絕緣。在雞中，位于p-珠蛋白基因座5，的5，HS4絕緣子已經由Felsenfeld和其同事充分表征(Burgess-Beusse,B,，F,dl，C',Gas廳r，M。，Litt，M。，Mutskov，.V"RedUas-Targa，:F"Simpson,.M"West,A"andFelsenfeld,d(2002)Theinsulationofgenesfromexternalenhancersandsilencingchromatin.Proc.Natl.Acad.Sd.USA99Suppl.4，16433-7)。該絕緣子保護卩-珠蛋白基因座避免組成型凝聚染色質上游區的影響。我們用驅動新霉素抗性的雞P-肌動蛋白啟動子并采用雞p-珠蛋白5，HS4序列作為雞p-肌動蛋白-neo-盒的5，和3，端的絕緣子來裝配轉基因。用以下引物組PCR擴增雞p-珠蛋白基因座的超敏位點4的250bp核心序列HS4-Bam-F:AGGATCCGAAGCAGGCTTTCCTGGAAGG(SEQID.NO.7)HS4-Bgl-R:AAGATCTTCAGCCTAAAGCTTTTTCCCCGT〔SEQID.NO,8)將PCR產物克隆至pGEM-T并測序。通過用BamHI和BglII消化處理pGEM克隆中的HS4來制備HS4位點的串聯重復以釋放插入序列，并用BglII使載體線性化。將HS4片段連接至含有HS4絕緣子拷貝的載體。篩選克隆并挑選出其中兩拷貝HS4取向相同的一個克隆。它被命名為2XHS4。實施例13:應用HS4p-肌動蛋白-neo的大批量選擇從Buerstedde(克隆574)獲得p-肌動蛋白neo并轉染至pBluescript。隨后在p-肌動蛋白neo的5，和3，端克隆2XHS4以產生HS4-p-肌動蛋白neo。應用此構建體實施8次轉染。對于每次轉染，將5xi(^個PGC重懸于400nl電穿孔緩沖液(SpecialtyMedia)并加入20ng線性化DNA。施加一個指數式衰減(ED)脈沖(200V,具有卯0-1100nF)或者8個方波(SW)脈沖(250-350V，IOO孩吏秒)。轉染后，在添加新霉素(300ng/ml)進行選擇之前，讓細胞生長幾天。每次轉染生長為一個庫(pool)。從8次轉染的5次中分離到抗性細胞。對2個庫的轉染細胞實施Southern分析(圖10)。對來自PGC系P84和P85的2ng基因組DNA和20pg質粒(HS4-卩-肌動蛋白neo)進行消化處理。在0.7%凝膠上對消化產物進行跑膠，通過10xSSC毛細管轉移將其過夜轉移至尼龍膜，并在RapidHyb(Amersham)中用放射性標記neo基因序列探針處理2小時。清洗后，印跡膜對膠片在-80X:曝光過夜。參照圖10，泳道1是P84，泳道2是P85和道3是質粒。對于質粒對照，用Notl使HS4-p-肌動蛋白-neo質粒DNA線性化。為獲得2.3Kb內部片段，用BamHl消化PGCDNA和線性化質粒DNA。P84和P85都顯示出大小為2.3Kb的內部片段。通過Hindl11消化釋放約2.6Kb的較大內部片段。該內部片段也出現在P84和P85消化產物中。如果轉基因被整合于基因組的話，用EcoRl和BglII消化P84和P85的基因組DNA應當顯示大于2.9Kb的條帶。在P84中，沒有見到連接片段，這表明P84是幾個不同克隆的復合物。在P85中，4,5-5kb的連接片段出現在EcoRl消化中并且5Kb的連接片段出現在BglII消化中，it^明P85被整合Aj^因組中并且該培養物基本上來自于一個克隆。這個實例表明絕緣子作為構件體的優選元件用于在原始生殖細胞中可靠表達選擇標記的效用。實施例14:經遺傳修飾的PGC的克隆衍生以下實施例表明原始生殖細胞的遺傳修飾系可以經克隆衍生。首先，制備(5-肌動蛋白-eGFP。用Xmnl和Kpnl從CX-eGFP-CX-puro釋放eGFP基因，用EcoRI和Xmnl從HS4-(3-肌動蛋白puro釋放卩-肌動蛋白基因，并以3-段連接(3-wayligation)將這兩個基因克隆至用EcoRI和Kpnl消化的pBluescript中從而產生(5-肌動蛋白EGFP。隨后，用BamHI和Kpnl釋放p-肌動蛋白eGFP(用T4DNA聚合酶產生平端)并將其克隆至用BglII和EcoRV消化的HS4-p-肌動蛋白puro中。應用此構建體實施5次轉染。對于每次轉染，5xl(^個PGC被重懸于400nl電穿孔緩沖液(SpecialtyMedia)并添加20pg線性化DNA。施加ED脈沖(150-200V;900jiF)或者SW(350V，8脈沖，100微秒)脈沖。轉染后，細胞被接種于獨立的48孔中并在進行選擇(0.5ng/ml)之前讓其生長幾天。在5次轉染的4次中觀察到總共5個克隆。通過Southern分析一個克隆TP103(圖11)。參照圖11，用Notl使質粒對照DNA線性化。通過用Kpnl消化DNA釋放內部片段。在TP103和所i^t粒中，釋放了同樣大小的片段。用Ncol、Mfel和Sphl消化TP103的基因組DNA應當顯示出大于消化質粒DNA對應泳道的條帶。在Mfel消化的TP103基因組DNA的泳道中沒有觀察到條帶，這可能是由于條帶太大的緣故。在代表Ncol和Sphl消化的泳道中，在TP103基因組DNA中釋放的片段顯著大于在質粒DNA中釋放的片段，ii^明轉基因被摻入TP103細胞系的基因組中。首先，通it^J"來自CX-EGFP-CX-puro(Xmnl-EcoRI)的puro、來自pBS中p-肌動蛋白neo(見上)(Sal-Xmnl)的卩-肌動蛋白和pBluescript(SalI-EcoRI)的3-段連接來制備卩-肌動蛋白puro。接下來，通過把BamHI消化的(5-肌動蛋白puro連接至BamHI/SAP處理的2XHS4載體，從而將P-肌動蛋白puro克隆至包含兩拷貝2XHS4的pBS中。應用此構建體實施三次轉染。對于每次轉染，4-5xl(^個PGC被重懸于400jil電穿孔緩沖液(SpecialtyMedia)并添加20嗎線性化DNA。施加200V、卯OpF的ED脈沖。轉染后，將細胞接種于獨立的48個孔中，并在進行選擇(0.5網/ml)前讓其生長幾天。在2次轉染中沒有觀察到克隆。從第三次轉染中分離到兩個克隆。用HS4-cx-eGFP-cx-Puro實施3次轉染。5x106個PGC被重懸于400Hl電穿孔緩沖液(SpecialtyMedia)并添加20fig線性化DNA。對每次轉染施加350V持續100微秒的8個SW脈沖。轉染后，將細胞接種于獨立的48個孔中，在進行嘌呤霉素選擇(0.5pg/ml)之前讓其生長幾天。從2次轉染中分離到總共16個克隆。用攜帶cx-neo選擇標"^己的質津立電穿孑LPGC13細胞系。在暴露于新霉素之后，得到對新霉素具有抗性的細胞系(G-09)。確定此細胞系的核型并且所有細胞在染色體2的p-臂中都表現出缺失(表3和圖12)。這些數據證明G-09是從攜帶有染色體2的p-臂中標記缺失的PGC克隆衍生而來。表3:G-09細胞系的染色體分析<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>實施例15:PGC中選擇標記的組織特異性表達基因ERNI從雞胚的前原條期(pre-primitivestreakstage)開始表達并且其是對來自亨森結信號的早期應答基因(Streit,A.,BerHner，A.J,，Papanayotou，C，Siruinik,A.,andStem,C.D.(2000)InitiationofneuralinductionbyFGFsignallingbeforegastmlation.Nature406，74-8)。而且ERNI在雞ES細胞中表達(Acloque，H,，Risson,V"Bkot,A.，Kimita，R"Pain，B.，andSamarut，J.(2001).Identificationofanewgenefamilyspecificallyexpressedinchickenembryonicstemcellsandearlyembryo.MechDev103，79-91)。除了獨特的5，和3'UTR序列之外，ERNI基因(也稱為cENS-1)具有特殊的結構，其中單一長開放讀碼框旁側有486bp直接重復序列。基于認為此結構是逆轉錄病毒LTR-樣結構的想法，Acloqueetal.2001分析了所述cDNA序列不同部分的啟動子/增強子活性，并發現在3，UTR中一個獨特的序列區域可作為啟動子。基本如所述(Acloqueetal.2001K殳計PCR引物以擴增ERNI基因3，UTR的822bp片段。擴增ERNI序列之后，它們被克隆至新霉素抗性基因的上游，具有SV40多聚A位點，從而產生ERNI-neo(1.8kb)。隨后將2XHS4絕緣子克隆至ERNI-neo選擇標記物盒的任一側。用HS4-Erni-neo實施兩次轉染。5x106個PGC被重懸于400pi電穿孔緩沖液(SpecialtyMedia)并添加20線性化DNA。在第一次轉染中，施加175V、900nF的單ED脈沖；在第二次轉染中，施加100孩史秒和350V的8個SW脈沖。轉染后，將細胞接種于獨立的48個孔中，在進行新霉素選擇(300jig/ml)之前讓其生長幾天。在第一次轉染中(ED脈沖)分離到5個集落，在第二次轉染中(SW脈沖)分離到ll個集落。分離到穩定轉染的克隆表明在PGC中表達了ERNI并且其可被用作組織特異性啟動子。實施例16:轉染PGC對種系的貢獻用HS4-j3肌動蛋白-GFP轉染PGC并將其注射入階段13-15(H&H)胚胎中。在第18天，獲取生殖腺，并對其固定、切片以及用CVH抗體染色以鑒定生殖細胞。^分析染色的切片，分析在生殖腺中是否存在GFP陽性細胞。在雄性(圖13)和雌性生殖腺中均發現GFP陽性生殖細胞。對這些胚胎的腦、心肌和肝的組織學制備物的檢測表明在一個栽玻片中只有4個綠色細胞。這些數據證明有些培養PGC被發現于某些異常位置中，但是絕大多數培養PGC優先定居于種系。為確定GFP陽性細胞是生殖細胞，切片用抗CVH抗體進行染色。如圖14中可以見到的，GFP陽性細胞也表現出針對CVH蛋白質的染色，這表明所述GFP陽性細胞是生殖細胞。參照圖14,GFP陽性細胞存在于此切片中并且DAPI/GFP圖表明這些GFP陽性細胞定位在生精小管內。當用抗CVH抗體染色生殖細胞時，它們顯示出強烈的紅染色圏，其勾畫出生殖細胞的細胞質。DAPI/CVH圖表明這些細胞定位在生精小管內。最后一張圖表明GFP陽性細胞也染色CVH以及生精小管含有GFP陰性的CVH陽性生殖細胞。實施例17.遺傳t"飾PGC的種系傳遞用以下轉基因之一轉染BarredRock的PGC:p肌動蛋白-neo、|5肌動蛋白-eGFP-p肌動蛋白-puro、cx-eGFP-cx-puro，轉染后PGC被注i入階段13-14(H&H)胚胎的脈管系統。孵化雞，橫/>雞生長至性成熟并讓其與BarredRock母雞交配以確定轉基因的種系傳遞。所有黑色后代是源于PGC的并且檢測其中轉基因的存在(表5)。通過用黑色雞的數目除以進行羽毛顏色評分的雞只總數來計算種系傳遞率(表5)。表5:遺傳修飾的原生殖細胞的種系傳遞<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>實施例18.轉基因以孟德爾方式遺傳在攜帶有經遺傳修飾而包括p肌動蛋白-neo、p肌動蛋白-GFP或cx-GFP之一的BarredRockPGC的嵌合體^^雞之間進行交配，對交配黑色后代分析其中轉基因存在的信息。如表6中所示，PGC后代的約50%遺傳了轉基因，W明是孟德爾遺傳。表6:轉基因的孟德爾分離<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>^至卡平方分^f斤與轉基因非轉基因后代的預期l:l比率沒有顯著差異實施例19.在攜帶有遺傳修飾PGC的嵌合體后代中轉基因的普遍表達帶有[5肌動蛋白-GFP穩定整合于基因組的PGC的嵌合體與野生型母雞進行交配并且對胚胎進行GFP表達的評分。在胚胎中表達的實例顯示在困15中，該圖顯示直至發育階段34(H&H)在轉基因后代的所有組織中表達GFP。在較年長的動物中，采用冷凍切片制備組織用于組織學檢查。來自l-2周齡雞的胰、皮膚、肺、腦、卵巢、腎、嚢(bursa)、十二指腸、胸、肝和脾的組織證明在孵化后動物中仍保持廣泛表達。實施例20:單克隆抗體在轉基因雞的卵白中的表達如上所示，此單克隆抗體只是可以采用本發明轉基因構建體表達的幾種類型單克隆抗體產物的一個實例。此外，作為一類蛋白質的單克隆抗體只是可以根據本文所述方法和技術以組織特異性方式表達的許多類蛋白質產物的一個實例。以下實施例可用來表達具有已知編碼序列的任何蛋白質或者抗體。被用來在雞輸卵管的管狀腺細胞中表達單克隆抗體的載體被稱作OvABC。該載體包含來自雞卵清蛋白基因座的完整BAC克隆，其中包括卵清蛋白結構基因和5，和3，側翼序列。將單克隆抗體盒(含有編碼人IgL的基因和編碼人IgH的基因，通過IRES序列連接)插入BAC上卵清蛋白基因中，使得卵清蛋白翻譯起始密碼子被融合于IgL起始密碼子，驅使在輸卵管中高水平表達單克隆抗體。在輸卵管中表達的抗體被分泌出來并沉積在卵白中。設計單克隆抗體的模塊式盒，為了容易地插入編碼任何期望單克隆抗體可變區的重鏈和輕鏈可變區基因而使得表達全長人IgGA:，而在其中策略性置入獨特的限制酶位點。此盒一旦經感興趣的可變區修飾，隨后就將其插入OvBAC用于在輸卵管中表達MAb。該盒包含人CA:恒定區、人Cyl恒定區以;51AkJ-C內含子和人Cy1上游內含子的部分區域。還存在VH基因的信號肽和下游小內含子；然而，不存在VL信號肽。IRES序列存在于IgL和IgH基因之間，從而從單個轉基因表達完整的抗體。可變區基因插入一個獨特限制性位點(比如對于VL的5VmBI或5V/I;對于VH的7VrwI或Pwd)，它們位于恒定區基因上游的內含子中。可變區基因必需包含剪接供體序列，從而它們被剪接至恒定區基因用于正確的表達。通過對來自雜交瘤基因組DNA或者來自源于所述雜交瘤的重組DNA經PCR擴增重排的被表達可變區基因。輕鏈的信號肽前導序列必須在擴增輕鏈V時添加；在所述盒中存在重鏈信號肽，所以當插入重鏈V時這是不需要的。對于VL基因而言，設計包括以下的PCR引物。在VL基因上游側的5，引物將包括SnaBI限制酶的識別位點；Kozak共有ATG和信號肽；和用于引發PCR反應的與感興趣V區同源的約20bp序列。如果在PCR中cDNA克隆被用作模板，那么信號肽外顯子應當已經被融合至VL基因的其余部分；否則，應當設計引物，以將人VL信號肽按照讀碼框添加至成熟可變區的N-末端。此步驟可能要求兩輪巢式PCR以添加必需的序列，因為如果一步添加信號肽的話，引物將很長。在VL基因的3，端上，設計PCR引物，其包括5^/1限制酶的識別位點；與感興趣V區3'端同源的約20bp序列；和約20bp的J-Cy內含子序列，包括用于剪接至下游Cy基因的剪接W^。對于VH基因來說，用于PCR擴增的5，引物包括A^/I酶的識別位點，約20bp的存在于信號肽序列的VH內含子(包括用于在模塊式盒中剪接至VH信號肽剪接供體的剪接受體)，11bp的VH信號肽編碼序列，以及與感興趣VH基因5，端同源的約20bp序列。所述3，引物包括與感興趣VH基因3'端同源的約20bp序列(對應J區)，約20bp的J-Cn內含子(包括用于剪接至CY1基因下游的剪接供體)和臉"I酶的識別位點。在插入模塊式MAb盒成體之前，克隆VL和VH的PCR產物并測序。通過重組工程將MAb盒插入卵清蛋白序列來修飾OvBAC克隆，如下文所述Copeland,N.Ci，Jenkins，N.A,，Court,D,L(2001),Recombineering:apowerfulnewtoolformousefunctionalgenomics.NatRevGenet2,769-79。通過翻新(retrofit)將選擇標記(新霉素或者嘌呤霉素抗性)添加至OvBAC，Wang，Z"Engler，P"Longaere，A。,Storb，U。(2001).Anefficientmethodforhigh-fidelityBAC/PACretrofittingwithaselectablemarkerformammaliancelltransfection.GenomeRes.11,137-42。實施例21:在轉基因雞卵白中的抗-IL-2Ra表"IL-2R<x受體特異性MAb的整體策略如下(見圖16和18)。在步驟1中，通過重組工程在大腸埃希氏菌中經過同源重組將抗-IL-2RaIgL/IgH盒插入OvBAC。隨后抗體處于Ov調節元件的轉錄控制之下。在步驟2中，通過Flp重組酶去除在重組工程中使用的卡那霉素基因。將來自人源化抗-IL-2Ra抗體的V編碼序列克隆至含有Ck和Cyl恒定區的盒中。用IRSE序列連接IgK和IgH基因，使得從單個轉基因構建體中表達這兩個基因，并且由此只需要單一BAC轉染。通過同源重組將抗體盒插入BAC上的Ov基因(LeeandCopdand,2001)。為了有效翻譯，將IgK基因融合于OvKozak翻譯起始序列。最后，將在PGC中作為選擇標記的ERNI-puro添加至BAC，用于PGC克隆的轉染和選擇。圖16顯示OvABC-抗-IL-2Ra的構建。為獲得重鏈和輕鏈可變區基因，對于每個基因，合成4個長寡核苷酸(有約20bp的重疊)并相互退火。用DNA聚合酶(來自細菌噬菌體T4)填充間隙。隨后，為了克隆至MAb盒中，用限制酶消化合成基因。用于構建人源化抗-IL-2RaMab(MAb序列來自專利5,585,089)的寡核苦酸如以下所示。輕鏈V基因(寡聚體l-4):寡聚體l:etcTCTAGA，cft;agagttcaccatggagaccgataccctectgctatgggtcctectgetatgggtoccaggatoaaceggag〃atettcagatgacccagtctccatctaccctetctgetagcgtoggggat(SEQID.NO.9)寡聚體2:ataaattagaagcl:tgggagetttgectggettctgetggtaceagtgeatgtaacttatacttgagctggcagagcaggttatggtgaccctatccccgaegctagcagagag(SEQID-NO.10)寡聚體3:gctcccaagcttctaatttataccacatccaacctggcttctggagtccctgctogc加agtggcagtggatctgggaccgagttcaccctcacaateagetototgeagecagatgattto(SEQID.NO.11)寡聚體4:ctoGCGATCGCcaatagtgaaaaattacgtttgacctccaccttggtcccctgaccgaacgtgagtgggtaagtactcctttgatggcagtaataagtggcgaaatcatctggctgcagagagctga(SEQID.NO.12)參照圖17,寡聚體1具有用于克隆的Xbal位點(大寫字母)，接著是VL信號肽(沒有內含子)。OvKozak翻^^起始序列加下劃線；最后三個核苦i^A起始密碼子。由雙斜線指示信號肽切割位點(在相應的蛋白質序列中)。寡聚體4具有用于克隆的Sgfl位點(大寫字母)，接著是用于剪接至Ck(下劃線)的人5，J4-Ck內含子的17bp序列。剪掩洪體G核苷酸用雙下劃線表示。寡聚體5:etcTCGCGAtctctotgttcacagg￡gjgsael￡t〃caggtccagcttgtccagtctggggctgaagtcaagaaacct;ggctcgagcgtgaaggtc(SEQID.NO.13)寡聚體6:cccagtcgacggattaatatatccaat.ccattccagaccctgtccaggggcctgccttacccagtgcatc;ctgtagctagtaa鄉tgtagccagaagccttgcaggagaccttcacgctegagccagg(SEQID.NO.14)寡聚體7:tatattaatccgtcgactgggtatactgaatacaatcagaagttcaaggacaaggcaacaattactgeagacgaatccaccaatacagcctacatggaactgagcagectgagatotgaggaca(SEQID.NO-15)寡聚體8:etcTCGCGAggccaU'cttac￡tgaggaga"gtgaccagggttccttggccccagtagtaaaagacccctxccectcttgcacagtotagac妙ggtgtcctoagak;toaggctgcl(SEQID,NO.16)寡聚體5含有用于克隆的Nml位點(大寫字母)，接著是人VH信號肽內含子3，端的15bp序列(下劃線)，接下來是來自人源化抗-IL-R2cxVH基因的VH信號肽外顯子序列的llbp序列(雙下劃線)。由雙斜線指示信號肽的切割位點(在相應的蛋白質序列中)。寡聚體8含有NrnI位點(大寫字母)，接著是人J-(>內含子5，端的12bp序列(下劃線)。剪接供體C核普酸由雙下劃線指示。混合寡聚體1-4,混合寡聚體5-8，在裝有沸水并讓其緩慢冷卻至室溫的燒瓶中使這兩種混合物退火。用DNA聚合酴修補互補鏈中的間隙。參照圖18，隨后利用i殳計入Vs的5，和3，端中的獨特限制性位點(在此實例中，Nrul用于重鏈V和Xbal/Sgfl用于輕鏈V')，將1gK和IgHVs克隆至含有Ck和Cyl基因的盒中。還參照圖18，在其上部顯示OvBAC，其具有Ov結構基因5，的110kb序列，以及Ov結構基因3，的30kb側翼序列。在3，端顯示ERNI-puro選擇標記。MAb盒顯示具有以下元件(從左至右)用于通過同源重組插入OvBAC的5，Ov同源臂；OvKozak和ATG;人VL信號肽(SiGVL);來自MAb的插AA輕鏈可變區基因(VL);J-Ck內含子；Ck基因；用于翻譯下游IgH基因的IRES;人重鏈信號肽(SiGVH);來自MAb的插入重鏈可變區基因(VH);J-Cy內含子；包括其內部內含子的Cy1基因；和用于插入OvBAC的3'Ov同源臂。(用于在細菌中選擇的卡那霉素基因未顯示。)為了將抗體盒插入OvBAC，通過向IgK-IRES-IgH盒添加同源臂制得重組工程乾向栽體。所述同源臂是來自Ov基因座的片段，其作用在于使所述抗體盒乾向于BAC中的Ov基因，這其中利用了在攜帶所述BAC的EL250大腸埃希氏菌菌林中實施的同源重組機制(LeeandCopeland，2001)。所述5，Ov同源臂是124bp的卵清蛋白序列，其對應位于Ov基因中OvKozak翻譯起始序列緊接上游的HincII-XbaI片段，并且具有以下序列5'-gttaacattoattgcxteaaaactgctogtaatttac1:gttgtegcctaccatagagtaccctgcatggtactatgtacagcattccatocttacattttcactgttctgctgtttgctctaga-3'(SEQID.NO.17)應用以下引物從雞的基因組DNA或者克隆的OvDNA經PCR擴增5，同源序列K8HincTI-F5'-GGATATAGCAACAGACACATTAC-3'(SEQID.NO.18)KS-TTTNotDCbaI-R5'-TITGCGGCCGCTCTAGAGCAAACAGCAGAAC-3'(SEQID.NO.19)所述的3，Ov同源臂是125bp的卵清蛋白序列，其位于卵清蛋白翻譯終止密碼子的緊接下游，該3，Ov同源臂具有以下序列5'-aaagaagaaagctgaaaa'dctctgtcccttecaacaagacccagagcactgtagtal;caggggtaaaatgaaaagtatgt加c,tgc加cagacttcatoaaagctggagctt'datotaga-3'(SEQID.NQ.20)獲得的3，Ov同源序列為使用以下引物從雞基因組DNA或者克隆的OvDNA擴增的152bpPCR產物Notl〇V(3'TAA)-F5'-AAAAGCGGCCGCAAAGAAGAAAGCTGAAAAAC-3'(SEQID.NO.21)3'OVTAA-R25'-CTCCGCGGCTCGAGTCTAGATTAAGCTCCAGCTT-3'(SEQID-NO.22)擴增5，和3，同源片段之后，將PCR產物克隆至質粒栽體比如pBhiescript并通過測序驗證。隨后，將同源臂置于MAb盒的任一側；5，Ov同源序列被置于IgL基因的5，側，3，Ov同源序列被置于IgH基因的3，側。通過同源重組將MAb盒插入OvBAC導致Ov結構基因缺失。用于靶向插入OvBAC的MAb盒的最終結構也在圖17中顯示。在用MAb盒轉化之后，需要選擇標記比如編碼卡那霉素抗性的基因，用于在攜帶OvBAC的大腸埃希氏菌中選擇同源重組體。因此，靶向載體還包含側翼有FRT位點的卡那霉素抗性基因。例如，通過Xmal和Bgll(Nt4644畫6131)從pIGCN21(包含IRES-eGFPcre-FRT-kan國FRT盒的載體，從NCI的NealCopeland實驗室獲得)釋放1.5KbFRT-Kan盒并被平端處理。隨后此片段被插入在側翼有Ov同源序列的MAb盒中的平端化NotI位點。經電穿孔使靼向載體進入攜帶野生型OvBAC的細菌中并選擇卡那霉素抗性菌落。通過克隆的限制性圖譜分析來評估正確靶向。大部分卡那霉素抗性菌落應當被正確靶向。隨后，通過在EL250菌林中經阿拉伯糖誘導Flp基因而瞬時表達Flp重組酶來去除抗性盒，由此得到OvBAC-抗-IL-2Ra。篩選卡那霉素敏感性克隆并通過限制性圖語分析來驗證。為了選擇BAC轉化的PGC細胞，在PGC中有活性的選擇標記隨后被加到BAC。我們已經4吏用由ERNI啟動子驅動的噤呤霉素抗性基因來獲取穩定轉化的PGC系。ERNI是一種在早期雞胚胎中特異性表達的基因，所以在成年轉基因雞中ERNI-puro標記將不表達。我們還發現在選擇標記側翼添加來自雞P-珠蛋白基因座的絕緣子元件將增加在轉染后所獲得PGC集落的數量。被稱為HS4的此元件隨后被克隆至ERNI-puro的任一側。通過翻新(retrofit)將HS4-ERM-puro添加至BAC(WangetaL，2001)。在轉染之前，用Ascl將最后的OvMAb抗-IL-2RaBAC線性化。實施例22.在轉基因雞卵白中所產生抗體的化學性質在轉基因雞管狀腺細胞中產生的抗體的化學性質將展現出獨特的性質。美國專利申請NO.腦49，229和(Zhu，L"etal.Nat.Biotech.23:1159-11692005)以引用方式具體地并入本文。明確地說，對在嵌合體雞中所產生抗體的單糖分析揭示了在碳水化合物組成上的差異并且顯示有N-乙酰葡萄糖胺殘基、甘露糖殘基和非常低含量的半乳糖殘基的存在。轉基因雞將展示出同樣的性質。在N-連接寡糖分布特征上的最大差異是，在由雞所產生的抗體中，存在高甘露糖型N-聚糖，缺少巖藻糖，和半乳糖殘基的含量非常低。這些特性由于幾個原因是很重要的。首先，沒有已知有抗原性的(xl-3Gal連接的證據。半乳糖濃度的降低，通常低于約2%的水平，這顯著降低了由含半乳糖的連接所產生的抗原性。第二，沒有已知也具有抗原性的N-乙醇酰神經氨酸殘基的證據。第三，在雞管狀腺細胞中產生的抗體基本上沒有巖藻糖基殘基，其增強抗體的ADCC活性。在本文中，"基本上沒有，，被定義為低于0.1%。第四，雞產生的抗體具有高甘露糖含量，通常大于40%，當在Balb/c小鼠中使用在CHO細胞中產生的抗體作為標準評估清除時，其增加了此抗體的清除率。連同這些有利的化學性質一起，預期抗體以在轉基因隨機整合入雞基因組或者不以組織特異性方式表達的條件下所觀察不到的濃度存在于卵白中。優選的濃度是在每個卵中抗體大于1mg，每個卵大于2mg，每個卵大于3mg,以及每個卵高達6mg。因為每個卵包含約25ml卵白，所以優選的濃度是大于40ng/ml，大于80ng/ml，大于120fig/ml,以及高達240jig/ml。為從卵白中提取和純化抗體，卵白首先以低剪切速率在室溫下混合30分鐘，接下來通過先前所述的改進方法沉淀卵粘蛋白。l體積均質化卵白懸液加入3體積的反滲透水中并攪拌30分鐘。用0.5M砩酸將稀釋后懸液調至pH6.0并隨后在12，100g離心20分鐘。將上清液用0,5M磷酸氬二鈉調至pH7.4并用結晶鹽調至150mM氯化鈉濃度。在ProteinA-SepharoseFF柱(AmershamBiosciences)上,以120cm/h線性流速純化人IgG。用5體積的加樣緩沖液(PBS，pH7.4)清洗吸附的人IgG，隨后用3mM辨酸進行洗脫。使用含230mMNaCl的60mM砩酸鈉(pH7.5)將洗脫的人IgG組分調至pH7.5，以達到40m磷酸鈉和150mMNaCl的終濃度。隨后通過0.2mm注射器式過濾器(Pall)過濾樣品。實施例23:結合親和性分析用LNCaP細胞(ATCC)上的PSMA作為抗原來分析結合。20萬個細胞/孔，一式兩份，與50nl指定濃度的抗體等分試樣一起孵育30分鐘。清洗細胞兩次，然后以1:200稀釋度、50nl/孔加入山羊抗人IgGPE標記抗體(JacksonImmimoResearch),在4"C下保持30分鐘。在含1%BSA的PBS中清洗細胞兩次并進行FACS分析。應用GraphPadPrism3.0(GraphPadSoftware)從結合曲線中確定MAb結合LNCaP細胞上PSMA的ECso值。在添加10%FBS、10mMHEPES、2mML國谷氨酰胺和1mM丙酮酸鈉的PRMI1640培養基中培養細胞。在雞管狀腺細胞中產生的MAbFl的抗原結合特性與在CHO細胞中產生的MAbFl的抗原結合特性進行比較。這兩種抗體制備物產生對在LNCaP細胞上表達的PSMA幾乎相同的結合曲線并具有相似的EQ。值。數據證明盡管雞源和CHO源的抗體有糖基化差異，但它們等效地識別和結合抗原。實施例24:抗體內化分析MAbFl結合PSMA導致抗體內化。在一個潛在應用中。MAb可以與細胞毒素偶聯，從而靶向和破壞表達PSMA的腫瘤細胞。通過用MAb和Hum-Zap(AdvancedTargetingSystems)與細胞一起醉育來確定與LNCaP細胞上PSMA結合之抗體的內化。HumZap是與核糖體失活蛋白一皂草毒蛋白(saporin)偶聯的山羊抗-人IgG抗體。當MAbFl/Hum-Zap復合體結合細胞表面上的PSMA并4皮內化時細胞就被殺死，然而單獨的抗體或者Hum-Zap對LNCaP細胞沒有毒性。在150jil含300ngHum-Zap和300ngFlMAb或者對照MAb的培養基中，一式三份，在37"C下醉育LNCaP細胞(10，000/孔)48小時。用CellTiter-GloLuminescentCellViabilityAssay(Promega)確定細胞增殖和存活。還通過在4"C下將抗體的細胞培養基稀釋液與10，000個貼壁LNCaP細胞/孔一起孵育2小時來進行內化分析。溫和地移除抗體溶液并用150含200ngHumZap的培養基替換。在37匸下賻育48小時后，確定細胞存活性。用Prism3。0(GraphPadSoftware)作圖確定對于抗體內化的ECso值。這兩種抗體制備物的內化具有相似的效率。當在一定抗體濃度范圍內進行檢測時，雞源和CHO源的MAbFl內化的EC50值是0.49nM。實施例25:MAb在BALB/c小鼠中的清除通過靜脈內注射放射性標記的抗體，平行分析雞產生的MAbFl和CHO產生的抗體在BALB/c小鼠體內的半衰期。采用Iodobead方法(Pierce)用1251輕微硤化處理(每個抗體少于1個I)10ng的MAb蛋白質。在試驗之前，用溶有0.1mg/ml碘化鉀的飲用水持續1周喂飼6周齡雌性BALB/c小鼠(TaconicFarms,Germantown,NY)。每種蛋白質用4只小鼠，將約600，000cpm的帶標記MAb靜脈注射入小鼠尾靜脈中，并且用整體Y計數儀(具有Ludlum計數器的Wm.B.JohnsonNal晶體檢測器)在選定時間測量整體放射性。通過對殘余放射性的指數回歸分析來計算半衰期。由雞管狀腺細胞產生的MAbFl在清除時的半衰期(t1/2)為102.4±0.9小時，而由CHO細胞產生的MAbFl清除得更慢，其半衰期為207.5±18.3小時。實施例26:ADCC分析用改進的"CrADCC分析檢驗LNCaP-C42B細胞。通過標準的Ficoll-paque分離法，從肝素化全血中純化人外周血單個核細胞。細胞4皮重懸(1x10E6個細胞/mL)于含10%FBS和10U/ml人IL-2的RPMI1640培養基中并在37"C下孵育過夜。在第二天，收集細胞并在培養基中清洗一次并以2x10"個細胞/ml的濃度重懸。在lml總體積中，2百萬把LNCaP-C42b細胞與200uCi51Cr—起在下醉育1小時。清洗靶細胞一次，并重懸于1ml培養基中，然后在37"C下再孵育30分鐘。在最終的孵育之后，靼細胞被清洗一次并調至1x1()S個細胞/ml的終體積。對于最終的ADCC分析來說，100nl標記的LNCaP細胞與50效應細胞和50nl抗體一起孵育。選擇1:100的最終靶:效應比率。在所有研究中，用人IgGl亞型作對照并與CHO源抗-PSMAMAbFl抗體進行比較。所包括的其它對照有a)靶細胞和效應細胞，但是沒有抗體，b)耙細胞，沒有效應細胞以及c)乾細胞和效應細胞，存在有3%TritonX-IOO。在37t:下孵育4小時之后，收集上清液并在具有240-400keV讀值窗的Y計數儀(來自PackardInstruments的CobraIIauto-gamma)上對其進行計數。每分鐘的計數作為抗體濃度的函數進行繪圖，并采用Prism軟件(SanDiego，CA)通過非線性回歸，s形曲線劑量效應(可變斜率)來分析數據。根據以下等式確定裂解百分率裂解％=(樣品CPM-無抗體CPM)/TritonXCPM-無抗體CPM)x100在所有研究中監測EQ。值和裂解。/。。例如，在比較兩種抗體時可能在EC5Q或裂解％方面之一有變化或者兩者都有變化。用以下的改進方法用抗-CD16抗體阻斷ADCC。在缺少或者存在5ng/ml抗-CD16抗體3G8或同型對照抗體的情況下，將細胞與1或0.01pg/ml由CHO產生的或者由雞產生的MAbFl抗體一起醉育。CHO源MAb誘導劑量依賴性細胞裂解，其在38%裂解達到平臺，與IL-2刺激的效應細胞一起ECs。值為0.11ng/ml。相比之下，雞卵源的MAb具有更強且更有效。用所述抗體的兩種不同制備物，雞卵源MAb的最大裂解百分率是60%。還證明了其超過CHO源MAb的更強效能，因為該材料的ECso值為0.018fig/ml。最后，正如所料，同型對照抗體不誘導細胞裂解。在未刺激的效應細胞(新鮮PBMC)的情況下，ADCC在EC50值上顯示出更大的差異，但是總細胞殺傷更低。CD16(FCgRIII)是介導ADCC的一種關鍵受體。通過使用抗CD16單克隆抗體阻斷耙細胞和效應細胞的相互作用證明了ADCC應答的特異性。在此研究中，使用兩種劑量的MAbFl抗體，這兩種劑量為飽和劑量(1jig/ml)和亞最優劑量(0.01ng/ml)。1fig/ml的MAbFl抗體，在缺少抗-CD16抗體的情況下，CHO源的和雞源的抗體分別誘導約15%和38%的裂解。在存在抗-CD16抗體的情況下此裂解百分率被降至~4%，而同型對照抗體沒有作用。實施例27:CD16結合使用由Biacore提供的胺偶聯試劑盒，經由伯胺將CHO和雞源的MAbFl固定至Biacore傳感器芯片(CM5)的羧曱基葡聚糖基質表面。這兩種抗體被包被至密度約為10,000RU。通過在固定化抗體表面上流過幾種濃度的蛋白質使這兩種抗體與CD16-Phe和CD16-Val結合。通過研究空白表面和空白緩沖液結合循環可以解釋非特異性結合作用。HBS-EP緩沖液被用于稀釋并且作為工作緩沖液(runningbuffer)。在Biacore-3000儀器上，在25t:下實施該試驗。用GraphPadPrism軟件分析數據并將數據擬合至單結合位點模型上以評估平衡解離常數。基于平衡結合試驗而不是速率常數來評估解離常數，因為快速動力學是FcR結合抗體的特有性質。與相應的CHO源的抗體相比，雞源抗體的解離常數Kn對于兩種FcR都要低約10倍。雞源抗體的較高親和性可以歸因于Fc區中的糖基化差異，尤其是由于缺少巖藻糖，其存在于CHO源的抗體中。實施例28:治療效用本發明提供具有特異性確定糖基化模式和其它化學性質的抗體，并且其已經應用上述遺傳修飾的雞而生產出來。為了在靶組織中結合抗原特異性靶的目的而施用于患者時，這些特性就提供了治療性質的改進。具體說，如上所述，對于某些臨床適應癥來說，所述抗體顯示出抗體依賴性細胞毒作用(ADCC)增強并且這種作用在某些臨床適應癥中提供了重要的益處。非偶聯(unconjugated)單克隆抗體(mAbs)用于治療一些類型癌癥的臨床試驗已經產生了令人鼓舞的結果。Dillman,1997,CancerBiother.&Radiopharm.12:223-225;Deoetal"1997,ImmunologyToday18:127。一種嵌合的、非偶聯的IgGl已經獲批用于治療低級或者濾泡性B細胞非4可杰金氏、淋巴瘤(Dillman,1997,同上)，而另一種非偶聯的mAb，一種靶向實體乳腺肺瘤的人源化IgGl在III期臨床試驗中也顯示出有希望的結果。Deoetal.，1997，同上。這兩種MAbs的抗原在它們各自的靶組織中高度表達。對于這些應用，尤其是在抗體通過ADCC介導強力腫瘤破壞時的肺瘤細胞中，本發明的抗體在施用給患者時就可以提供治療優勢。對于治療用途，本發明的抗體還可以功能性連接(例如，化學鍵合、遺傳融合、非共價鍵結合等)至一種或多種其它分子實體，比如另一抗體(例如，為了產生雙特異性或者多特異性抗體)、細胞毒素、細胞配體或者抗原(例如，為了產生免疫綴合物，比如免疫毒素)。本發明的抗體可以連接至其它治療性結構，例如，it射性同位素，小分子抗癌藥，消炎劑，細胞毒素或者免疫抑制劑。因此，本發明涵蓋這些抗體組合物，其具有能通過雞表達系統而實現之化學性質,并且與用于治療目的的基本所有已知抗體綴合、連接和相關技料目結合。因此，本發明的抗體可被用來治療和/或預防涉及在對治療敏感的乾組織中表達抗原之細胞的多種疾病，尤其是在把組織中展示出ADCC機制時。可以治療(例如改善)或者預防的疾病的實例包括，但不限于實體瘤、淋巴瘤、擴散瘤和所有類型的癌性組織。在本發明的一個治療實施方案中，將本發明的抗體施用給患者，尤其是根據通過表現出ADCC特性模式而對待治療病況的診斷。在這樣的臨床條件下，施用本發明的抗體并在治療之后確定治療的細胞毒性作用以確定在靶組織中的ADCC作用。除了本發明的治療組合物之外，患者還可以用化療劑、輻射、或者調節例如增強或者抑制Fc受體表達或者活性的試劑比如細胞因子進行額外的治療。典型地，在治療期間施用的細胞因子包括粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、干擾素-y(IFN-y)和腫瘤壞死因子(TNF)。典型的治療劑包括抗致瘤劑比如阿霉素、順鉑、博來霉素、卡氮芥、苯丁酸氮芥和環磷酰胺。在另一方面中，本發明提供一種組合物，例如藥物組合物，其包含本發明的雞表達抗體的一種或者組合。本發明的組合物可以用本領域中許多公知方法給藥。本領域的技術人員應當理解，給藥的途徑和/或模式將根據所期望的結果而變化。藥物可接受載體包括無菌水溶液或者分散系，并且這些介質和試劑對于藥物活性物質的應用在本領域中是已知的。可以通過在適當溶劑中摻入所需量的活性化合物以及一種成分或者成分組合，接著滅菌和/或微濾，來制備無菌注射溶液。一般來說，通過將活性化合物摻入含有基礎分散介質和任何其它成分的無菌載體中來制備分散系。調整給藥方案以提供最佳的期望ADCC作用。例如，可以使用單次推注，可以在一段時間內分幾次給藥劑量或者根據治療情形的緊急情況按比例縮減或者增加劑量。特別有利的是，為了方便給藥和統一劑量可以以劑量單位形式配制胃腸外組合物。如本文使用的劑量單位形式表示適用作單元劑量用于待治療對象的物理分離的單位；每一單位包含預定量的活性化合物，經計算該量的活性化合物與需要的藥物載體一起可以產生期望的治療效果。對于本發明劑量單位形式的規格受以下因素控制并且直接依賴于(a)活性化合物的獨特特性和期望達到的具體治療效果，以及(b)配合這種活性化合物對于治療個體中敏感性的內在限制。在本發明藥物組合物中活性成分的實際劑量水平可以改變，從而獲得對于特定患者、組合物和給藥模式而言可有效實現期望治療反應并且對患者沒有毒性的活性成分的量。所選的劑量水平將取決于許多藥物動力學因素，包括本發明所用特定組合物的活性、給藥途徑、給藥時間、正施用特定化合物的排泄速率、治療持續時間、與所用特定組合物聯合使用的其它藥物、化合物和/或物質、所治療患者的年齡、性別、體重、病況、整體健康和先前病史，以及在醫學領域中公知的其他因素。因為本發明抗體的給藥效果可以在靶組織比如腫瘤中客觀地觀察，所以本發明的治療方法包括診斷需要治療的患者，尤其包括采用ADCC治療，鑒定期望治療所作用的靶組織，給有此需要的患者施用本發明的組合物，以及測量患者中的治療效果，比如通過確定ADCC在患者靼組織中的功效。通過分析耙組織特性隨時間的變化，比如細胞死亡、靶組織的收縮、腫瘤大小的縮減以及在醫學領域中已知的任何其它診斷技術來確定治療效果。模型來檢^本^明抗體的ADCC活':^為了確定本發明抗體的治療i者診斷用途的效用，可以獨立地或者與其它哺乳動物、非哺乳動物、植物或者細菌細胞表達系統相比較來測量ADCC。因此，本發明的方法包括，通過使用本發明的抗體并與前述系統所產生的另一抗體直接或者間接地比較，確定它們在實現ADCC目標的效用方面的差異。具體地說，本發明的方法包括比較在上述雞表達系統中所產生抗體的ADCC作用以鑒定ADCC增強從而鑒定對于雞表達系統來說理想的候選抗體。如上所述，為增強治療效用，本發明的抗體可以與一種或者多種其它治療劑例如細胞毒性劑、放射毒性劑或者免疫抑制劑一起給藥。可以將抗體連接至所述試劑(作為免疫復合體)上或者與所述試劑分開給藥。在后者情形中(分開給藥)，可以在所述試劑之前、之后或者同時給藥所述抗體，或者與其它已知治療共同實施，例如，抗癌療法，例如放療。這樣的治療劑包括抗致瘤劑等，比如阿霉素、順鉑、博來霉素、卡氮芥、苯丁酸氮芥和環磷酰胺。本發明抗體與化療劑的共給藥提供了兩種抗癌劑，它們通過對人腫瘤細胞產生細胞毒作用的不同機制來發揮作用。這樣的共給藥可以解決由于產生藥物抗性或者由于腫瘤細胞產生抗原性變化使得它們對抗體沒有反應性而引起的問題。權利要求1.轉基因雞，其包含由遺傳修飾的原始生殖細胞定居的種系組織，所述原始生殖細胞包含編碼大于15kb大小的外源DNA的轉基因。2.權利要求l的轉基因雞，其中所述轉基因被穩定地整合。3.權利要求l的轉基因雞，其中所述外源DNA編碼蛋白質。4.權利要求3的轉基因雞，其中蛋白質是單克隆抗體。5.權利要求l的轉基因雞，其中所述轉基因包含人多核苦酸序列。6.權利要求1的轉基因雞，其中所述外源DNA的側翼有至少一個絕緣子。7.權利要求l的轉基因雞，其中所述轉基因包含選擇標記。8.權利要求l的轉基因雞，其中所述轉基因包含ERNI啟動子。9.轉基因雞，其基因組包含轉基因，所述轉基因包含大于10kb的外源DNA。10.權利要求7的轉基因雞，其中所述轉基因被穩定地整合。11.權利要求7的轉基因雞，其中所述外源DNA編碼蛋白質。12.權利要求7的轉基因雞，其中蛋白質是單克隆抗體。13.權利要求7的轉基因雞，其中所述轉基因包含人多核苷酸序列。14.權利要求7的轉基因雞，其中所述外源DNA的側翼有至少一個絕緣子。15.權利要求l的轉基因雞，其中所述轉基因包含選擇標記。16.權利要求l的轉基因雞，其中所述轉基因包含ERNI啟動子。17.—種產生轉基因雞的方法，其包括將大于10kb的轉基因摻入原始生殖細胞，將該原始生殖細胞插入受體胚胎，孵化轉基因雞。18.權利要求17的方法，其中所述轉基因被穩定地整合。19.權利要求17的方法，其中所述外源DNA編碼蛋白質。20.權利要求17的方法，其中蛋白質是單克隆抗體。21.權利要求17的方法，其中所述轉基因包含人多核苦酸序列。22.權利要求17的方法，其中所述外源DNA側翼有至少一個絕緣子。23.權利要求17的方法，其中所述轉基因包含選擇標記。24.權利要求17的方法，其中所述轉基因包含ERN1啟動子。25.雞原始生殖細胞的克隆性來源細胞培養物，其中所述雞原始生殖細胞攜帶有穩定整合于該原始生殖細胞基因組的外源DNA。26.權利要求25的培養物，其中所述培養基包含來自布法羅大鼠肝(BRL)細胞的條件培養基。27.權利要求25的培養物，其中所述培養基包含成纖維細胞生長因子(FGF)。28.權利要求25的培養物，其中所述培養基包含干細胞因子。29.權利要求25的培養物，其中所述培養基包含雞血清。30.權利要求25的培養物，其中所述培養物包含至少lxl()S個細胞。31.權利要求25的培養物，其中所述外源DNA側翼有至少一個絕緣子。32.種系嵌合體雞，其包含由遺傳修飾的原始生殖細胞定居的種系組織，以及基本沒有遺傳修飾細胞的體細胞組織。33.權利要求32的種系嵌合體，其中所述遺傳修飾是穩定整合外源DNA。34.權利要求33的種系嵌合體，其中所述外源DNA編碼蛋白質。35.權利要求34的種系嵌合體，其中蛋白質是單克隆抗體。36.權利要求35的種系嵌合體，其中所述單克隆抗體具有人多核苷酸序列。37.權利要求34的種系嵌合體，其中所述外源DNA側翼有至少一個絕緣子。38.原始生殖細胞，其包含穩定整合的轉基因，該轉基因具有可表達的神經誘導早期應答(ERNI)啟動子，該啟動子操作性地連接所述轉基因的編碼區。全文摘要本發明涉及從鳥PGC長期培養物而獲得的轉基因雞和其生產技術以及源于長期PGC培養物的轉基因鳥。在一些實施方案中，這些PGC可用遺傳構建體轉染以修飾PGC的DNA，尤其是引入編碼外源蛋白質的轉基因。當通過已知方法與宿主鳥胚組合時，那些修飾PGC通過種系傳遞從而產生轉基因后代。本發明包括包含可通過基因打靶進行遺傳修飾的PGC的長期培養物的組合物，其可接受大量的外源DNA并向受體胚胎的種系作貢獻。文檔編號A01K67/00GK101155509SQ200680010896公開日2008年4月2日申請日期2006年2月1日優先權日2005年2月1日發明者瑪麗-塞西爾·萬·德·拉瓦爾,菲利普·A·萊頓申請人:奧瑞金治療公司