專利名稱：：一種培育抗黑腐病甘藍類蔬菜的方法
技術領域：
：本發明涉及一種培育抗黑腐病甘藍類蔬菜的方法。技術背景甘藍類蔬菜包括結球甘藍、花椰菜、綠菜花、球莖甘藍、芥藍、抱子甘藍、羽衣甘藍等，是我國的主要蔬菜類群，在蔬菜周年供應及外貿出口中占據重要地位。黑腐病是我國長久以來危害甘蘭類蔬菜生產的主要病害之一，其致病菌有6大類生理小種，其中生理小種1及4是主要致病小種，但目前栽培種中普遍存在的是對生理小禾中3的抗性(Vicente,J.G.,Conway,Roberts,S丄,andTaylor,J.D.IdentificationandoriginofX"W/zoOTOwoyca，e欲/spvcperfWj1racesandrelatedpathovars.Phytopathology,2001，91:492-499;Vicente,JG.，TaylorJD,SharpeAG,ParkinIAP，LydiateDJ,KingGJ.Inheritanceofrace-specificresistanceto^im/Aomowaypv.ca附/e血、in5myw'cagenomes.Phytopathology,2002,92:1134-1141.)，缺乏對主要致病菌的抗原。緣于病原菌的多變性、多樣性，植物在長期進化過程中也伴隨產生了不同的抗性基因。根據病原菌與寄主抗性的基因對基因理論(PuhlerA，ArlatM,BeckerA.Whatcanbacterialgenomeresearchteachusaboutbacteria-plantinteractions*Currentopinioninplantbiology,2004,7:137-147.)，存在于不同物種中的抗病性來自于不同的基因。因此實現不同物種間的抗性基因轉移，對于獲得新的抗病種質，以及利用這些種質培育新的抗病品種具有重要意義。在長期自然選擇下，蕓薹屬作物一些近緣野生種有許多對病蟲害具備高度抗性以至免疫力。要利用這些抗性基因，一個方法是克隆基因，并通過基因工程手段導入目標材料中。但是許多抗病性是受多基因控制，僅分離、導入一個基因，轉基因材料獲得的抗病性常不理想。而且，對于抗性基因的分析、定位、克隆和轉化存在著技術難度大，周期長，投資高，以及市場的準入和接受程度等問題。另一個方法可以通過有性雜交的手段，向栽培品種引入抗性基因，但是物種間的生殖隔離使常規的有性雜交非常困難甚至不可能。而借助細胞雜交手段卻可以實現遠緣種間的核質基因融合，達到向栽培種中引入野生優異基因的目的，而且它在細胞質基因控制性狀，多基因控制性狀的引入上還具有明顯優勢。采用細胞雜交手段，已在多種作物的種質創新上產生了眾多成果。如小麥上獲得了抗鹽以及具新的HMW麥谷蛋白亞基的高代體細胞雜種(于智勇，譚瀟軼，薛哲勇，夏光敏.高冰草與小麥體細胞雜種后代的耐鹽性和麥谷蛋白分析.高技術通訊，2006，16(5):511-516。)；獲得了抗軟腐病的馬鈴薯種間體細胞雜種(TekAL，StevensonWR，HelgesonJP，etal.Transferoftubersoftrotandearlyblightresistancesfrom5b7朋鵬力rew'ofe"51intocultivatedpotato.TheorApplGenet,2004，109:249-254.);在甘藍型油菜上獲得了新的抗病種質(SjOdinCandGlimeliusK，1989b.Transferofresistanceagainstp力o鵬h."卵邁to^firassics"邵〃sbyasymmetricsomatichybridizationcombinedwithtoxinselection.Theor.Appl.Genet.78，513-520.LeliveltCLC，LeunissenEHM,FrederiksHJ"，HelsperJ"PFGandKrensFA.1993.Transferofresistacetothebeetcystnematode(HeteroderaschachtiiSchm.)from57朋/iss2ZsL(whitemustard)tothe■SrassJ.cs朋/wsLgenepoolbymeansofsexualandsomatichybridization.TheorApplGenet,85:688-696.)等等。尤其具有代表性的是將原來存在于蘿卜中的"0gura"型細胞質雄性不育基因，通過體細胞雜交手段轉移到甘藍型油菜等中(PelletierG.1986.Plantorganellegeneticsthroughsomatichybridization.Oxfordsurveysofplantmolecularandcellbiology,3，97-121.),并且經過進一步的非對稱融合中，供體和受體細胞器的重組，在后代中獲得了在低溫下葉片保持正常綠色以及抗除草劑(triazine)的Ogucms胞質雄性不育育種材料，該材料在各國的育種工作中已得到廣泛應用。黑芥是十字花科蕓薹屬的一個野生種，有研究表明黑芥基因組中存在對黑腐病主要致病小種1及4的高抗性(Vicente,JG.，TaylorJD，SharpeAG，ParkinIAP，LydiateDJ，KingGJ.Inheritanceofrace-specificresistancetoiknf力o/K^3sca;zpestrispv.ca/wpestrj'sinSrassicsgenomes.Phytopathology,2002，92:1134-1141.)。
發明內容本發明的目的是提供一種培育抗黑腐病甘藍類蔬菜的方法。本發明所提供的培育抗黑腐病甘藍類蔬菜的方法，包括以下步驟1)將對黑腐病具有抗性的黑芥(^^sw'c3/^^^)和甘藍類蔬菜進行細胞融合，獲得雜種細胞；2)離體培養所述雜種細胞，獲得再生植株，得到對黑腐病具有抗性的甘藍類蔬菜雜種。所述抗黑腐病甘藍類蔬菜具體可為花椰菜。所述方法中，用于進行細胞融合的黑芥("rssw'ca/^^<3)的供體可為葉肉原生質體。當所述甘藍類蔬菜為花椰菜時，用于進行細胞融合的所述花椰菜的受體可為下胚軸原生質體。所述花椰菜具體可為花椰菜(Ao/eraceavar./otJT"s)，在北京市農林科學院北京蔬菜研究中心的編號為0307。所述細胞融合可通過聚乙二醇介導，如PEG-1450。所述步驟2)中，所述雜種細胞在原生質體培養基中培養到細胞進入l一2次分裂時，轉入愈傷組織培養基中進行愈傷組織的誘導培養，當培養至愈傷組織大小為l-5mm時，再轉入分化培養基中進行不定芽的誘導培養，培養至幼苗的真葉形成時，再轉入生根培養基進行生根培養，獲得再生植株。所述原生質體培養基具體可為B5基本培養基的大量元素、微量元素和有機成分，并附加水解酪蛋白140-160mgL—'、二水合氯化鈣865-885mg!/1、山梨糖醇45500mgL—\甘露醇45500mgL—1、葡萄糖2500mgL_1、2-脫氧-核糖115-135mgL—'、2，4-二氯苯氧乙酸0.4-0.6mgL_1、萘乙酸0.15-0.25mgL—'和6-節氨基嘌呤0.15-0.25mgL—'的pH5.8-6.0的液體培養基；所述愈傷組織培養基具體可為B5基本培養基的大量元素、微量元素和有機成分，并附加水解酪蛋白140-160mgL—'、蔗糖25000-35000mgL-'、2，4-二氯苯氧乙酸0.4-0.6mgL-'、萘乙酸O.15-0.25mgL-1和6-芐氨基嘌呤0.15-0.25mgL—1的pH5.8-6.0的固體培養基；所述分化培養基具體可為MS基本培養基的大量元素和微量元素，B5基本培養基的有機成分，并附加水解酪蛋白130-170mgL-1、蔗糖25000-35000mgL-\萘乙酸O.15-0.25mgL-1和6-芐氨基嘌呤2.0-3.0mgL—1的pH5.8-6.0的固體培養基；所述生根培養基具體可為固體MS基本培養基。所述方法中還可包括對所述再生植株進行靶標病害抗性鑒定、和/或分子標記鑒定、和/或基因組大小鑒定、和/或染色體數目鑒定、禾口/或形態鑒定的步驟。本發明利用細胞雜交技術，克服常規育種中的種間雜交障礙，將存在于十字花科野生材料黑芥中的多種抗病基因轉入甘藍類蔬菜基因組，培育得到抗病甘藍類蔬菜，如具有黑腐病抗性的花椰菜。圖1為花椰菜0307下胚軸原生質體與黑芥(iSra"ica/^gra)葉肉原生質體的融合及培養照片圖2為融合后細胞培養形成的愈傷組織照片圖3為自愈傷組織上形成的再生植株照片圖4為花椰菜0307、黑芥(萬rasw'ca/^gra)及其雜種再生植株的SRAP分析圖譜圖5為流式細胞儀分析雜種細胞核DNA含量結果圖6為根尖染色體計數分析照片圖7為雜種及親本葉型比較照片圖8為黑芥(7ras^c3^>ra)、花椰菜0307及其體細胞雜種的形態學比較及黑腐病抗性鑒定具體實施方式以培育抗黑腐病的花椰菜為例，闡述本發明的培育抗黑腐病甘藍類蔬菜的方法。本發明的培育抗黑腐病花椰菜的方法，具體包括以下步驟-1、對花椰菜及黑芥進行黑腐病原菌的人工接種抗性鑒定，明確其抗感特性；2、以具有良好原生質體培養能力的花椰菜下胚軸原生質體為受體，以抗病黑芥的無菌苗葉肉原生質體為供體，通過聚乙二醇(PEG)介導的體細胞雜交獲得黑芥與花椰菜的雜種細胞；3、通過雜種細胞的離體培養，獲得再生植株；4、采用染色體計數、基因組大小分析、同工酶譜分析、分子標記等手段在再生植株中篩選鑒定出黑芥-花椰菜的雜種；5、對雜種通過組培擴繁后，構建抗病鑒定群體，進行人工接種抗病性鑒定，篩選出對黑腐病具有高抗性的花椰菜-黑芥雜種材料。下面通過實施例詳細闡明本發明的技術方案。下述實施例中的實驗方法，如無特別說明，均為常規方法。實施例1、培育抗黑腐病的花椰菜一、黑芥、花椰菜黑腐病抗性的鑒定所用黑芥(^rassj'c3^'^ra)(ZhuJS，DStruss，GR(3bbelen，1993.StudiesonresistancetoJi/3《柳in^rassica"apwrjSra5^.ca"i^raadditionlines.PlantBreeding111,192-197)。所用花椰菜((丑Weraceavar,6"2y"s)為北京市農林科學院蔬菜研究中心收集的種質資源，編號0307(姚星偉，劉凡，云興福，趙私，RyschkaU,SchumannG.非對稱體細胞融合獲得花椰菜與i5rassic3印i/7esce/2s的種間雜種。園藝學報，2005，32(6):1039-1044)，以下簡稱花椰菜0307。黑腐病菌生理小種1和4的混合菌株分離自北京地區高度發病的甘蘭類蔬菜。其分離方法及植物的抗病性鑒定方法和標準采用下述文獻中描述的方法和標準(張恩慧,程永安，許忠民，王妍妮，馬青山.甘藍3種病害抗源篩選及抗病品種選育研究.西北農林科技大學學報(自然科學版)，2001，29(6):30-33)。黑腐病菌生理小種1和4的鑒定方法按照下述文獻中描述的方法進行Vicente,J.G.，Conway,Roberts，S丄，andTaylor,J.D.IdentificationandoriginofJfa"決o,wosc/^她pvcam/7e5f〃、racesandrelatedpathovars.Phytopathology,2001,91:492-499.先將菌液濃度調整到107108CFU/mL，對4-5真葉期苗采用醫用噴霧器進行人工葉面接種。接種前后植株分別保濕24h。黑芥(i5rasw'caw>r3)和花椰菜0307各接種30株。在20-3(TC環境中培養，常規管理。接種后14天調査發病情況，黑芥(Arasw'cam^ra)和花椰菜0307每株各調査3葉，共調査了180片葉。病情依病斑擴展深度劃分為0-9級。病情指數為0-2的為高抗，2-15的為抗，15-30的為中抗，30-50的為感病。其中，病情調查以葉片為單位進行普査，病害分級標準如下0級無病斑；l級接種葉片出現褪綠斑，擴展深度卜3mm;3級V型壞死斑擴展深度4-6mra;5級V型壞死斑擴展深度7-lOmm;7級V型壞死斑擴展深度11-15mm;9級V型壞死斑擴展深度16mm以上；病情指數=(E(各級病葉數X相對級數值)/(調査總葉數X9))X100。結果表明黑芥(^^5W'ca/7^rs)的病情指數為l.11,即對接種黑腐菌表現高度抗性。花椰菜0307的病情指數為31.77，為感病類型(圖8)。二、黑芥與花椰菜原生質體的融合、培養及再生株誘導1、黑芥及花椰菜原生質體的分離、純化及融合花椰菜0307種子常規消毒后，在MS基本培養基上萌發，24。C暗培養6d后，取下胚軸用于原生質體制備。黑芥(&^sWca;n'^^)無菌苗培養在MS基本培養基中，每30天繼代一次，實驗中每次取3-5片幼葉用于葉肉原生質體制備。按照本實驗室建立的蕓苔屬植物下胚軸及葉肉原生質體的分離純化方法獲得純凈原生質體(1)花椰菜原生質體的制備取在暗培養箱發芽56d的下胚軸5080個，放入加有4mL原生質體培養基〔B5基本培養基(Gamborgetal,Planttissueculturemedia.Invitro，1976，12:473-478)的大量元素、微量元素和有機成分，附加水解酪蛋白150mgL;1、二水合氯化鈣875mgL—'、山梨醇45500mgL一1、甘露醇45500mgL—1、葡萄糖2500mgL—'、2-脫氧-核糖125mgL—'、2,4-二氯苯氧乙酸0,5mgL-'、萘乙酸0.2mg1/'和6-芐氨基嘌呤0.2mgL—、PH5.86.0;過濾滅菌)的09cm培養皿中，橫切成O.10.5mm小段后，將培養基吸出，再加入5mL質壁分離液(54.6gL—1Sorbitol,7.4gL—'CaCL2H20，pH5,6-5.8,121X:滅菌20min)，用封口膜將培養皿封住，放入24'C暗培養箱中靜置1h。1h后，去掉質壁分離液，加入68mL酶解液V(1.0%CellulaseR-IO，0.1%MacerozymR-10，溶解在含585mg'L—1MES，100mg*L—1NaH2P04，1g'L—1CaCl2.2H20，63.7g'L-1mannitol，63.7g*L—1sorbitol的溶液中，pH6.0,過濾滅菌)，置搖床中25°C、30rpm，酶解1216h。然后用孔徑5080ixm的尼龍網將濾液過濾至無菌離心管中，沿管壁緩慢加入24mL清洗液W5(18.4gL—taCL2H20，9.0gL—'NaCl，0.8gL—to，1.OgL—'Glucose，pH5.6-5.8，121。C滅菌20min)至10mL，1200rpm離心10min。收集酶液與清洗液W5溶液界面之間的原生質體于一個新的離心管中，用W5溶液洗滌兩次，每次1000rpra離心5min。原生質體洗滌完畢后，用原生質體培養基調濃度至2Xl()6個/ml，用于原生質體融合。原生質體培養濃度為1X105個/ml。(2)黑芥(5ra^ica/n'gra)葉肉原生質體的制備取1520d繼代一次的黑芥(i5rasw'ca/2^T3)無菌組培苗完全伸展的幼葉56片，將其放入加有5mL上述原生質體培養基的培養皿中，切成0.5lmm寬的細條，培養皿用封口膜封住，放入暗培養箱中，24。C質壁分離5h。5h后加入23mL的酶解液I(2%CellulaseR-10，0.5%Driselase,0.5%Hemicellulase，1.0%Pectinase，溶解在含585mgL—1MES，100mgL—1NaH2P04，lgL—1CaCl2.2H20，63.7gL—1mannitol，63.7gL_1sorbitol的溶液中，p朋.0，過濾滅菌)，置搖床中25""C、30rpm，酶解1216h。然后用孔徑為5080um的尼龍網將濾液過濾至無菌的離心管中，1000rpm離心5min。倒掉上清液，用0.6M的蔗糖8mL重新懸浮細胞，再緩慢加入清洗液W52mL，形成梯度液層，1200rpm離心10min。收集兩溶液界面間的原生質體于一個新的離心管中，用清洗液W5溶液洗滌2次，每次1000rpm離心5min。原生質體洗滌完畢后，可以用于原生質體融合。(3)原生質體融合采用PEG融合法，步驟如下用預融合液(0.15MSorbitol,0.03MCaCl2.2H20，0.075MKC1，0,05MTris-HC1，pH7，2，過濾滅菌)分別調整黑芥(v5ra5^'c諸.,)、花椰菜0307原生質體濃度至2X106個mL—'，按1:1的比例均勻混合供體、受體的原生質體。在直徑為6cm的無菌塑料培養皿中均勻分布7滴混合原生質體溶液，每滴40uL，靜止放置10min使原生質體沉積在培養皿底部，然后在每滴兩側加60iiL含40X聚乙二醇(PEG1450)的融合液(40XPEG1450，0.3MGlucose,50mMCaCl2.2H20，pH7.0,過濾滅菌)。靜止5min后，稍微傾斜培養皿去掉培養皿中的混合液，隨即小心加入2mLPEG清洗液I(13%的PEG1450,0.1MGlucose,0.067MSorbitol,0.067MCaCl2.2H20，pH7.0，過濾滅菌)，靜止5min后吸去。再小心加入2mLPEG清洗液II(6.7%的PEG1450，0.05MGlucose,0.083MSorbitol,0.083MCaCl2.2H20，pH7.0，過濾滅菌)，靜止5min后去掉。用原生質體培養基洗滌培養皿兩次，再加入2mL原生質體培養基，于24'C暗培養。2.雜種細胞培養及再生植株誘導培養3-7天后，當觀察到較多量的細胞進入一次分裂時，向每培養皿中加入400uL細胞培養基(B5基本培養基的大量元素、微量元素和有機成分，附加水解酪蛋白150mgL—'、葡萄糖2500mgL—'、2-脫氧-核糖125mgL—'、蔗糖20000mgL—'、2，4-二氯苯氧乙酸0.5mgL—'、萘乙酸0.2mgL-'和6-芐氨基嘌呤0,2mgL、pH5.8-6.0;過濾滅菌)，此后每3d加入1次該培養基，大約15天以后有細胞團出現時，轉移到愈傷組織培養基(B5基本培養基的大量元素、微量元素和有機成分，附加水解酪蛋白150mgL-'、蔗糖30000mgL-'、2，4-二氯苯氧乙酸0.5ragL—'、萘乙酸0.2mgL—'、6-節氨基嘌呤0.2mgL—'和瓊脂10000mgL—';pH5.8-6.0;高壓滅菌)中促使愈傷組織形成，同時轉為正常光照培養。當愈傷組織長到約5隱時，轉移愈傷組織到分化培養基(MS基本培養基的大量元素和微量元素，B5基本培養基的有機成分，附加水解酪蛋白150mg*L—'、蔗糖30000mg'lA萘乙酸0.2mgL—'、6-芐氨基嘌吟2.0mgLln瓊脂1000mgL-、pH5.8-6.0;高壓滅菌)中，誘導不定芽形成。當幼苗的真葉形成時，轉移到無激素的MS基本培養基中使再生植株正常生長并生根。上述培養過程的培養溫度均為24T:。由于葉肉原生質體具有綠色的葉綠體，而來源于暗培養的下胚軸原生質體為近白色，因此融合的細胞中有明顯的葉綠體及白色細胞質存在。此特征可以作為早期鑒別雜種細胞的標志。據此計算，本融合處理條件下，原生質體的異源融合率(顯微鏡視野下雜種細胞個數/視野里總的細胞數，5個視野取其平均值)為16%。培養4天后，觀察到細胞進入1一2次分裂，12天后看到大的細胞團，18天左右有星狀細胞團出現，此時轉入愈傷組織培養基。40-50天后愈傷組織約1-5mm大小，將它們轉入分化培養基上，誘導不定芽的形成。在幼苗的真葉形成后，及時轉到無激素的MS基本培養基中可獲得生長正常的植株。此技術條件下自原生質體獲得再生植株的頻率(再生植株數/培養原生質體數)為1.5X10—5。圖l示花椰菜0307下胚軸原生質體與黑芥(i&^sw'Cs/w>i^)葉肉原生質體的融合及培養，圖中，"一"示花椰菜0307下胚軸原生質體，"一"示黑芥(5rssw'c3;n'^a)葉肉原生質體，"》"示融合細胞分裂。圖2示融合后細胞培養形成的愈傷組織，左側圖片為愈傷組織早期照片，右側圖片為愈傷組織晚期照片。圖3示自愈傷組織上形成的再生植株，左側為形成的不定芽照片；右側形成的完整植株照片。三、花椰菜一黑芥雜種植株的鑒定1、分子標記鑒定首先對再生植株的雜種特性進行DNA水平鑒定。研究表明，SRAP分子標記由于是采用一對能反映植物基因組外顯子與內含子結構的引物序列進行擴增，它的擴增結果比RAPD分子標記結果具有更高的穩定性、可靠性，反映的信息量更豐富，多態性更強，因此本研究采用SRAP分子標記對花椰菜一黑芥雜種植株迸行鑒定。植物基因組DNA提取采用常規CTAB法。DNA濃度用分光光度計檢測后，稀釋到50ng叱—t備用。PCR反應體系為總反應體積為IO叱，其中IOX反應緩沖液1.0化，10mMdNTPs0.25PL，2.5UTag酶(購自TianGen公司)0.6|^L，模板DNA100ng，正向和反向引物各50ng，ddH203.4PL。擴增程序為94°C5min;94°Clmin，35°Clmin，72°Clroin，5個循環；94°Clmin，50°Clmin，72°Clmin，35個循環；72。C10min，4"C保存。PCR產物采用6V變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，^20)3銀染法染色顯影，在X膠片觀察燈上觀察分析條帶。本研究設計了多對SRAP擴增引物，篩選出5對引物，在黑芥(5rasw'ca/7^rs)與花椰菜0307基因組中表現出很好的擴增多態性，獲得了花椰菜0307及黑芥(萬i^sWca/^^^)各自基因組的特異擴增帶(表l)，可以有效地用于黑芥一花椰菜雜種植株的分子標記鑒定。它們的序列分別是第一對正向序列TGAGTCCAAACCGGAAT，反向序列GACTGCGTACGAATTAAC;第二對正向序列TGAGTCCAAACCGGAAG，反向序列GACTGCGTACGAATTAAC;第三對正向序列TGAGTCCAAACCGGTTG，反向序列GACTGCGTACGAATTAGC;第四對正向序列TGAGTCCAAACCGGTTG，反向序列GACTGCGTACGAATTAAC;第五對正向序列TGAGTCCAAACCGGAAT，反向序列GACTGCGTACGAATTAGC。采用在雙親中表現擴增差異的上述五對引物進行再生植株雜種特性的SRAP分析，能夠獲得準確的鑒定結果。如采用第四對引物組合對再生植株的DNA進行擴增，樣本17，19，2023，28和29號再生株都具有雙親的特征條帶，證實為雜種，而樣本18，25:，32，47和66號不具有黑芥("rasw'caw'gra)的特征條帶，只具有花椰菜0307的特征條帶，證明再生植株來自花椰菜0307下胚軸原生質體，而非來自異緣融合細胞，不是雜種(圖4)。由于SMP擴增條帶遠較RAPD中多，因此本試驗體系具有更高的雜種檢出效率。圖4中，C:花椰菜0307;N:黑芥(5r^w'ca/7^T3);17、19、2023、28、29號為雜種再生植株；18、25、32、47、66號為非雜種再生株(來自花椰菜0307原生質體)。+示意黑芥(5rasw'caw>ra)特征帶。表1五對SRAP引物在黑芥(^5ras幻'caw'^ra)與花椰菜0307基因組中的特異擴增帶<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>2、流式細胞儀進行基因組大小鑒定采用流式細胞儀可以對植物的基因組大小進行鑒定。由于體細胞雜種應具有雙親的基因組構成，因此對再生植株用流式細胞儀進行DNA含量測定，就可以初步判斷其來源。取再生植株和黑芥Brassicanigra)、花椰菜0307葉片各0.2g，分別加入2mL細胞裂解液(363mgTris，148.9mgNa2EDTA，20.2mgSpermine,1.193gKCl，233.8mgNaCl，200ulTritonX-100,以去離子水定容至200mL，pH7.5)，以鋒利刀片切碎組織，過濾、離心后用碘化丙碇(PI)染液(BDTACSCalibur)進行細胞核染色。30min后，以供體黑芥(Brassicanigra)和受體花椰菜0307為對照，采用流式細胞儀(BDFACSCalibur)進行再生株細胞基因組大小的測定。再生植株細胞的流式圖分析表明，黑芥(5rssWcsW^rs)細胞的DNA含量為0.98pg/細胞核，花椰菜0307細胞的DNA含量為1.19pg/細胞核，17，19，2023，28和29號再生株細胞的DNA含量為花椰菜0307與黑芥(^i^sw'ca/i^ra)細胞DNA含量之和(2.17pg/細胞，如圖5)，說明本原生質體融合再生系統中異源細胞的融合再生率是較高的。也印證了分子標記鑒定結果。圖5中，I、n分別為黑芥(&m^^細胞周期的G,和G2期；III、IV分別為花椰菜0307細胞周期的G,和G2期；V、VI分別為雜種細胞周期的G,和G2期。3、染色體計數取黑芥(^asw'cs/2^rs)、花椰菜0307，以及再生植株的根尖，飽和對二氯苯預處理2-3h后，卡諾(冰醋酸乙醇=1:3)固定4h，lMHC160。C解離5min，卡寶品紅染色后常規壓片顯微鏡檢。黑芥(A2^sw'MW>rs)和花椰菜0307的染色體數分別為2rp46和2n-18，顯微觀察顯示，17，19，2023，28和29號再生植株的染色體為34條，即為兩親本染色體之和(如圖6)。再一次從染色體數目上證實其雜種特性。圖6中，A，花椰菜0307，2n=18;B，黑芥(5r^&'ca力&ra)2n=16;C，雜種2『34。4、雜種與親本材料的形態學比較將經上述分子標記鑒定、基因組大小鑒定和染色體計數鑒定后的雜種再生植株移栽入溫室，在苗期及花期進行形態學比較鑒定。花椰菜0307的葉片呈橢圓形，藍綠色，葉緣鋸齒狀，無葉耳，葉面光滑無毛；黑芥(^SraSW'c3/7/^t3)葉片卵圓形，綠色，淺裂，有葉耳，葉面被毛。雜種植株植物學特征基本呈花椰菜0307與黑芥(萬msw'c3/n'^ra)中間形態類型，但不同單株在葉片形態、顏色、葉毛的有無等上呈現多樣性分布。有的植株有葉毛，有的無被毛，葉裂的程度也不盡相同(如圖7)。圖7中，最左側的是花椰菜0307葉片，最右側的為黑芥(^^s^ca/^ra)葉片，中間的兩個是雜種植株的葉片。5、黑腐病抗性鑒定保存在培養瓶中的雜種植株各切取莖段，接種在MS基本培養基附加0.lmg/L6-BA的培養基上，25'C，16h光照/8h黑暗培養，進行體外組織培養擴繁。45d后，將擴繁株分離，并轉接入MS基本培養基中生根，15天后株系17，19，20，28和29號各株系至少移栽出15株進入抗病鑒定溫室，待恢復正常生長后，采用人工接菌法進行雜種的黑腐病抗性鑒定，所接種的菌株仍為黑腐病菌生理小種1和4的混合菌株，黑腐病抗性鑒定方法同上述黑芥(^^sWcaw>ra)、花椰菜0307黑腐病抗性鑒定。同時對30株黑芥(5rasw'ca、30株花椰菜0307進行相同處理作為對照。所用受體花椰菜0307為一感病品種，因此來自黑芥(v5ra"ics7^gra)的抗病性能有效地在花椰菜一黑芥雜種中反應出來。由于所用花椰菜0307的黑腐病鑒定病情指數為31.77，黑芥(萬rassicaw>r<3)的黑腐病病情指數為1.11，而受試的幾個株系的花椰菜—黑芥雜種群體的病情指數均分布在2-8之間(表2)，因此實驗結果表明，受試花椰菜一黑芥雜種群體具有對黑腐病的高度抗性。表2中，PFCN17、19、20、28和29分別為代表17，19，20，28和29號花椰菜一黑芥雜種株系。皇2花椰菜一黑芥體細胞雜種的黑腐病抗性鑒定<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>圖8為黑芥(^rasw'csw'gra)、花椰菜0307及其體細胞雜種的形態學比較及黑腐病抗性照片。權利要求1、一種培育抗黑腐病甘藍類蔬菜的方法，包括以下步驟1)將對黑腐病具有抗性的黑芥(Brassicanigra)和甘藍類蔬菜進行細胞融合，獲得雜種細胞；2)離體培養所述雜種細胞，獲得再生植株，得到對黑腐病具有抗性的甘藍類蔬菜雜種。2、根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述甘藍類蔬菜為花椰菜。3、根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中，用于進行細胞融合的黑芥(^gr3sw'ca"fgTa)的供體是葉肉原生質體。4、根據權利要求2所述的方法，其特征在于用于進行細胞融合的所述花椰菜的受體是下胚軸原生質體。5、根據權利要求2所述的方法，其特征在于所述花椰菜為花椰菜((Avar.6ot/y"s)，在北京市農林科學院蔬菜研究中心的編號為0307。6、根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述細胞融合通過聚乙二醇介導；所述聚乙二醇優選為PEG-1450。7、根據權利要求l所述的方法，其特征在于所述步驟2)中，所述雜種細胞在原生質體培養基中培養到細胞進入1一2次分裂時，轉入愈傷組織培養基中進行愈傷組織的誘導培養，當培養至愈傷組織大小為卜5mm時，再轉入分化培養基中進行不定芽的誘導培養，培養至幼苗的真葉形成時，再轉入生根培養基進行生根培養，獲得再生植株。8、根據權利要求7所述的方法，其特征在于所述原生質體培養基為B5基本培養基的大量元素、微量元素和有機成分，并附加水解酪蛋白140-160ragL—'、二水合氯化f丐865-885mgL-\山梨糖醇45500mgL-\甘露醇45500mgL-'、葡萄糖2500mgL—'、2-脫氧-核糖115-135mg!/1、2，4-二氯苯氧乙酸0.4-0.6ragL/'、萘乙酸0.15-0.25mgf和6-節氨基嘌呤0.15-0.25mgL—i的液體培養基;所述愈傷組織培養基為B5基本培養基的大量元素、微量元素和有機成分，并附加水解酪蛋白140-160mgL—1、蔗糖25000-35000mgL-1、2，4-二氯苯氧乙酸0.4-0.6mgL-'、萘乙酸0.15-0.25mgL—'和6-芐氨基嘌呤O.15-0.25ragL—'的固體培養基;所述分化培養基為MS基本培養基的大量元素和微量元素，B5基本培養基的有機成分，并附加水解酪蛋白130-170mgL—'、蔗糖25000-35000mgL—'、萘乙酸0.15-0.25mgL—，6-芐氨基嘌呤2.0-3.0ragI/1的固體培養基；所述生根培養基為固體MS基本培養基。9、根據權利要求8所述的方法，其特征在于所述培養基的pH值均為5.8-6.0。10、根據權利要求1至9中任一所述的方法，其特征在于所述方法中還包括對所述再生植株進行靶標病害抗性鑒定、和/或分子標記鑒定、和/或基因組大小鑒定、和/或染色體數目鑒定、和/或形態鑒定的步驟。全文摘要本發明公開了一種培育抗黑腐病甘藍類蔬菜的方法。該方法包括以下步驟1)將對黑腐病具有抗性的黑芥(Brassicanigra)和甘藍類蔬菜進行細胞融合，獲得雜種細胞；2)離體培養所述雜種細胞，獲得再生植株，得到對黑腐病具有抗性的甘藍類蔬菜雜種。該方法利用細胞雜交技術，克服常規育種中的種間雜交障礙，將存在于十字花科野生材料黑芥中的抗病基因轉入甘藍類蔬菜基因組，培育得到抗病甘藍類蔬菜，如具有黑腐病抗性的花椰菜。文檔編號A01H4/00GK101126087SQ20071011853公開日2008年2月20日申請日期2007年7月9日優先權日2007年7月9日發明者紅嚴,凡劉,麗張,張月云,泓趙申請人:北京市農林科學院