專利名稱：鑒定花椰菜抗黑腐病的特異引物Ⅱ及鑒定方法
技術領域：
本發明涉及生物技術中的鑒定花椰菜抗黑腐病的引物Ii及其利用該引物序列鑒 定花椰菜抗黑腐病的方法。
背景技術：
黑腐病是由黃單胞桿菌屬細菌(Xanthomonascam pestrispv. cam pestris)引起， 不僅危害甘藍類蔬菜，且危害其他十字花科蔬菜。在世界多數地區，病害的發生常常是毀滅 性的。近年來由于人民生活水平的提高，花椰菜種植面積不斷擴大，而生態環境又適宜該病 的發生蔓延。因此，花椰菜黑腐病呈逐年加重趨勢，嚴重影響花椰菜的產量和品質，造成巨 大的經濟損失。該病菌主要危害花椰菜的葉片，有時也危害花球。幼苗受害時，子葉呈水浸狀并逐 漸變褐枯萎，或蔓延至真葉，使葉片的葉脈呈長短不等的小條斑。成株期發病，病菌多從葉 緣水孔和傷口處入侵，自葉緣開始向內形成“V”形黃褐色病斑，致病葉發黃，葉脈變黑，如病 菌侵入莖部維管束，可引起植株萎蔫。花球受害，一般從花梗開始，顏色變成灰黑色，最后小 花球呈灰黑色干腐狀，失去食用價值。花椰菜的抗病育種是提高產量和質量的有效途徑之一，抗病品種的選育已成為花 椰菜育種的長久目標，目前采用田間接種鑒定植株抗病性費時費力，而且易受環境等多種 因素的影響，準確度差。隨著分子生物學技術的發展，特別是DNA分子標記技術的發展可以 為這些研究提供準確、快捷的輔助手段。由于DNA分子標記不存在表達與否的問題，可以直 接以DNA的形式表現，在植物體的各個組織、各發育時期均可檢測到，不受取材部位、時間、 發育時期和環境的影響，信息量大，準確率高，為抗黑腐病品種的早期篩選、縮短抗病育種 年限帶來廣闊的應用前景。
發明內容
本發明的目的是克服現有篩選抗病品種技術的不足，提供一種快速、早期篩選花 椰菜抗黑腐病品種的引物序列，和利用該引物鑒定花椰菜抗黑腐病品種的鑒定方法。本發明的技術方案概述如下鑒定花椰菜抗黑腐病的引物II，它由引物序列II-S和引物序列II-A組成。一種使用特異引物II鑒定花椰菜抗黑腐病品種的方法，它包括如下步驟(1)花 椰菜基因組DNA提取。O)PCR擴增；在0. 2ml PCR專用薄壁離心管中加入PCR緩沖溶液 2. 5 μ lUOmmol/LdNTPO. 5μ 1、10 μ mol/L 引物序列 II-S 和引物序列 II-A 各 0. 5 μ 1、花椰 菜基因組DNA 50-100ng、Taq聚合酶2U、無菌水補至25 μ 1，將裝有上述溶液的PCR專用薄 壁離心管放入PCR擴增儀中，擴增條件為94°C預變性180秒，94°C變性45秒，56°C退火45 秒、72°C延伸60秒，擴增30個循環，最后在72°C延伸480秒，擴增完成。(3)PCR擴增產物 的瓊脂糖凝膠電泳檢測配置1. 2%的瓊脂糖凝膠，在凝膠中加入溴化乙錠(0. 5μ g/ml)； 在5μ1擴增產物中及標準陽性Marker分別加入Ιμ 6Χ上樣緩沖液，混勻，用移液器將上述混合液分別加入浸沒TBE電泳液的瓊脂糖凝膠的點樣孔中，120V恒電壓，電泳1800秒 后停止電泳。凝膠直接在紫外燈下(紫外波長或在凝膠成像儀上進行觀察。(4)依 照標準DNA marker帶在凝膠上的位置鑒定花椰菜是否抗黑腐病。
圖1是利用特異引物II和方法對已知抗、感黑腐病花椰菜檢測結果的電泳圖，1， 為標準分子量marker，2-10為抗病植株，特異條帶為400bp ； 11-20為感病植株的檢測結果， 無400bp條帶圖2是利用特異引物II和方法進行田間隨機檢測結果的電泳圖，顯示400bp條帶 的為抗病植株，未顯示條帶的為感病植株。
具體實施例方式下面結合實施例子和附圖對本發明做進一步的說明利用引物II，對花椰菜抗黑腐病和感黑腐病植株的檢測方法，具體步驟如下(1)采用CTAB方法提取花椰菜基因組DNA 取幼嫩花椰菜葉片200mg，在液氮里 研成粉末，移入IOml離心管中，加入^iICTAB裂解液，56°C保溫30分鐘，加入等體積的酚、 氯仿，充分混勻后，離心，取上清加入細1氯仿、異戊醇，混勻后離心，取上清加入等體積的 異丙醇，-20°C靜止2小時，IOOOOg離心20分鐘，去上清，沉淀用75 %的乙醇漂洗后風干， 加入50 μ L無菌水溶解DNA沉淀，取5 μ L電泳檢測DNA質量和計算DNA的含量；(2) PCR擴 增在0.2ml PCR專用薄壁離心管中加入PCR緩沖溶液2. 5μ l、10mmol/L dNTP 0. 5μ1、 ΙΟμπιοΙ/L引物序列II-S和引物序列II-A各0.5 μ 1、花椰菜基因組DNA 80ng、Taq聚合 酶2U、無菌水補至25μ 1，將裝有上述溶液的PCR專用薄壁離心管放入PCR擴增儀中，擴增 條件為94°C預變性180秒，94°C變性45秒，56 °C退火45秒，72°C延伸60秒，擴增30個循 環，最后72°C延伸480秒，擴增完成。(3)PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳檢測配置1. 2% 的瓊脂糖凝膠，在凝膠中加入溴化乙錠(0.5微克/毫升)；在5μ1擴增產物中及標準陽性 Marker中分別加入1 μ 1 6X上樣緩沖液，混勻，用移液器將上述混合液分別加入浸沒TBE 電泳液的瓊脂糖凝膠的點樣孔中，120V恒電壓，電泳1800秒后停止電泳。凝膠直接在紫外 燈下(紫外波長沈5歷)或在凝膠成像儀上進行觀察。(4)依照標準DNA marker帶在凝膠 上的位置鑒定花椰菜是否抗黑腐病。圖1為已知感抗黑腐病花椰菜植株的檢測，1為分子量 標準marker，箭頭示500bp ；2-10為抗黑腐病花椰菜植株，具有400bp的條帶，11-20為不抗 黑腐病的花椰菜植株；21為陽性對照，圖2為田間隨機采集的抗、感黑腐病的花椰菜植株， 與陽性對照相比，凡是具有400bp條帶的為花椰菜抗黑腐病植株。
權利要求
1.鑒定花椰菜抗黑腐病的特異引物II，其特征在于它由引物序列II-S 5，ATACAGGCACAGACACACTCGC3，和引物序列 II-A :5，TGTCCCTCCCTCAAAGCCATCT3，組成。
2.一種使用權利要求1的鑒定花椰菜抗黑腐病的方法，包括如下步驟(1)提取花椰菜 基因組DNA;(2)基因組DNA的0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測；(3)特異引物PCR擴增，在PCR 擴增專用離心管中加入PCR緩沖溶液、dNTP、引物序列II-S和引物序列II-A、花椰菜基因 組DNA、Taq聚合酶、無菌水補至25微升，將裝有上述液體的PCR專用薄壁離心管放入PCR 擴增儀中，擴增條件為94°C變性180秒，后進行94°C變性30秒，56°C退火45秒，72°C延伸 60秒的擴增循環，循環數為30，最后在72°C延伸480秒，擴增完成。G)PCR擴增產物的瓊 脂糖凝膠電泳檢測配置1. 2%的瓊脂糖凝膠，在凝膠中加入溴化乙錠(0. 5微克/毫升)； 在5微升擴增產物及標準陽性Marker中分別加入1微升6X上樣緩沖液，混勻，用移液器 將上述混合液分別加入浸沒TBE電泳液的瓊脂糖凝膠的點樣孔中，120V恒電壓，電泳1800 秒后停止電泳。凝膠直接在紫外燈下(紫外波長或在凝膠成像儀上進行觀察。(5) 結果判讀依照標準陽性Marker帶在凝膠上的遷移位置和PCR產物的遷移位置判斷花椰菜 抗、感黑腐病情況。
全文摘要
本發明公開了一對用于花椰菜抗黑腐病鑒定的特異引物II和鑒定方法，引物II由引物序列II-S5’ATACAGGCACAGACACACTCGC3’和引物序列II-A5’TGTCCCTCCCTCAAAGCCATCT 3’組成。使用上述引物II鑒定花椰菜抗黑腐病的方法包括4個步驟(1)花椰菜基因組DNA的提取及檢測；(2)特異引物對的PCR擴增；(3)PCR產物的凝膠電泳檢測；(4)結果判讀依據被檢測花椰菜基因組DNA的PCR擴增結果鑒定被檢花椰菜是否抗黑腐病。采用上述方法鑒定的結果與田間吻合率達95％以上。該方法在花椰菜抗黑腐病種質或植株篩選上具有重要的應用價值。
文檔編號C12Q1/68GK102108401SQ20101058119
公開日2011年6月29日 申請日期2010年12月9日 優先權日2010年12月9日
發明者孫德嶺, 宋文芹, 王春國, 郝擘, 陳成彬 申請人:南開大學