專利名稱：棗樹葉柄培養直接成芽方法及其新型培養基的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種利用謇樹葉柄培養直接成芽方法及其新型培養基，尤其適 用于棗樹的快繁及育種。
背景技術：
目前，公知的謇樹組培是以舉樹葉片或莖段、莖尖作為外植體進行快繁，
以葉片為外植體誘導出不定芽，這兩種方法除外植體不同外，均以公知的MS(多 數)或WPM(少數)為基本培養基，前者要經過初代培養、繼代培養形成不定芽, 后者要經過脫分化培養形成愈傷組織，再經愈傷組織分化培養誘導出不定芽。 顯見，由于對外植體和培養基選擇的不同、以及至少需兩步法培養，即先用一 種培養基脫分化培養誘導出愈傷組織，再更換另一種培養基經分化培養再誘導 出不定芽，前后至少需60 - 70天。即需更換培養基，分兩次培養，就造成了棗 樹組培對外植體選擇的局限性，以及謇樹葉片培養再生植株培養程序的繁瑣與 誘導率低的影響，從而限制了棗樹快繁育種的進展。
發明內容
為了克服背景技術的不足，本發明提供一種棗樹葉柄培養直接成芽方法及 其新型培養基，利用棗樹葉柄培養直接分化出不定芽繼而培養成完整植株。
本發明解決其技術問題所釆用的技術方案是以棗樹葉柄作為外植體，在 無菌條件下接種在新型培養基上，經培養由葉柄切口處直接分化出不定芽。
謇樹葉柄培養直接成芽方法，選擇棗樹組培苗由頂部向下的倒數第3-4片 帶葉片的葉柄作為外植體或者無組培苗時選擇健康棗樹上月內新萌發的棗頭上 的幼嫩葉柄，在無菌條件下接種在新型培養基上，置于培養架上進行培養，在
夜間溫度23°c±rc,白天溫度2rc±rc,相對濕度6o%-7o%,光照強度
1500 - 2000LX,光照時數12h/d的培養室條件下，經40天左右培養可直接分化 出不定芽。
用于謇樹葉柄培養直接成芽方法的新型培養基,組成含量為氯化鈣 (CaCl22H20 ) 300-400mg/L，硝酸氨(NH4N03 ) 1000-1400mg/L，硝酸鉀(KNO3) 1200-1600mg/L，磷酸二氫鉀(KH2P04 ) 155-185mg/L,硫酸鎂(MgS047H20) 250-300mg/L，硫酸亞鐵(FeS04'7H20) 25-29mg/L,已二胺四乙酸二納 (Na2EDTA ) 34-40mg/L，硼酸(,)9-12mg/L,硫酸錳 (MnS04H20 ) 17. 0-20. Omg/L，硫酸鋅(ZnS047H20) 9. 0-11. 0mg/L，鉬酸納 (Na2Mo04.2H20) 0. 20-0. 30mg/L，硫酸銅(CuS045H20) 0. 010-0. 030mg/L,鹽酸瘞 胺(維生素BO 0. 4-1. 2mg/L，鹽酸吡哆辛(維生素B6) 0. 2-0. 6mg/L，煙酸0. 2-0. 6, 肌醇60. 0-110mg/L,氨基已酸1.5-2. 2mg/L，蔗糖20-40g/L,瓊脂5.5-8. Og/L， 6-芐氨基嘌呤(6-BA )1. 0-2. Omg/L，噻苯隆(TDZ) 0. 005-0. 02mg/L, 3-吲哚丁 酸(IBA)O. 2-0. 5mg/L， pH5. 8-6. 5。
本發明的有益效果是，可以以棗樹葉柄為外植體，在新型培養基上能通過 一步法培養(即一次培養，不需更換培養基)直接誘導出謇樹不定芽，誘導率 達41.95% (95°/。置信區間為38. 21%-45. 69%)。本發明不僅擴大了謇樹組培的外 植體取材范圍，簡化了培養程序，而且為謇樹的快繁及育種提供了一條新的技 術途徑。與公知的培養基相比，新型培養基的總鹽濃度有所降低，尤其是大量 元素，而有機物濃度有所增加，這對于生長速度較慢的棗屬植物，避免了鹽濃
度過高引起的一些毒副作用，使其營養素含量更切近棗樹葉柄培養需要；另外，
增加了外源植物生長調節劑噻苯隆(TDZ)， TDZ是苯丙脲類衍生物，具有細胞分
裂素和生長素的作用，因而該新型培養基更適于謇樹葉柄培養。
圖l、 2為將木謇組培苗葉柄接種在新型培養基上，由葉柄愈傷處直接分化出
不定芽示意圖。
具體實施例方式
選擇冬樹組培苗的葉柄作為外植體，通過正交與隨機區組實驗，研制出一 種新型培養基，其組成為氯化鈣(GaCh'2H20 ) 330mg/L(以下單位同)，硝酸胺 (NH4N03 ) 1238，硝酸鉀(003)1425,磷酸二氫鉀(KH2P04) 170,硫酸鎂(MgS047H20) 278，硫酸亞鐵(FeSO/7H20) 27. 8，已二胺四乙酸二納(Na2EDTA ) 37. 3,硼酸(H3B03) 10.0,硫酸錳(MnS04'H20)19. 0,硫酸鋅(ZnS047H20) 10.0，鉬酸納(Na2Mo042H20) 0.25,硫酸銅(CuSOv5H20) 0.025,鹽酸噻胺(維生素BJ 1. 0,鹽酸吡哆辛(維生 素B》0.5,煙酸O. 5，肌醇100.0,氨基已酸2.0,蔗糖30000，瓊脂6000， 6-芐氨基嘌呤(6-BA )1. 8，噻苯隆(TDZ) 0.01, 3 -吲哚丁酸(IBA) 0. 3, pH6. 0。
培養基配制方法將所需化合物按性質和用量分類配成培養母液，其中，培養
基大量成分由硝酸胺(冊4冊3 )、硝酸鉀(003)、磷酸二氫鉀(KH2P04 )、硫酸鎂 (MgSO,7H20)組成，可配成20倍(20x)儲藏母液；培養基微量成分由硼酸(H3B03)、 硫酸錳(MnS04H20 )、硫酸鋅(ZnS047H20)、鉬酸納(Na2Mo042H20)、硫酸銅(CuS04 5H20) 組成，可配成400倍(40x)儲藏母液；培養基有機成分由鹽酸噻胺(維生素BJ、 鹽酸吡P多辛(維生素BJ 、煙酸、氨基已酸組成，可配成400倍(40x)儲藏母 液；培養基鐵鹽由硫酸亞鐵(FeS(V7H20)和已二胺四乙酸二納(Na2EDTA )組成， 可配成10倍(10x)儲藏母液；培養基鈣鹽由氯化鈣(GaCh'2H20)組成可單配成 40倍(40x)儲藏母液(雖為大量元素，但與其它大量元素混配在一起儲藏中易 發生沉淀)；培養基中肌醇可單配成200倍(200x)儲藏母液(雖為有機元素， 但與其它有機元素混配在一起儲藏中易發生污染)；培養基中6-BA、 IBA分別單 配成0. 2mg/ml儲藏母液；培養基中TDZ可單配成0. Olmg/ml儲藏母液。以上儲 藏母液均用無菌水配制，在4。C保藏。具體培養基配制(以配制1000mL培養基 為例)稱取6g瓊脂，加300 - 350ml蒸餾水煮溶，在加入30g蔗糖溶解，之后 依次加入以下儲藏母液培養基大量成分(20x) 50ml、培養基微量成分(400x ) 5ml、鐵鹽(10x) 10ml、鉤鹽(40x) 25ml、培養基有機成分(40Qx) 5ml、肌 醇(200x)10ml， 6-BA( 0. 2mg/ml )9ml、服(0. 2mg/ml )1. 5ml、TDZ(0. Olmg/ml) lml, 加蒸餾水定容至1000ml，攪勻，趁熱分裝，每培養瓶分裝培養液約2cm厚度。 分裝好的培養液于12rC下高壓滅菌20分鐘，取出后冷卻成半固體培養基即成 新型培養基。將外植體在無菌條件下接種在培養基上，經培養由葉柄切口處直 接分化出不定芽。
如圖1所示，選擇棗樹組培苗由頂部向下的倒數第3-4片帶葉片的葉柄作 為外植體或者無組培苗時也可選擇健康棗樹上月內新萌發的棗頭上的幼嫩葉 柄，按照陳宗禮等的方法(大棗組織培養中外植預處理的研究，《延安大學學報》 (自然科學版)，1994, 13 ( 1 ): 66 - 69.)消毒后作接種外植體，在無菌條件 下接種在新型培養基上，置于培養架上進行培養。在夜間溫度23。c士rc,白天 溫度27。C ±1"，相對濕度60% - 70%,光照強度1500 - 2000LX,光照時數12h/d 的培養室條件下，經40天左右誘導培養，由葉柄愈傷處直接分化出不定芽。圖 1中A為棗樹葉柄末端先愈傷化后，由愈傷處直接分化出不定芽；圖1中B為棗 樹葉柄末端先形成少量愈傷組織，由愈傷組織直接分化出叢生不定芽；
如圖2所示，將木棗組培苗葉柄接種在新型培養基上，在夜間溫度23。C土1 °C,白天溫度27。C士rC，相對濕度60%-70%,光照強度1500 - 2000LX，光 照時數12h/d的培養室條件下，經40天左右誘導培養，由葉柄處直接分化出不 定芽。圖2中A為麥樹葉柄末端直接分化出不定芽；圖2中B為賽樹葉柄末端 先形成少量愈傷組織，由愈傷組織直接分化出叢生不定芽。
實驗結果統計，共接種174塊葉柄，有73塊葉柄誘導出不定芽，誘導率 41.95% (95%置信區間為38.21%-45.69%)。以此為基礎，可進行快繁或育種(如 誘變或基因工程搡作)研究。
權利要求
1、棗樹葉柄培養直接成芽方法，其特征是以棗樹葉柄作為外植體，在無菌條件下接種在新型培養基上，經培養由葉柄切口處直接分化出不定芽。
2、 根據權利要求1所述的謇樹葉柄培養直接成芽方法，其特征是選擇棗 樹組培苗由頂部向下的倒數第3-4片帶葉片的葉柄作為外植體或者無組培苗時選擇健康棗樹上月內新萌發的棗頭上的幼嫩葉柄，在無菌條件下接種在新型培養基上，置于培養架上進行培養，在夜間溫度u。c土rc,白天溫度"。c土rc，相對濕度60%-70%,光照強度1500 - 2000LX,光照時數12h/d的培養室條件 下，經40天左右一步法培養可直接分化出不定芽。
3、 用于權利要求l所述的棗樹葉柄培養直接成芽方法的新型培養基，其特 征是培養基組成含量為氯化鈣(CaCl2'2H20 ) 300-400mg/L,硝酸氨 (NH4N03 ) 1000-1400mg/L，硝酸鉀(KN03) 1200-1600mg/L ，硫酸鎂(MgS047H20) 250-300mg/L ，轔酸二氫鉀(KH2P04 ) 155-185mg/L ,硫酸亞鐵(FeS04 7H20) 25-29mg/L,已二胺四乙酸二納(Na2EDTA ) 34-40mg/L，硼酸(113803) 9-12mg/L, 硫酸錳(MnS04 H20 ) 17. 0-20. Omg/L，硫酸鋅(ZnS047H20) 9. 0-11. Omg/L，鉬酸納 (Na2Mo042H20) 0. 20-0. 30mg/L,硫酸銅(CuS045H20) 0. 010-0. 030mg/L,鹽酸蓬 胺(維生素0. 4-1. 2mg/L，鹽酸吡哆辛(維生素B6) 0. 2-0. 6mg/L，煙酸0. 2-0. 6， 肌醇60. 0-110mg/L，氨基已酸1.5-2. 2mg/L,蔗糖20-40g/L,瓊脂5.5-8. Og/L， 6-芐氨基嘌呤(6-BA )1. 0-2. Omg/L，噻苯隆(TDZ) 0. 005-0. 02mg/L, 3-吲哚丁 酸(IBA) 0. 2-0. 5mg/L, pH5, 8-6. 5。
全文摘要
一種棗樹葉柄培養直接成芽方法及其新型培養基，它是選擇棗樹組培苗由頂部向下的倒數第3-4片帶葉片的葉柄作為外植體或者無組培苗時也可選擇健康棗樹上月內新萌發的棗頭上的幼嫩葉柄，在無菌條件下接種在新型培養基上，置于培養架上進行培養。在夜間溫度23℃±1℃，白天溫度27℃±1℃，相對濕度60％-70％，光照強度1500-2000LX，光照時數12h/d的培養室條件下，經40天左右培養可直接分化出不定芽。本發明以棗樹葉柄為材料，在新型培養基上通過一步法培養直接誘導出棗樹不定芽，誘導率可達40％左右。本發明不僅擴大了棗樹組培的外植體取材范圍，而且為棗樹的快繁及育種提供了一條新的技術途徑。
文檔編號A01H4/00GK101176432SQ20071018853
公開日2008年5月14日 申請日期2007年12月7日 優先權日2007年12月7日
發明者延志蓮, 張向前, 皓 薛, 陳宗禮, 齊向英 申請人:陜西省區域生物資源保育與利用工程技術研究中心