參與硝酸鹽吸收和代謝的植物基因的制作方法

專利名稱：參與硝酸鹽吸收和代謝的植物基因的制作方法
技術領域：
本發明涉及參與硝酸鹽吸收和代謝的植物基因。
背景技術：
氮在植物的包括代謝、資源分配、生長和發育在內的各 種功能中發揮著重要作用[Crawford, N.M., "Nitrate: Nutrient and Signal for Plant Growth (氮:植物生長的養分和信號)"CW/ 7: 859-868 (1995); Marschner, M.， Af/werar/ 7Vw^/".o" ///g/2er2<i W.(高等植物的礦物質營養，第二版)，Academic Press Ltd.: London (1995);和Stiit等，"The Molecular Physiological Basis for the Interaction Between Elevated Carbon Dioxide and Nutrients(升高的二氧 化碳和養分間相互作用的分子生理基礎),"戶/awf CW/ ￡>m'ra". 22:583-622 (1999)]。此外，氮是蛋白質和核酸的重要組分，也是植物中發現 的各種次級^i射物的重要纟且分[Marschner, M., Af/"era/ iVwW"o" o/ H^/zw P/a"&, ^/ (高等植物的礦物質營養，第二版)，Academic Press Ltd.: London (1995)]。因此，氮是植物最重要的無機營養物質之 一。無機氮以氮肥形式被添加到許多作物中[參見Frink等，"Nitrogen Fertilizer: Retrospect and Prospect (氮月巴回屈頁與展望)"iVaf/. 爿cad 5W. 96: 1175-1180 (1999)]。被添加到土壤中的氮主要是氨 (NH4+)和硝酸鹽(N(V)的形式。然而，對氮吸收效率的評估已表明， 所施用氮的百分之五十至百分之七十從植物-土壤系統中丟失[Peoples 等，"Minimizing Gaseous Losses of Nitrogen (4吏氮的氣態才員失最小4匕)"，載于簾rage" 決e五謂Vo,ew/1, Bacon， P.E.編輯,Marcel
Dekker, pp. 565-606 (1995)]。無機養分肥料的應用是高產作物生產者的主要開支之一 [參見Good等，"Can Less Yield More Is Reducing Nutrient Input Into the Environment Compatible with Maintaining Crop Production (可以才更 入更少產量更多嗎？減少向環境中的養分投入并兼顧維持作物生 產？ )，， 7Ve"cfe 尸/a"""'面e 9(12): 597-605 (2004)]。進一步，有報 告表明，以氮為基礎的肥料可能與環境破壞相關[參見Vitousek等， "Human Alternation of the Global Nitrogen Cycle: Causes and Consequences,(與人類有關的全球氮循環交替原因和后果)"五co/.
7:737-750 (1997)]。因此，減少施用于作物的無機氮量的一個重 要途徑是開發改善植物硝酸鹽利用效率("NUE")的方法。傳統的植物育種和標記輔助選擇是業已研究用于開發和 鑒別NUE提高的植物的技術[參見Good等，"Can Less Yield More Is Reducing Nutrient Input Into the Environment Compatible with Maintaining Crop Production (可以投入更少產量更多嗎？減少向環境 中的養分投入并兼顧維持作物生產？ )" 7>e"A & &/e"ce 9(12):
597-605 (2004)]。然而，這些方法往往是費時和勞動力密集的。另一 種做法是使用基因工程技術，開發已提高NUE的轉基因作物。這種 方法要求鑒別提高NUE的基因。已有關于在擬南芥(」ra6^ 戸/力中 鑒別受氮水平調節基因的報道[Scheible等，"Genome-Wide Reprogramming of Primary and Secondary Metabolism, Protein Synthesis, Cellular Growth Processes, and the Regulatory Infrastructure of ^ra6Wopw's in Response to Nitrogen (應答氮的擬南芥初級和次級^ 謝、蛋白質合成、細胞生長過程和調節基礎的基因組范圍重新編程)", 尸/朋f P/^/o/. 136: 2483-2499(2004)]。然而，有必要鑒別在重要經濟 作物如玉米中參與硝酸鹽吸收和代謝的基因。本發明涉及克服本領域的這些問題和其他方面的缺 。發明概述本發明涉及來自玉米的受氮調節(例如被氮上調)的核酸分 子。本發明還涉及由所述核酸分子編碼的分離蛋白質或多肽。本發 明還進一步涉及本發明所述核酸分子的啟動子。本發明進一步涉及核酸構建體，其具有本發明的核酸分 子[即玉米受氮調節(如上調)的核酸分子]。該構建體還包括5， DNA 啟動子序列和3'終止子序列。所述核酸分子、DNA啟動子序列和終 止子序列纟喿作性地(operatively)連4妄以允許該核酸分子轉錄。本發明還涉及具有核酸構建體的表達體系、宿主細胞、 植物細胞、植物和植物種子，該核酸構建體包含玉米受氮調節的核 酸分子。本發明的另 一方面是在植物中表達受氮調節的核酸分子 的方法。這種方法涉及提供用核酸構建體轉化的轉基因植物或轉 基因植物種子，所述核酸構建體具有玉米受氮調節的核酸分子、5， DNA啟動子序列和3，終止子序列。該方法涉及在所述轉基因植物 或由所述轉基因植物種子生長的植物中能有效表達所述核酸分子的 條件下，培育該轉基因植物或由該轉基因植物種子生長的轉基因植物。本發明的另一方面涉及來自玉米的分離DNA啟動子，所 述啟動子適用于誘導由與該DNA啟動子操作性(operably)連接的分離 DNA分子所編碼蛋白質的受氮調節表達。本發明進一步涉及包含所 述分離DNA啟動子的核酸構建體以及含有該核酸構建體的表達載 體、宿主細胞、植物和植物種子。本發明還涉及指導分離核酸在植 物中受氮調節表達的方法。這種方法包括用本段落所述的核酸構建 體轉化植物細胞，并從所述轉化植物細胞再生植抹。通過這種方 法，所述核酸分子在所述DNA啟動子控制下的表達在所述植物中發 生，并受氮的上調。硝酸鹽利用效率(nitrate use efficiency)對集約玉米生產的
9種植者獲利能力和生態可持續性兩者都有影響。本發明有效地提供
通過增強作物(如玉米)的氮吸收而改善NUE的手段。特別是，本發 明的核酸構建體可用于利用分子標記輔助選擇和/或轉基因方法來開 發玉米種質。因此，本發明在提高作物的硝酸鹽吸收和利用效率方 面是有用的，從而可減少使用硝酸鹽補充劑。本發明的核酸構建體 包括與玉米作物基因對應的核酸分子，因而對玉米的硝酸鹽代謝有 著最直接的影響。因此，與來自非作物植物(如擬南芥)的基因相比， 這些基因可能對玉米改良有著更直接的相關性。
發明詳述本發明涉及來自玉米(例如來自B73幼苗)的核酸分子(如 基因)，其受氮(如以硝酸鹽、硝酸鈣等形式)的調節(例如上調)。這些 基因及其啟動子是用于玉米改良的天然耙標。利用分子標記輔助選 擇和/或轉基因的方法，這些基因可被用來改良玉米種質。本發明提 供這些基因的全長cDNA克隆的核苷酸序列。本發明還提供這些基 因編碼的分離蛋白質或多肽的氨基酸序列，以及它們的推定啟動子 (基因轉錄起始位點的上游)。本發明的適用核酸分子是受氮上調的基因，包含于具有 如下所示SEQ ID NO:l核苦酸序列的全長cDNA克隆中
GACGACGCCCCCGTCGCCGATA:i'GGGCGACCTCTCTGTCGGCCACAGC
CGCCGCTGGTGCGGCCGTTTCGCGGCCGTCCTTTGCCTGTGCGCGGC
CTTCTGCAAGCCAGATGAACTCCCGATGGATCCACTGCCGAACTTGC
CGCCGACGAGGTCGCTGCAGTGCTTCGAGGACGAACAGGTGTACAGC
TGCTGCGAGGGCGCGTACAGGCTAAACCCATCGGGAATCATCGCCGT
TCCCGTCGGCGCGGTGGACTACTACTGCGGCGGCGCGTGCGTGGTGG
AGACGGAGGACGTGCTCAACTGCGTGGCCAGCGCCCTGGACGGCTTC
GCCTTCTACAACGGGGCCTCCGTGGAGGACGTGCGCTACGCACTCAG
GCGGGGCTGCAGCCACACCGCCAGAAGAGGCGACTTCAACGATTTGG
AGCCGCATCTGGGCGACTACCCTGACATCTATGGCGACGATGATGAG
CACAGCTTTGGCAGCAAGGTTGTTGCAGCTCCTCTGAGGTTGCTCGC
GTTTCTTGGCGGTGCGGGGCTGTTCTTCCTGGGCCCTTGA
10(下劃線二GeneRacer寡核苷酸序列；粗體/下劃線=起始密碼子；粗體 為編碼序列)(5' RACE產物CW13E07-Fu11—Length的序列，其克隆入 pCR4-T0P0中)(源自MEST13-E07, GB—ACC# BG840928)由SEQ ID NO:l全長cDNA克隆編碼的預測蛋白質或多 肽具有如下所示的SEQ ID NO:2氨基酸序列
MGDLSVGHSRRWCGRFAAVLCLCAAFCKPDELPMDPLPNLPPTRSLQCFEDE
AFYNGASVEDVRYALRRGCSHTARRGDFNDLEPHLGDYPDIYGDDDEHSFGS KWAAPLRLLAFLGGAGLFFLGP SEQ ID NO:l全長cDNA克隆的基因的推定啟動子(基因 轉錄起始位點的上游)具有如下所示的SEQIDNO:3核苷S臾序列ctttgccgagtgtttcagacactcggcaaagaacctgattccgatagtgaaggtcttacaccccgatcc
ctcactccgttc
aacatgcatgcatttgaa a_ca_gct
csggccsggccssctccggcgad
atgcctccgatcccaaccttcgtgtttcccaccaaacacacgcgtacagaggccaagcacacgcacaaa agcaagcctcgatcgtagcccgtgcctaaccctgccgatgccgtaataaacttgtgtgctccacgcaac
gaactctctcctataataatcctagctagcacacttgcccagattatattgcctgctccgacgaccttg
tgctcgtcaggtacgctcgtaaaaagaaaagaaaaaaaaagaagagatcgagatcgatctgttgacgac gcccccgtcgccgatatgggcgacctctctgtcggccacagccgccgctggtgcggccgtttcgcggcc gtcctttgcctgtgcgcggccttctgcaagccaggtgcgtgctcaccgtcaacacacgcaccattattc
jatatatagttacgtct
jcagtgcttcgaggacgaacag gtaagctaacaagcaagsgcgtgtttggtttcatgctaggacagagttgcataccacgtagctatcata
■gsgaggcgagctctttttgacsagcctcgdcgdsccssstadgccssgtcctactgtacgdgggcgatc gaggcgccgaggcctgtgtgatgtgatgccgtgtgtcgtggtcacccaccagctgctgtgtacattggt
cgtacaggctaaacccatcgggaatcatcgccgttcccgtcggcgcggtggactactactgcggcggcg cgtgcgtggtggagscggaggacgtgctcaactgcgtggccagcgccctggacggcttcgccttctacacagctaaaaccgtttttatttttagtttttttataacagaaaaaatatctctggaaacgaaaacggcaa cacagtagttcaaaaatatcgaagacaataatttaacatgaaaaatatatatgtaatgatcggaatcta
catacattaaagggttgtgctt
二3C
ictgaagtgacaatt jsgatcca_tta_cttcttttcta_a_ca_
tatttatatggttggacaatatatagatatacctaccttatgatctttttctgatttgagctcctgcta tcttagtaaaaccttatgataacgcttctaatgcaaccaaaactaagttgttcctctatggcttttagc actacctttgtaagtcctatttttgtagctcagaaactttcatttggcccaaatttgctccagagattt
tscttt3tggggtgctca±ca_a_ca_tta_ga_ttcsct
(>MAGI4—8075 MAGI4,contigs—w—singleton.fas 4037 bp)本發明的適用核酸分子是受氮上調的基因，包含于具有 如下所示SEQ ID NO:4核苷酸序列的全長cDNA克隆中
tccatccatcqil^gcatgcgtcagcaccttccagagctgccccattg
ccagaagagcHIgatcaacaccaggtccaggggcagcagcagtagc
gtggcgaaggggtcaccaccaccagccttccagttccagtgcagggc
gtcgactttcgcggcggacaccagcctccggctcgagctggacgaga
accccgaggcgatcatctcgggggcgtggcccgggaactgctccctc
ctcagctacgacgacctccgcgcctacctcgagtcgcaggagacggc
ggcccaggcagacgatcagcgcggcgtggcgctcctgagcgagacc
atgtccacacccgtgctggtggccacagcagaccagaccctggagga
cgtcgagtgccacttcgaggccgtgtcggggcttccggtcgtcgaca
gcggcctcagatgcgtcggggtgatcgtcaagaacgaccgggcaagaGCCTCTCATGGGTCCAAGACGAAGATATCGGAAGTGATGACATCTCC AGCTATCACACTATCGTCTGACAAAACCGTGATGGATGCTGCTGTTCT CATGCTCAAGAAGAAGATCCACAGATTACCAGTTGTAAACCAGGACG AAAAAGTAATAGGTATAGTTACCCGCGCTGATGTTCTTCGCGTGTTGG
ACGCCAGGAGACTCCATCCCAGG
(下劃線-GeneRacer寡核苷酸序列；粗體/下劃線=起始密碼子；粗體 為編碼序列)(5' RACE產物CW13A08-Ful1—Length的序列，其克隆入 pCR4-TOPO)(源自MEST13-A08, GB—ACC# BG840889)由SEQ ID NO:4全長cDNA克隆編碼的預測蛋白質或多 肽具有如下所示的SEQ ID NO:5氨基酸序列
MACVSTFQSCPIARRAKINTRSRGSSSSVAKGSPPPAFQFQCRASTFAADTSLR LELDENPEAIISGAWPGNCSLLSYDDLRAYLESQETAAQADDQRGVALLSET
KTKISEVMTSPAI丁LSSDKTVMDAAVLMLKKKIHRLPVVNQDEKVIGIVTRAD VLRVLEGMLKI SEQ ID NO:4全長cDNA克隆的基因的推定啟動子(基因 轉錄起始位點的上游)具有如下所示的SEQ ID NO:6核苷酸序列
caacgtggagtaggcaagcgttggtcttggccgasccacgggatsasccsctgtgtcaactctgtgstt gatctcttgtggtattgtgttttgttgagactcttttctagccacttggcatttagtgtgctaacactt
gcatgcaattaacggtggtgtttttggcctgtcttgcagcagcgggtgcagcattggcttggcataagc acgcaeLCcssscssLagactaccttttggtcaatgcatgcgssgaatctgtacgsgcgggcgtsgacaac
actaattttttaagtatcctaacttattgtgaagaaacgtaaatatttagatcccgatccattaccacc
gacttctgcttgtttgttcagtctctcsggcagggttacsggaggceLstacaagstgttctccaacgat
tcgccgtstagagcagtgt
14ttcctgtttagattacaaatggctaaaagtagctaaaaaaagctgctaaagtttatctcgcaagattgg
ttattaatagaaagtaaccttcttgggtgcggcccatacggtcctgagcgcactaaatgaggcctcatt
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aaaaaaaaggtgaaca_aagacgccaccttatcca_ctgccacgtgacagggggccaggggaa_tctcggcg
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二cttcgcgtgttggaaggcatgt tgaagatttaggagcgcagatacccstgctcggaagccacagcctcttgtaaatatgtagatgtgcccg ggcatggtgtttctgagtagcagcaaagagatctaccatgtataggagttctcc
(>MAGI4—31359 MAGI4.contigs—w—singleton.fas 3987 bp)本發明的適用核酸分子是受氮上調的基因，包含于具有如下所示SEQ ID NO:7核苷S臾序列的全長cDNA克隆中:
CAGAGGCGTGCCGGTGAAGCGCGAGAGCGGTGAGGC4XgGCGATGCAG
ACGGGGGTCGCGACCTCCAAGGTCCTCATCCTCGf55^TGCAGGGAT
GACGGGCTCGATCCTGCTGCGGAATGGCCGCTTATCTGATGTGTTGG
GAGAACTCCAGGAGATTATGAAGGGTGTAAATCAAGGAACTTCTTCG
GGTCCCTATGACATTGCACTTATTCAAGCTCAGATTCGGAATTTAGCG
CAAGAAGTCAGAGATTTGACATTGTCAAAGCCCATTACCATACTGAAT
GGCAAATCTGACTCGGGAGGCAGTTTATCATCCTACATACTGCCAGC
AGCAGCAGTTGGAGCAATGGGTTATTGCTACATGTGGTGGAAGGGGT
TGTCTCTCTCAGATGTCATGTTTGTCACAAAACACAACATGGCAAATG
CTGTTCAGAGCATGTCAAAGCAGTTGGAGCAAGTTTCATCAGCACTA
GCTGCAACAAAAAGACATCTAACTCAACGGCTTGAGAATTTGGATGG
CAAAATGGATGAACAAGTAGAGGTCTCCAAAGCTATTAGAAATGAGG
TCAATGATGTTAAAGATGACCTGTCTCAAATTGGATTTGATGTCGAAT
CAATTCAGAAAATGGTTGCTGGATTGGAGGGAAAGATCGAGTTACTT
GAGAACAAACAGGACGTGGCTAATACTGGTATCTGGTATCTCTGCCA
AGTAGCAGGCGGTTTAAAAGATGGAATAAACACCAGGTTTTTCCAGG
AAACCAGTGAGAAGCTGAAGCTCTCACATTCAGCTCAACCTGAAAAC
AAGCCAGTGAAGGGGCTTGAATTTTTTTCGGAAAGCACCATGGAACA
GAAAGTAGCTGACTCCAAACCAATTGCGGTGACAGTCGACGCTGAGA
AGCCTGAGAAAACCGCTGCTGTAATGGGCACCACAGTGCACAGGTCT
ATCAGGTTCTCATATCGGAAGGCAGGCCTTGCTTTGTGATCAAATCCT
CTCCGCTTGAGATGCACGTGGCCTTCCTGGTTG
(下劃線^GeneRacer寡核苷酸序列；粗體/下劃線=起始密碼子；粗體 為編碼序列)(5， RACE產物CW15E10-Fu11—Length的序列，其克隆入 pCR4-TOPO)(源自MEST15-E10， GB—ACC# BG841093)由SEQ ID NO:7全長cDNA克隆編碼的預測蛋白質或多 肽具有如下所示的SEQ IDNO:8氨基S吏序列
MAMQTGVATSKVLILVGAGMTGSILLRNGRLSDVLGELQEIMKGVNQGTSS
GPYDIALIQAQIRNLAQEVRDLTLSKPITILNGKSDSGGSLSSYILPAAAVGAM
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AGLAL SEQ ID NO:7全長cDNA克隆的基因的推定啟動子(基因 轉錄起始位點的上游)具有如下所示的SEQIDNO:9核苷酸序列gcacgaacatccatagaagaactatctgaaLCtgaagctaaagatttgcatgaaatggtaatttgtacac
agcttgaataagtgcaatgtcatagggacccgaagaagttccttgatttacacccttcataatctccta gaaacacaaaaggtacatcattgccttaaataaacatttactaggaagtttcaLgagcataccatcaa^a
acaggaaggggaaagctcccgagcaaccgagcgagaagggtgcctggacccgggaccgggacctgagaa
cgctgtggggga_cgcgggtgttgtcgtggccgcctcgttggccagcgcgaacctcaccatgga_gtggaa
ctattaagtatagactga cactctatttttctcg
agaacagcactacatctatctagctaacaggtagacctgggataggggcagtaagcaaggacagcttct
aaacgcagcccagcagcatatgatttaaggtttcctgatcctgatcacataatggacatctctccggat gatccatacctcttctttgcaacctatcagctgtccacaccttcttgtgagcgsccaaccscatgaasa
iaatgcttgtctt
(>MAGI4—20155 MAGI4.contigs—w—singleton.fas 3385 bp)本發明的適用核酸分子是受氮上調的基因，包含于具有 如下所示SEQ IDNO:IO核苷酸序列的全長cDNA克隆中GQi:[^GACCGGAACCTGAGCGGGTTTCTGATCGGGTGCCTGGGCGCC GCCGTGACGCTGCTGGCGTACCAGCAGACGGTGGTGACCAGCACGCA GAGCGTCGCGGCGGGCTTCGTCGTCATCCTCTTCGCCCTCTTCGTCA AGGAAGGATTCATTTCCCTCTGAATCTCTGGTGCGCGTCAGCCAGCCAT
GTCCCGCAGCTGCCGCTGTGCTCGTCAGGTTC
(下劃線-GeneRacer寡核苷酸序列；粗體/下劃線=起始密碼子；粗體 為編碼序列)(5' RACE產物CW28B08-Full—Length的序列，其克隆入 pCR4-T0P0)(源自MEST28-B08， GB—ACC# BG842208)由SEQIDNO:10全長cDNA克隆編碼的預測蛋白質或多 肽具有如下所示的SEQ IDNO:ll氨基酸序列 SEQ ID NO:IO全長cDNA克隆的基因的推定啟動子(基因 轉錄起始位點的上游)具有如下所示的SEQ ID NO:12核苷酸序列
ccaaatccttcgtttcgtcgtctccacacgcaatagcatccgagcaaagaagccaaagagcaactggga
gggcgccgccgtgacgctgctggcgtacca_gcagacggtggtgaccagcacgcaga_gcgtcgcggcggg
二ctg3atctctggtgcgcg
gaacagcaga_ctgcagatcagcaga_gttcttgccttcttacgctaattaataattattggtacacgaat cctgattgtgttgagccttct gtatgtttgctttgtatat aactaataaaattggcatgaattcaccccaaaaagattgatgctgtttctcactagttttcagcctcag a_cgactatagatgtccaaa_caq
jctccgacctgcttggact
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(>MAGI4—8905 MAGI4,contigs—w—singleton.fas 1736 bp)本發明的適用核酸分子是受氮上調的基因，包含于具有
18如下所示SEQ ID NO:13核苷酸序列的全長cDNA克隆中
CTCCCTCTCTGTGGTGGAGTTTTACTTCCTGCACAGATTCCCCCTGCC
TTTTGCTGGCTACCTCATCTTCATTTCCATATTGGCTGGATTCTGGGG
CCAGTGTTTGGTTAGGAAGATCGTGCATGTGCTCAAGAGAGCATCGC
TTATTGTCTTCATCCTCTCCTCTGTTATCTTCGTCAGTGCTCTTACGAT
GGGTGTCGTTGGAACCCAGAAGAGCATTTCGATGATCAACAATCACG
AATATATGGGGTTCCTCAACTTCTGCGAGTAACTCAAACACCATCAGAC
(下劃線-GeneRacer寡核芬酸序列；粗體/下劃線=起始密碼子；粗體 為編碼序列)(5' RACE產物CW31A10-Fu11—Length的序列，其克隆入 pCR4-TOPO)(源自MEST31-A10, GB—ACC# BG842452)由SEQ ID NO:13全長cDNA克隆編碼的預測蛋白質或多 肽具有如下所示的SEQIDNO:14氨基酸序列
FILSSVIFVSALTMGVVGTQKSISM麵HEYMGFLN CE SEQ ID NO:13全長cDNA克隆的基因的推定啟動子(基因 轉錄起始位點的上游)具有如下所示的SEQIDNO:15核苷酸序列
acatctgatacacacagagcattacggtgacccatgttccatatcttaaggtaacgaaggtttgtccta
二atttagtcaatgtttatgaatattt gagggagtgagtaggtatcaattgcacccaggtaatgatcattttcaacggtcaaattactaaaa^tag
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cagcatcttcactcaaagagacagattaaagctgtttggactgctttagctataataaaaatactgtag adaaaacagaagtcggtggaagccgcagcgaacatgttctgattttcacggaaatacggcttgaaacgc
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ACT
19aaaactaaagccgtatggtcagctcgttagccaggagctascacgagctgaattcactacagcgactct
gattgatttagacgaaacaagtaaaagagctaatataatgctacatccgttctcgaatatttgtcgtcc
(>MAGI4—154269 MAGI4.contigs—w—singleton.fas 2189 bp)本發明的適用核酸分子是受氮上調的基因，包含于具有 如下所示SEQ ID NO:16核香酸序列的全長cDNA克隆中
AGCGAGGCTGGCGTTTGTGCTTGCACTGGCCATAGCCGCCTCGTCAA
TTGAGGTTGCGGAGAGCAGAGATTTTAATATCTTTGCTCAGGGCAGC
TTGCCTGATGCAACCAAGGGATCGTCTGGTCTAGCTGCAACCAGTGG
AAAGTTGTGTCAGTTATGCGAGCAGTACTCATCCGAGGCGCTCCTCTA
TCTCACACAAAACGAGACCCAGACTGAGATTCTTAGCATTCTACACCA
TGAATGTGCCAGCCTTGCCCCTCTCAAACAGCAGTGCATCACGCTGG
TTGACTACTACGTACCCCTTTTCTTCTTGGAGGTCTCCATGGTTACCC
CTGAGAAGTTCTGCGAGTCGATGCATCTCTGCAAGAAGGGGATGAAG
ATTAGCCTACCCACCCGGGAGGGTACTTGTGGTTTGTGCCACCATGTT
GTTGTTGAAATTCTTATCATGCTTAAAGACCCCAACATGCAGCTGGAA
GTAATCGACCTACTCACCAAAACATGCAGCAAGGCGCAGAACTATGA
GTTGTGAAGGTGATGCGA
(下劃線二GeneRacer寡核苷酸序列；粗體/下劃線=起始密碼子；粗體 為編碼序列)(5' RACE產物CW42B 12-Full—Length的序列，其克隆入 pCR4-TOPO)(源自MEST42-B12, GB—ACC# BG873755)由SEQIDNO:16全長cDNA克隆編碼的預測蛋白質或多 肽具有如下所示的SEQIDNO:17氨基酸序列levsmvtpekfcesmhlckkgmkislptregtcglchhvweilimlkdpnm qlevidlltktcskaqnyeq SEQ ID NO:16全長cDNA克隆的基因的推定啟動子(基因 轉錄起始位點的上游)具有如下所示的SEQ ID NO:18核香酸序列
ttacctgcatgttggggtctttaagcatgataagaatttcaacaacaacatggtggcacaasccacaag
ccctgagctgaattgaag
iaaatctctgct
catcgtacctgcttaccactaccagttggtcagttgacagga_a>ca_aaactactgcttgaagaaaactat
cagtagaagtttcagattcattcagcccgacgtaactgaagaattcagttcgcttcaagatgtagccat
tgcaLgcagattagcaaagcattttacgctcgcttttgcgctttattttgcccctcgtttcctttccagg aagaaccgaggggagacggtagtacagagagcccaggagaagctaacatatgaatggggaattaaagac tgcatcttggactcttccgggagcactttgttttcttaaagcttcgtgttacattaagaagatgcatga dtgtgtta_gsdsggcstsstcttttcttd
(>MAGI4— 114997 MAGI4,函tigs—w—singleton,fas 1961 bp)本發明的適用核酸分子是受氮上調的基因，包含于具有 如下所示SEQ ID NO:19核香s臾序列的全長cDNA克隆中
tccatccatccctgcagca綠ggcgtctgcagtgaccagcagcgacaa
ggagcaggccgtcccta56I^cgacgctgacgaagcgcacgcgctgc
tgagctccggccatggctacgtggatgtcaggatgcggggggacttc
cacaaggcgcatgcgcccggtgctcggaacgttccctactacctgtc
cgtcacgccgcaagggaaggagaagaacccacactttgtagaggaagTGGCTGCCTTCTGTGGGAAGGATGATGTCTTCATTGTGGGTTGCAAC
ACGGGGAACAGATCCAGGTTCGCGACGGCAGACCTTCTGAACGCGGG
GTTCAAGAACGTGAGGAACCTGCAAGGTGGTTACCGCTCCTTTCAGC
GCTGCAGTTGAACG
(下劃線K5eneRacer寡核苷酸序列；粗體/下劃線=起始密碼子；粗體 為編碼序列)(5' RACE產物CW43D12-Fu11—Length的序列，其克隆入 pCR4隱TOPO)(源自MEST43-D12， GB—ACC# BG873856)由SEQIDNO:19全長cDNA克隆編碼的預測蛋白質或多 肽具有如下所示的SEQ ID NO:20氨基酸序列
MASAVTSSDKEQAVPTIDADEAHALLSSGHGYVDV脂RGDFHKAHAPGARN
GFKNVRNLQGGYRSFQQRAQQQ SEQ ID NO:19全長cDNA克隆的基因的推定啟動子(基因 轉錄起始位點的上游)具有如下所示的SEQ IDNO:21核苷酸序列
二atggtgctagcttg
cgtaagca_aa_tcaagaagatggaggtatctcagcattcca_agtacttttgcga_gttctgtggga_aggta
二atgtccatcaatgtgtttctaagata C3tttgaagscagacagcatttgttccgastccaacctttgctgtgctgtgtttccagtttgctgtgaa gaggaaagcagttggaatttgggggtgcaaggactgtgggaaggtgaaggctggtggtgcttacaccat
ttgcagcact
atdtagctctttatattattggggtttcctgtagttgctcttgtcaggcatgttgtgggggccttatct
taggatctcaiaa_gttgt<gtt3agatttgcccttggttsccgttctgaatctg￡Lcaa_gtgat3tttcatc
ctgttcttgaaattctacagatactgctgcgtctctgctggttgagtctggtttagatagcaaccagtc cttattattggtctttcaagttcaagtcaactaaaatgcgacaaataaaaaaaagaatggagggagtat
tctgagtgcatctgatgttgcttacagtaacattacatgcatagagcagaagatcggatgcatctggat
cctgtccgtcacgccgcaaggtcagtttcttgctcgctggcgttggcgctggcactggcattggggtta ttgatttgagctgcctctgtccccgtgtagggaaggagaagaacccacactttgtagaggaagtggctg ccttctgtgggaaggatgatgtcttcattgtggtagctattcactcatataaataaataaataaatgta
acagatccaggttcgcgacggcagaccttctgaacgcggtaaacacagcccatccgagctttagcatca dtccsgttsgctgtst(〉MAGI4一143540 MAGI4.contigs一w一singleton,fas 2277 bp)本發明的適用核酸分子是受氮上調的基因，包含于具有 如下所示SEQ ID NO:22核苷酸序列的全長cDNA克隆中
AACCACCTGAAGCCATGTGCATTGCTGCATGGATTTGGCAGGCTCACCC
TGTGCACCAACTCCTCCTGCTTCTCAACAGAGATGAGTTCCACAGCAG
GCCTACAAAAGCAGTAGGATGGTGGGGTGAAGGCTCAAAGAAGATCCT
TGGTGGCAGGGATGTGCTTGGTGGAGGAACATGGATGGGGTGCACCA
AGGATGGAAGGCTTGCCTTCCTGACCAATGTGCTTGAACCAGATGCCA
TGCCCGGTGCACGGACTAGGGGAGATCTGCCTCTCAAATTCCTGCAGA
GCAACAAGAGCCCACTCGAAGTTGCAACTGAAGTGGCAGAAGAAGCTG
ATGAATACAATGGCTTCAACCTCATACTAGCTGATCTAACAACAAATAT
CATGGTTTATGTGTCAAACCGGCCTAAGGGTCAGCCTGCAACAATTCA
ACTCGTGTCACCAGGACTCCATGTGCTGTCCAATGCAAGGCTAGATAG
CCCTTGGCAGAAGGCAATTCTCCTCGGTAAAAACTTCAGGGAGCTTCT
TAGGGAGCATGGTGCTGATGAGGTTGAAGTGAAGGATATAGTTGAGAG
GCTAATGACTGACACCACAAAGGCTGACAAAGATAGACTGCCAAACAC
TGGTTGTGATCCCAACTGGGAGCATGGTCTGAGCTCCATCTTCATTGA
GGTGCAAACTGACCAAGGGCCCTATGGGACACGGAGCACAGCCGTTTT
ATCAGTGAACTATGATGGCGAAGCTAGCTTGTACGAGAAGTATCTTGA
GAGTGGTATATGGAAGGATCACACAGTGAGTTACCAGATAGAGX4^TA
GGCATTGCACAGGAAAAGTTGGCGACCTCA
(下劃線=起始密碼子和終止密碼子；粗體為編碼序列)(5' RACE產物 AM45C08-1T3 Full—Length的序列，其克隆入pCR4-T0P0)由SEQ ID NO:22全長cDNA克隆編碼的預測蛋白質或多 肽具有如下所示的SEQ ID NO:23氨基酸序列
SPWqKAILLGKNFRELLREHGADEVEVKDIVERLMTDTTKADKDRLPNTGCD
VSYqiE
(在調整(trimming) GeneRacer寡核苷S吏序列后呈現上述序列。被克隆 入pCR4-TOPO載體的"TOPO克隆位點"。)本發明的適用核酸分子是受氮上調的基因，包含于具有 如下所示SEQ ID NO:24核苷酸序列的全長cDNA克隆中GGCCAAGCGAGGAGCGAGGCGCGGGCGCGAGCGCGTCGTTGAGAIGGAT
TCGGAGGCGGTGCAGCACGGCCTTCTCCCTCTGTCTGCCTGf55^CC
TACCGCCAACAGCTGCGCGCATTACAGCCGTGGGTGCAGCGTCGTGG
CGCCCTGCTGCGGCCAGGCCTTCGGCTGCCGCCATTGCCACAACGAC
GCCAAGAACTCGCTGGAGGTCGACCCGCGCGACCGGCACGAGATCCC
CCGCCACGAAATAAAGAAGGTGATCTGTTCTCTCTGCTCCAAGGAAC
AGGACGTGCAACAGAACTGCTCCAGCTGTGGGGCCTGCATGGGCAAG
TACTTCTGTAAAGTATGCAAGTTCTTCGATGATGATGCCTCAAAGGGC
CAGTACCACTGTGACGGATGTGGAATATGTAGAACCGGCGGCGTGGA
GAACTTTTTCCACTGTGATAAATGTGGGTGTTGCTACAGCAATGTCTT
GAAGGATTCCCACCACTGCGTCGAAAGAGCAATGCATCACAACTGCC
CCGTCTGCTTTGAGTATCTGTTCGACTCCACGAAGGACATCAGCGTGC
TGCAATGTGGGCATACCATCCATTTGGAGTGCATGAACGAGATGAGA
GCACACCATCACTTCTCATGCCCAGTGTGCTCGAGGTCCGCCTGCGA
CATGTCGGCCACATGGCGGAAGCTCGACGAGGAGGTCGCGGCCACG
CCGATGCCTGACATCTACCAGAAGCACATGGTGTGGATCCTGTGCAA
CGACTGCAGCGCGACCTCGAGCGTGCGGTTCCACGTGCTGGGGCACA
AGTGCCCCGCGTGCAGCTCGTACAACACCCGGGAGACGAGGGCTGCG
(下劃線-GeneRacer寡核苷酸序列；粗體/下劃線=起始密碼子；粗體 為編碼序列)(5， RACE產物CW55C10-FullJLength的序列，其克隆入 pCR4-TOPO)(源自MEST55誦C10， GB—ACC# BM072886)由SEQIDNO:24全長cDNA克隆編碼的預測蛋白質或多 肽具有如下所示的SEQ ID NO:25氨基酸序列
NSLEVDPRDRHEIPRHEIKKVICSLCSKEQDVQQNCSSCGACMGKYFCKVCKF
FDDDASKGQYHCDGCGICRTGGVENFFHCDKCGCCYSNVLKDSHHCVERAM
HHNCPVCFEYLFDSTKDISVLQCGHTIHLECMNEMRAHHHFSCPVCSRSACD
MSATWRKLDEEVAATPMPDIYQKHMVWILCNDCSATSSVRFHVLGHKCPAC
SSYNTRETRAACPRI SEQ ID NO:24全長cDNA克隆的基因的推定啟動子(基因 轉錄起始位點的上游)具有如下所示的SEQIDNO:26核苷酸序列cgccgcgcttagcttcgcatctt
ggagctaq
cctcctaccgccaacagctgcgcgcattacagccgtgggtgcagcgtcgtggcgccctgctgcggccag gccttcggctgccgccattgccacaacgacgccaaggttcggtggtttccctccttccgttttcgcttc ggctccggttcagcagatgttctgaaacaaccctgtcccgtgccccggcagaactcgctggaggtcgac ccgcgcgaccggcacga_gatcccccgcca_cga_aataaagaa_ggtcagcgttccctccctctgctcaa_a_g agcastctcctgcctgtttcaaccattgcctatctcgtgttcgtctttgttattaccgtgagcaaagaa
二33tgg3gc3tttgttccgcc :acggttccgttccaat
gctcagtgctctgggagccgttctgcacttcacttgcgtgtcactaaaaacttgactgctttccgcgat gtgctccgcaccaagtggccggcactgcgtggtccacaggatttttcaagagaaagccggggtcacggg
jaaagggataccgtcagaggca
cagtaactgttcccttctgtcactgaactcatatgaatcgagacttaactggagctgttgcgcaggtga
aggagcacgcatcttttggctgtactactactgctaactgcatggaaactgctcattcccatcggcaggctaccagaagcacatggtaagaagccgaccgcccactcgttcgtcgtcccgttacatcttttccacagc
acgtgctggggcacaagtgccccgcgtgcagctcgtacaacacccgggagacgagggctgcgtgcccca ggatctgaggcgaaccagaggccatgtcacaaaatgccagggagatgccgtccaacgatcatctgtctg caggacgttgctgcgcttaaggttaaaggctagcgcgagaccaggcctggtagtccagtcttgagtttg gtgctggagcatttgtsatgttcc
ggcgcgsstgca_a_cga_a_a_t castaatsscstgcsgttctsttgggccgagcctsatcaggcaccacgaatgtgaataattgcacatgg
tgatcactacaataccatctaaaatgatgtgctcccttcaaaaccattggtttatattttctatccttt cattgccattgccgttacataatggcgcatgtggcatatatgggcggcgtatgtaggttcaggatggtc acacgacatatgacgagactacagagacatggtcaagagaagttcagtggattgtgacattctgatcta
aagcctgttttgaaataaccccaggattaagcatgtttggcccaaeLgaaatttttgtgatggtggtcga
tgagaataq
ctttaaacacatacctttttgccttggtgatggataaggacataccggacatasaggggataacccttg
agttgtggcaagaa_actttataatcaaaaggttttagacttagtagaactaaaatagaatatattggat gcgatttcsgcactacatatgaggaatgagatcttagtttagaaggtctaggaaggacacctttagata
ttaggacaacgattagaccttctatattatatggaacataattttagcctacdaaaagatgatatgttt agaatgatgatatacatgatagactaggggtagcaccagtcgatcgatatggtttgaatatatccaacg
11 a_ a_ a_ a_ 3 c c a_ a_ g a_ 3 g c t a_
26actaaaaggtta'
actgtctttggttcatcttggtaagatacgtcaaaaggaccgaatgccgaagctgtgacagacatgcag ggaatatagcagagcttcgataagagttaaagcttcggcttaagatgattatgaaggtcatacaagaaa
(〉MAGI4—73717 MAGI4.contigs—w—singleton.fas 7106 bp)本發明的適用核酸分子是受氮上調的基因，包含于具有 如下所示SEQ ID NO:27核苷酉餅列的全長cDNA克隆中
GCCGGCACTGCACCGGCTGCCAGGAGGAGGCGCCTCAAATTGACGAG
GCCGTCGGCCTCGCTCTTGATGGCGAGGAAGCTAAGGAAGAAGGCTG
CCGGCAGCAAACGCCCAAGGGCGGCAGCGTCGAGGAAGCGCGCGAT
GGCGATCAGGAGGAAGATGGAAGCGCTGAGGCTGCTCGTGCCACTCT
GCGGCCGAGACAACGGCTCGGTGACCGGTGGGGCGGTCGAACGACT
GGACGAGCTCCTCATGCACGCCGCCGGGTACATCCTGCGCCTCCAGA
TGCAGGTCAGAGTGATGCAGCTTATGGTCCATGCACTAAATGACCGG
TGTCTGGGTGCAAATCA
(下劃線-GeneRacer寡核苦酸序列；粗體/下劃線=起始密碼子；粗體 為編碼序列)(5' RACE產物CW61A10-Full—Length的序列，其克隆入 pCR4-TOPO)(源自MEST61-A10, GB—ACC# BM073122)由SEQ ID NO:27全長cDNA克隆編碼的預測蛋白質或多 肽具有如下所示的SEQ IDNO:28氨基酸序列MTAHQTCCDDAVAAGTAPAARRRRLKLTRPSASLLMARKLRKKAAGSKRPR AAASRKRAMAIRRKMEALRLLWLCGRDNGSVTGGAVERLDELLMHAAGYI LRLQMQVRVMQLMVHALNDRPED SEQ ID NO:27全長cDNA克隆的基因的推定啟動子(基因
轉錄起始位點的上游)具有如下所示的SEQ ID NO:29核香酸序列
icagtattgctcgaccgaggaaga
caattaagtaggtgatcgat ctagctggctagtatatatagtggatgtggatcggatcatgtgacggccgggcggtggctgcattgcat
ccagtggcgtccgacagcgcgttttgacgaggaaaagagggtgcgggcacgcgcgcacgcatatgctcg
gtggctgcatgtggccactagtttggagaacatgcggcatatgccccggaccttcctgggcgctcaagc aaacaccgctctcgtgctcgctctcttgggaaatcgcagatgcatgctacccaacgtgacctggatctc ttttacgtacgcacaccctagcgtgctgctctcctgtgtccccgcctcctgctagctgttcacaatatc
ttatttagagtaccgtacctgtgccgtcagtgcccccaaccccaacgtaactacgcacgcacatggcat
cgatgatgccgttgccgccggcactgc atggcgaggaagct
icaacggctcggtgaccggtgg
cagagtgatgcagcttatggtccatgcactaaatgaLCcggcccga_ggattaa_tcttcttcccaagacca
tcggtgtctgggtgcaaatcattggctgagtgtgttattggtgatattatttgttcgtatatacagaat
acagccaacagttgtatgcatgtgaggggggttccttgtctgtatgtacgcaattgtctattgtgtgac ggttgaaattgaaatttcgtcaatcatcatttcttcgtctagataacgtgtgtacaaacggcgagtgtt taaatgaactagagctaataattagtggctaaaattagctggagacatccaaacaccctaactaataat
cggtatttgacaatttag
(〉MAGI4一145622 MAGI4.contigs一w一singleton.fas 2433 bp)本發明的適用核酸分子是受氮上調的基因，包含于具有 如下所示SEQ ID NO:30核香酸序列的全長cDNA克隆中1￡GATGAATTTCCCGGCTGGAAGCGGGAGGCGGCAGCAGCATCCGG
GGCCGGAGCACCTGTCGCCGATGACGCCGCTCCCGCTGGCGCGGTAG
GGGTCGGTCTACTCGCTCACGTTCGACGAGTTCCAGAGCTCGCTCGG
TGGGGCCACCAAGGACTTCGGATCCATGAACATGGACGAGCTCCTCC
GCAACATCTGGTCGGCGGAGGAGACACACAGCGTCACAGCTGCGGAC
CATGCCGCGCGGGCGCCGTACGTCCAGTGCCAGGGCTCGCTCACCCT
CCCCTGCACGCTCAGCCAGAAGACCGTCGACGAGGTCTAGCGTGACC
CGTCCGCGCCGGCGTGGTGAGGGAGGACATGATGGCGGCGGCGCCC
GTACCACCAGCGCCGGGTTGCCCACCACCTCATCTGCAACCGCCAAT
GCTGTTTCCACATGGCAATGTGTTTGCTCCCTTAGTGCCTCCGCTCCA
ATTCGGGAATGGGTTTGTGTCGGGGGCTCTCAGTCAGCAGCAGGGAG
GTGTTCTTGAGGCCCCGGCGGTATCGCCGCGGCCGGTGACGGCAAGC
GGGTTCGGGAAGATGGAAGGAGACGACTTGTCGCATCTGTCGCCATC
ACCGGTGTCGTACGTTTTTTTGTGCTGGTTTGAGGGGAAGGAAGCCA
CCAGCTGTGGACAAGGTGGTTGAGAGGAGGCAACGCC
(下劃線二GeneRacer寡核苷酸序列；粗體/下劃線=起始密碼子；粗體
為編碼序列)(5' RACE產物CW76H12-Full—Length的序列，其克隆入
pCR4-TOPO)(源自MEST76-H12, GB—ACC# BM073865)由SEQIDNO:30全長cDNA克隆編碼的預測蛋白質或多 肽具有如下所示的SEQIDNO:31氨基酸序列
DRRRG1A由SEQIDNO:30全長cDNA克隆編碼的另一預測蛋白質
或多肽具有如下所示的SEQ ID NO:32氨基S吏序列
MLEEFLVRAGVVREDMMAAAPVPPAPGCPPPHLQPPMLFPHGNWAPLVPPL QFGNGFVSGALSQQQGGVLEAPAVSPRPVTASGFGKMEGDDLSHLSPSPVSY VFLC，EGKEATSCGQGG SEQ ID NO:30全長cDNA克隆的基因的推定啟動子(基因
轉錄起始位點的上游)具有如下所示的SEQ IDNO:33核苷酸序列gtcaggccgtggcggcttggcgaggggaatggatggatatgtgtcgccaccaaggagtcgtgtggggga
(>MAGI4—7232 MAGI4.contigs—w—singleton.fas 1376 bp)本發明的適用核酸分子是受氮上調的基因，包含于具有 如下所示SEQ ID NO:34核普酸序列的全長cDNA克隆中
GCAGTACTCAGACCCTTACTACGCAGGCGTTGTTGCTCCCTATGGAAG TCAAGATGTGTGTCCGAGGAGCCTGTCTATGTGAACGCCAAGCAGTAC CGCGGCATTCTAAGACGGCGGCAGTCACGTGCCAAGGCCGAGCTJSA
TCCACAGCATATGCGCAGCCCATCCATCTCGTGCACACTTG
(下劃線=起始密碼子和終止密碼子；粗體為編碼序列)(5' RACE產物 AM77A01-5T3 Full—Length的序列，其克隆入pCR4-TOPO)由SEQ ID NO:34全長cDNA克隆編碼的預測蛋白質或多 肽具有如下所示的SEQ ID NO:35氨基酸序列
MQHSSTQTLTTQALLLPMEVKMCVRGACLCERQAVPRHSKTAAVTCQGRA (在調整GeneRacer寡核苷S吏序列后呈現上述序列。被克隆入pCR4-TOPO載體的"TOPO克隆位點"。)
本發明的適用核酸分子是受氮上調的基因，包含于具有 如下所示SEQ ID NO:36核苷酸序列的全長cDNA克隆中
扁;tcggcggcgctcgcggtgacggacgaggtggccctgccgatcc
gg6cggtgggggatctagcggccgccgccgaggtctcgcgggagga
ggtcgccgtcatcacccagtgcgcggcgctcggtgggaagttgcctt
ttgaagatgcatcagttggtgcggttcttgcagtcattaaaaacgtgg
aaagcttgagggagcaattggttgctgaaatcaggcgggtgctgaaa
gctggtggaagagtattggtgcagagccctgcaccctcatccagtca
gaagccgaacactgatattgagcgcaagttactgatgggtggatttg
ctgaagtgcaatcttctgctgcaagctcgcaggatagcgtgcaatct
gttacagttaaggcaaagaaggctagctggagcatgggctcttcttt
tccccttaagaaaacaacaaaagcccttcccaagattcaaattgacga
cgactctgatctgattgatgaagacagtctcttgactgaggaggacc
tgaagaaaccacaacttccagttgttggggactgtgaggtgggggca
gcaaagaaagcatgcaagaactgtacttgtggcagggctgaggccga
ggagaaggttgggaagctggagctcactgcggagcagatcaataacc
ctcagtcagcttgtggcagttgtgggttgggtgatgccttccgctgt
ggaacctgtccctacagaggtcttccaccattcaagcctggcgagaa
ggtttccttgtctggcaacttccttgctgctgacatatgatggcatcg
CCAACATCGGCAAAACAAGGA
(下劃線二GeneRacer寡核苷酸序列；粗體/下劃線=起始密碼子；粗體 為編碼序列)(5' RACE產物CW88H03-Full_Length的序列，其克隆入 pCR4-TOPO)(源自MEST88-H03， GB—ACC# BM079064)由SEQIDNO:36全長cDNA克隆編碼的預測蛋白質或多 肽具有如下所示的SEQ ID NO:37氨基酸序列
GAVLAVIKNVESLREQLVAEIRRVLKAGGRVLVQSPAPSSSQKPNTD正RKLL
MGGFAEVQSSAASSQDSVQSVTVKAKKASWSMGSSFPLKKTTKALPKIQIDD
DSDLIDEDSLLTEEDLKKPQLPWGDCEVGAAKKACKNCTCGRAEAEEKVG
KLELTAEQ麵PQSACGSCGLGDAFRCGTCPYRGLPPFKPGEKVSLSGNFLAA
DI] SEQ ID NO:36全長cDNA克隆的基因的推定啟動子(基因 轉錄起始位點的上游)具有如下所示的SEQIDNO:38核苷酸序列
31ccgagtgaacgtatgaaa
cttgcatgctttctttgctgcccccacctcacagtccccaactggtgaaaacatcagtgaaaacatcac
jaactaagttgacgggttttgt
atcagagtcgtcgtcaatttgaatct aagacagattctgataagttaataccttctgactggatgagggtgcagggctctgcaccaatactcttc
gcsactccaagagcttcctaagaaattgttccccaaaacatcatatagggggctgctgaaaaaaatcca ctaagagcaactccaaatgagtgcta^gaaaatttccccaaaaaatgattattggggatatgttaaaaaa ttttaggggtgaattatcat
gaagacctttgctcgccaatatttgagggagagtggagctcggatgcgggacgctgataatttgggggaggcctcctctcctctcgsagcttcacascacgccgsgttstttgatattgtsacaatctcgtcgcgcgg cttcsccsgttattactccgtagttatacttcgctsgtttsgtdtt
(>MAGI4—101388 MAGI4.contigs—w—singleton.fas 5083 bp)受氮調節(例如上調)的適用核酸分子是來自玉米的非共 生血紅蛋白基因(MEST129-C09.T3Seq)，具有如下所示的SEQ ID NO:39核苷酸序列
二cccgtgtggtcttgcg
ctttagcaatttctctctggagggagcgtgtattgttatcttgtgatcgagagcctgtgtgctgccttt由SEQ ID NO:39全長cDNA克隆編碼的預測蛋白質或多 肽具有如下所示的SEQ ID NO:40氨基S殳序列
VAAIKREMKPDA本發明的適用核酸分子是受氮上調的基因，包含于具有 如下所示SEQ ID NO:42核苷酸序列的全長cDNA克隆中CAGCAGCC4I^GCGCAGCAGCAGGAGAAGAAGCAGCAGCAGAGGGG
GAAGCTGCAGAGGGTGCTAAGGGAGCAGAAGGCTCGGCTCTACATCA
TCCGCCGATGCGTCGTCATGCTCCTCTGCTGGAGTGACTGATCCATCT
TCTTTTTCCCATCCTTTTCACCTTGCCACTTTGGTGGGCGA (下劃線-GeneRacer寡核苷酸序列；粗體/下劃線=起始密碼子和終止 密碼子；粗體為編碼序列)(5' RACE產物MEST213-C11-Full—Length 的序列，其克隆入pCR4-TOPO)由SEQ ID NO:42全長cDNA克隆編碼的預測蛋白質或多 肽具有如下所示的SEQ IDNO:43氨基酸序列 MAQQQEKKQQQRGKLQRVLREQKARLYIIRRCVVMLLCWSD (在調整后呈現上述序列。被克隆入pCR4-TOPO載體的"TOPO克隆 位點"。)本發明的適用核酸分子是受氮上調的基因，包含于具有 如下所示SEQ ID NO:44核苷酸序列的全長cDNA克隆中
CGGCTCTGCATA1X;GAGGCGAAGAAGAAGCCGTCGGCCCCCGCCGCC
GTCGGAGCCGCGCCGCCGCCGCCGGGTAACGGGTACTTCAGCACCGT
CTTCTCCGCGCCGACTGCGGGAAGCGCAAGTGACGCAAAGCATGCGG
ACTTGTACACGATGCTGAACAAGCAGAGCTCCAGAGGGCAGAATGGC
AGAGATGGCAAATCCCACAGCCGCCCTACTTACAAGGATGGCAAACA
TGCTCATCCAAATGAGCCATCAGAATCTCCTTACTTTGGCTCATCCGT
GCATTACGGTGGTCGGGAGTTCTACAGCAGCGTTTTACGGAAGCAAC
CAGCCAATGAACCCCATACGGATTACAAGGGGGACAACCCGGATGGC
TCTGCTACCAGAGGTGATTGGTGGCAAGGTTCACTTTATTACTGAATA
ATGTGGGTGTCC
(下劃線-GeneRacer寡核苷酸序列；粗體/下劃線=起始密碼子；粗體 為編碼序列)(5' RACE產物CW264H08-Full—Length的序列，其克隆 入pCR4-TOPO)(源自MEST264-腦，GB—ACC# BM350368)由SEQ ID NO:44全長cDNA克隆編碼的預測蛋白質或多 肽具有如下所示的SEQ ID NO:45氨基酸序列
A G
G M
T c
G K
G G
G c
G c
A G
A A
A G
^ c
T G
G G
G T
c
T
G CJ
T S
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c G
c A
c T
T G
c T
丁 T
c G
c T
A
G ^
G R
G g
G ^
c A
T G
A T
嵐
A G
^ G
^ T
A c
G c
G c
S c
G T
T T
c
A
G G
T A
T p
G A
T G
T G
A T
J T
c c
T c
G A
S cQSSRGQNGRDGKSHSRPTYKDGKHAHPNEPSESPYFGSSVHYGGREFYSSVL RKQPANEPHTDYKGDNPDGSATRGDWWQGSLYY
SEQ ID NO:44全長cDNA克隆的基因的推定啟動子(基因轉錄起始位點的上游)具有如下所示的SEQ ID NO:46核苦酸序列aa^gcttacacttcataagagattcatagttttatcttacagccatcgttgtcaacctcaactaccatgaatgacaagaccta^tacctaagctggacagatgatcaaggacagttttacccctggagacagaaaaacttataagacttagctttgttat￡Lcaa>aattcgaacgactgctga_agtctcgaagtata_tagtctaggctgattaaaatgtaagt atgggttaaagtgctgct〕3tccgggttgtcccccttgtactggatttaaaattcaaaataaacatta_gacttaagcgctccaaatgatcatttggatg￡Lgcatgtttgcca_tccttgta_a_<gta_gggcggctgtgggatttgccatctgagcacgaatgtatcgttgtgcttatgaacgcgacctaaatcgaagagaaacgtcaaattgacaagagtacccagaact acctctgccattctgccctctggagctctgcttgttcagcatcgtgtacaagtccgcatgctttgcgtc acttgcgcttcccttgaatgcaaaa_caaagtcaaaatgtcaacgtcata_tcca_aatagattttgcataacacaaatcgcaacatagtaacggactctttcatcaaatcgcaccagctcactaatcatgcaaaaaaatt actaagaccccaggaatctgagagcaaaatatcagaacgatggcgtgaagagacggcccgtaccgcagt cggcgcggagaagacggtgctgaagtacccgttacccggcggcggcggcgcggctccgacggcggcgggcta_gactctcga_gagga_tgga_ccgtga_a_caLCttgacttgaggcggaaaaggatgggggcacgtgaagtgggccaacatctgtgccggcatttaaaggcctcgacggagcgactcggtttcgctatttcggagatctta aggggctgasgttagtatacgaatta_ttta>' caagtgcttccaaacatat attagtttttaacttggta'agattaaaaatattaattcaatctactstttttt(〉MAGI4— 139395 MAGI4.contigs—w—singleton.fas 2631 bp)
本發明涉及具有玉米受氮調節之核酸分子的核酸構建 體。該構建體還包括5， DNA啟動子序列和3，終止子序列。所述核酸 分子、DNA啟動子序列和終止子序列操作性連接以允許該核酸分子 轉錄。35
本發明的核酸分子可使用本領域眾所周知的試劑插入到 許多可用表達載體和細胞體系的任一表達載體和細胞體系中。適合 的載體包括但不僅限于以下病毒載體，如人載體系統gtll 、 gt WES.tB、 Charon 4;和質粒載體，如pG-Cha、 p35S-Cha、 pBR322、 pBR325 、 pACYC177 、 pACYC簡4 、 pUC8 、 pUC9 、 pUC18 、 pUC19、 pLG339、 pR290、 pKC37、 pKC101、 SV 40、 pBluescript II SK +/-或KS +/-[參見"Stratagene Cloning Systems" Catalog ("Stratagene克隆系統"目錄)(1993),得自Stratagene, La Jolla, CA，其 全部內容在此引作參考]、pQE、 pIH821、 pGEX、 pET系列[參見 Studier等,"Use of T7 RNA Polymerase to Direct Expression of Cloned Genes (利用T7 RNA聚合酶指導克隆基因的表達")，Gewe五xpm^ow Tec/wo/ogy vol. 185 (1990)，其全部內容在此引作參考]，以及上述的 任一衍生物。重組分子可以通過轉化，特別是轉導、接合、帶動轉 移或電穿孔，被引入細胞中。用本領域的標準克隆程序將DNA序列 克隆入載體，描述參見 Sambrook 等，M /ecw/w C7麵'"g: ^ 丄a6oratory Afo"wa/， Second Edition, Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Press (1989)，和 Ausubel等，C鮮e"f尸ratoco/s Mo/ecw/arNew York, N.Y: John Wiley & Sons (1989)，其全部 內容在此引作參考。在制備表達用核酸載體時， 一般可將各種核酸分子序列 插入或替換入細菌質粒中。可使用任何便利的質粒，其特征是具有 細菌復制系統、有允許在細菌中進行篩選的標記和 一 般有 一 個或多 個獨特、便于定位的限制性酶切位點。有許多質粒(被稱為轉化載體) 可用于植物轉化。載體的選擇將取決于優選的轉化技術和轉化的目 標物種。有各種載體可用于利用才艮癌農桿菌G4graZ)Gcten'wm ^me/ac/e附)(形成冠癭的土傳細菌)進4亍穩定轉化。冠癭的特征是在被 感染植抹的主干基部和主根上形成的腫瘤或癭。這些腫瘤因細菌質 粒DNA的一部分轉移并摻入植物染色體DNA中所致。這種轉移DNA (T-DNA )與植物細胞的正常基因一起被表達。用作"腫瘤誘導質 粒"的質粒DNA-pTi或Ti-DNA包含了使T-DNA移入植物中所必 需的w>基因。該T-DNA攜帶編碼參與植物調節因子生物合成的蛋 白質和細菌營養素(冠癭堿)的基因。該T-DNA由兩個25bp不完整同 向重復序列(被稱為"邊界序列")定界。通過除去癌基因和冠癭堿基 因，并用感興趣基因替代它們，就可能將外源DNA轉移進入植物而 沒有肺瘤形成或根癌農桿菌的復制[Fraley等，"Expression of Bacterial Genes in Plant Cells (細菌基因在植物細胞中的表達)，，，A^7爿c"ci. 80: 4803-4807 (1983),其全部內容在此引作參考]。
這項技術的進一 步改進導致發展出二元載體系統[Bevan， "Binary爿gro6a"eW調Vectors for Plant Transformation (用于植物轉化 的二元農桿菌載體)"，M/c/ez'c Jc/A腦.12:8711-8721 (1984),其全部 內容在此引作參考]。在該系統中，從pTi中移除所有的T-DNA序列 (包括邊界)，并將含T-DNA的第二載體引入根癌農桿菌中。該第二 載體具有在大腸桿菌和根癌農桿菌中均可復制的優勢，并包含有利 于克隆轉基因的多克隆位點。常用載體的例子是pBinl9 [Frisch等， "Complete Sequence of the Binary Vector Binl9 (二元載體Binl9的全 序列)"，尸te Mo/ec.腸/. 27:405-409 (1995),其全部內容在此引作參 考]。現在或以后所知的用于遺傳轉化的任何合適載體都適合于在本 發明中使用。 Cohen和Boye的第4,237,224號美國專利(其全部內容在 此引作參考)描述了利用限制性內切酶切割和用DNA連接酶連接來
產生重組質粒形式的表達系統。然后，這些重組質粒借助轉化被引
入包括原核生物和在組織培養中生長的真核細胞的單細胞培養物，
并在其中復制。在載體構建體中還引入了某些"控制元件"或"調節序列"。 這些包括載體的非翻譯區、啟動子以及與宿主細胞蛋白質相互作用 以進行轉錄和翻譯的5'和3'非編碼區。這些元件的強度和特異性可能會有所不同。根據采用的載體系統和宿主，可以使用任何數量的合 適轉錄元件和翻譯元件，包括組成型啟動子和誘導型啟動子。也可 以使用組織特異性啟動子和器官特異性啟動子。組成型啟動子是指導基因在有機體整個發育和生活期表
達的啟動子。廣泛用于誘導轉基因表達的一些組成型啟動子的例子
包括來自根癌農桿菌的胭脂堿合成酶("NOS")基因啟動子(Rogers 等的第5，034，322號美國專利，其全部內容在此引作參考)、花椰菜花 葉病毒("CaMV") 35S和19S啟動子(Fmley等的第5，352，605號美國 專利，其全部內容在此引作參考)、來自幾種肌動蛋白基因(已知其在 大多數類型細胞中都有表達)(Privalle等的第6，0020，68號美國專利， 其全部內容在此引作參考)中任一種的啟動子以及泛素(已知在多種類 型細胞中有積累的基因產物)的啟動子。誘導型啟動子是在應答誘導物時能直接或間接地激活一 個或多個DNA序列或基因轉錄的啟動子。在缺乏誘導物時，所述 DNA序列或基因不發生轉錄。誘導物可以是養分(如氮，包括硝酸鹽 形式的氮)、化學因子(如代謝產物、生長調節劑、除草劑或酚類化合 物)或直接施加于植物的生理脅迫[如冷、熱、鹽、毒素或借助病原體 或致病因子(如病毒或真菌)的作用]。通過對細胞或植物外部施用誘 導物，如通過噴灑、灌溉、加熱或暴露于可操作性病原體，可以使 含有誘導型啟動子的植物細胞接觸到誘導物。適用誘導型啟動子的 例子是糖皮質激素誘導性啟動子[Schena等，"A Steroid-Inducible Gene Expression System for Plant Cells (用于植物細胞的固醇誘導性基 因表達)"，iVoc.淑/. JcW. 88:10421-5 (1991)，其全部內容在此引 作參考]。當轉基因植物接觸納摩爾濃度的糖皮質激素，或接觸地塞 米松(糖皮質激素類似物)時，在轉化植物中可誘導轉基因所編碼蛋白 質的表達[參見Schena等，"A Steroid-Inducible Gene Expression System for Plant Cells (用于植物細胞的固醇誘導性基因表達)"，iVoc. v4cad88:10421-5 (1991); Aoyama等，"A Glucocorticoid-Mediated Transcriptional Induction System in Transgenic Plants (在轉基 因植物中糖皮質激素介導的轉錄誘導系統)"，尸/朋f /. 11:605-612 (1997);和McNellis等，"Glucocorticoid-Inducible Expression of a Bacterial Avirulence Gene in Transgenic Arabidopsis Induces Hypersensitive Cell Death (轉基因擬南芥中細菌無毒基因的糖皮質激 素誘導性表達誘導過敏性細胞死亡)，，，尸/aw/丄14(2):247-57 (1998),其 全部內容在此引作參考]。此外，誘導型啟動子包括在植物的選定組 織內以組織特異性方式調節感興趣基因的啟動子。這類組織特異性 或發育調控型啟動子的范例包括種子、花、果實或根特異性的啟動 子，它們是本領域眾所周知的(Shewmaker等的第5,750,385號美國專 利，其全部內容在此引作參考)。已經開發了許多組織和器官特異性啟動子用于植物基因 工程[Potenza 等，"Targeting Transgene Expression in Research, Agricultural, and Environmental Applications: Promoters used in Plant Transformation (研究、農業和環境應用中的靶向轉基因表達用于植 物轉化的啟動子)"/" Ce//. Dev. P/""/ 40:1-22 (2004)，其全 部內容在此引作參考]。這些啟動子的范例包括花特異性啟動子 [Annadana等,"Cloning of the Chrysanthemum UEP1 Promoter and Comparative Expression in Florets and Leaves of Dewcira"f/ze附a graw^/7ora (菊花UEP1啟動子的克隆和在紫花玉蘭的花和葉中的比 較表達)，"rra附ge"ic 11:437-445(2002),其全部內容在此引作參 考]、種子特異性啟動子[Kluth等，"5， Deletion of a Promoter Region Leads to Changes in Tissue and Developmental Specificities (gZw〃啟動子區的5'缺失導致組織和發育特異性的變化)，"P/aW Mo/, 歷o/. 49:669-682 (2002)，其全部內容在此引作參考]、根特異性啟動子 [Yamamoto等，"Characterization of c/s-acting Sequences Regulating Root-Specific Gene Expression in Tobacco (煙草中調節根特異性基因表 達的順式作用序列的表征),"P/""/ Ce〃 3:371-382 (1991)，其全部內容 在此引作參考]、果實特異性啟動子[Fraser等，"Evaluation of
39Transgenic Tomato Plants Expressing an Additional Phytoene Synthase in a Fruit-Specific Manner (以果實特異方式表達額外八氬番癡紅素合酶 的轉基因番茄植株的評價),"Prac. A^//. JcW. 99: 1092-
1097(2002)，其全部內容在此引作參考]、和塊莖/儲藏器官特異性啟 動子[Visser等，"Expression of a Chimaeric Granule-Bound Starch Synthase-GUS gene in transgenic Potato Plants (轉基因馬鈴薯植抹中嵌 合顆粒結合型淀粉合成酶-GUS基因的表達)，"戶/a^Mo/. S/o/. 17:691-699 (1991),其全部內容在此引作參考]。如果在整個植抹中表達所引 入基因(轉基因)可能造成有害影響，那么轉基因的定向表達是有必要 的。另一方面，在整個植林中使基因沉默也可能產生負面影響。然 而，通過組織特異性啟動子將沉默定位在某一區域內，可以避免這 樣的問題。適用的啟動子也可以是基因特異性啟動子，因為其調節 本發明核酸分子的轉錄。適用的基因特異性啟動子(來自MAGI93503) 具有如下所示的SEQIDNO:41核香酸序列順序
ATCAGCAGACAGCAGGCATG
該基因特異性啟動子是玉米基因組DNA的片段，其可能包括允 許SEQ ID NO:39的基因展現受氮調節表達的啟動子元件。其它適用 啟動子包括具有下述核苷酸序列的啟動子SEQ ID NO:3、 SEQ ID NO:6、 SEQ ID NO:9、 SEQ ID NO: 12、 SEQ ID NO:15、 SEQ ID NO: 18、 SEQ ID NO:21、 SEQ ID NO:26、 SEQ ID NO:29、 SEQ ID NO:33、 SEQIDNO:38、 SEQ ID NO:41和/或SEQIDNO:46。
本發明的核酸構建體還包括可操作性的3'調控區，其選 自能夠為在所選宿主細胞進行表達提供mRNA的正確轉錄終止和聚 腺苷酸化的調控區，操作性地與本發明改良型性狀核酸分子連接。 若干3'調控區已知在植物中是可操作性的。示例性的3'調控區包括但 不僅限于胭脂堿合成酶(NOS) 3'調控區[Fraley等，"Expression of Bacterial Genes in Plant Cells (細菌基因在植物細胞中的表達)，" 胸7為d 園80:4803-4807 (1983),其全部內容在此引作參考] 和花椰菜花葉病毒(CaMV) 3'調控區[Odell等，"Identification of DNA Sequences Required for Activity of the Cauliflower Mosaic Virus 35S Promoter (花椰菜花葉病毒35S啟動子活性所需DNA序列的鑒定)，" 胸,313 (6005):810-812 (1985),其全部內容在此引作參考]。幾乎 所有的已知在植物中可搡作的3'調控區都將適合與本發明結合應用。使用如下描述的眾所周知的分子克隆技術，可以將上文 所述的不同組分連接在一起以產生含有本發明核酸構建體的表達系 統Sambrook等，Mo/ecw/<ar C7。m'"g: ￡"6oratoAy Ma"wa/， Second Edition, Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Press (1989)，和 Ausubel等,Cwre打f TVofoco/s A/b/ecw/or New York, N.Y:
John Wiley & Sons (1989)，其全部內容在此引作參考。 —旦制備了本發明的核酸構建體，就可將其摻入宿主細 胞。因此，本發明的另一個方面涉及含有一個或多個本發明核酸構 建體的重組宿主細胞。從基本上來說，該方法通過在能使核酸分子 在宿主細胞中有效地實現轉錄的條件下，用本發明核酸構建體轉化 宿主細胞來實施。這可以通過本領域眾所周知的標準克隆程序來實 現，所述程序例如描述于Sambrook等，Mo/ecw/ar C7om'"g.'爿 丄a6orarto^y ^Mi3wwa/, Second Edition, Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Press (1989)，其全部內容在此引作參考。適用的宿主 包括但不僅限于細菌細胞、病毒、酵母細胞、哺乳動物細胞、昆 蟲細胞、植物細胞等等。優選宿主是細菌細胞或植物細胞。轉化方法可能導致核酸在啟動子控制下的瞬時表達或穩定表達。雖然瞬時 表達可以達到重要目的，尤其是當被研究植物生長緩慢時，但優選 作為轉化的結果，本發明核酸構建體被穩定地插入到重組植物細胞 的基因組中。適用于轉化的植物組織包括葉組織、才艮組織、分生組 織、合子胚和體細胞胚、愈傷組織、原生質體、穗(tassel)、花粉、 胚、花藥等。所選轉化手段是最適合待轉化組織的方法。可以借助粒子轟擊實現在植物組織中的瞬時表達[Klein 等，"High-Velocity Microprojectiles for Delivering Nucleic Acids Into Living Cells (用于向活細胞轉移核酸的高速微彈)，，，Atow" 327:70-73 (1987)，其全部內容在此引作參考],粒子轟擊也被稱為宿主細胞的基 因槍轉化，如以下文獻所述Sanford等的第4,945,050、 5,036,006和 5,100,792號美國專利,以及Emerschad等，"Somatic Embryogenesis and Plant Development from Immature Zygotic Embryos of Seedless Grapes (Kto v/m/era)(源自無核葡萄(W他v/m/era)未成熟合子胚的體 細胞胚胎發生和植物發育)"，Ce〃 14:6-12 (1995),其全
部內容在此引作參考。在粒子轟擊中，鎢或金微粒(直徑為1-2pm)用感興趣 DNA包被，然后利用高壓氣體轟擊組織。通過這種方式，可以將外 源DNA遞送細胞核并在組織的正常條件下獲得這種基因的暫時性表 達。還可以將生物活性粒子(例如含有載體和外源DNA的干細菌細 胞)推入到植物細胞中。也可以使用現在已知或以后開發的其他多種 粒子轟擊的變體。此外，可用粒子轟擊轉化法將核酸構建體穩定地 引入植物細胞。將核酸構建體穩定地引入植物細胞的另一適用方法是 用已尋皮核酸構建體轉化的才艮癌農桿菌(^graZ ac^7'w附mwe々c/era)或毛 才艮農桿菌(」gra6"c/en'ww r/2/zoge"es)去感染才直物細月包。如上所述，農 桿菌的Ti (或RI)質粒能夠非常成功地將外源核酸分子轉移進入植物
42細胞。改變的農桿菌轉化方法利用真空滲入，其中使用了整抹植物。另一種引入方法是原生質體與其他實體融合，其中其它 實體可以是小細胞、細胞、溶酶體或其他可融合性脂質表面體[Fraley 等，尸roc.胸/.固79:1859-63 (1982),其全部內容在此引 作參考]。也可借助電穿孔將核酸分子引入植物細胞[Fromm等，/Voc. 扁.Jcad USA 82:5824 (1985)，其全部內容在此引作參考]。在
孔。高場強電脈沖可逆性地-使生物膜通透，從而允許質粒的進入。 經過電穿孔的植物原生質重新形成細胞壁、分裂和再生。其他轉化 方法包括聚乙烯介導植物轉化、顯微注射、物理摩擦(physical abrasives)和;敫光束[Senior, "Uses of Plant Gene Silencing (才直物基因沉 F夫的矛J用)",J /otec/z"o/ow Gewe"c五"g7'"eer/wg 15:79-119 (1998),其全部內容在此引作參考]。轉化的確切方法對本發明的實施 不是關鍵的。能導致所選宿主細胞有效轉化的任何方法都適用于本 發明的實施。轉化也可以使用"whisker"方法實現，這是本領域眾所 周知的。在轉化后，必須使轉化植物細胞再生。從培養的原生質 體再生植林的描述見Evans等，//""必oc^ 。/尸/"W CW/ CW&my， Vol,l, New York, New York:MacMillan Publishing Co. (1983); Vasil編輯，CW/ Cw/f廳a"t/ 5b麵"c Ce〃 o/尸/a他，Vol. I (1984)和Vol. Ill
(1986)， Orlando: Acad. Press,其全部內容在此引作參考。再生手段依據植物物種的不同而變化，但一般來說，首 先是提供轉化原生質體的懸浮液或含外植體的培養皿。形成愈傷組 織，可從愈傷組織誘導芽，隨后生根。或者，可在愈傷組織中誘導 胚形成。這些胚如天然胚一樣萌發形成植株。培養基通常會含有各種氨基酸和激素，如生長素和細胞分裂素。有效的再生將取決于培 養基、基因型以及培養物史。如果控制了這三個變量，則再生通常 具重現性和可重復性。優選地，首先利用與本發明核酸構建體同時被引入宿主 細胞的選擇標記來鑒定出轉化細胞。適用的選擇標記包括但不僅限 于編碼抗生素抗性的標記，如賦予卡那霉素抗性的新霉素磷酸轉 移酶II ("nptII")基因(Fraley等，尸腦扁.」cd 5W.園80:4803-4807 (1983)，其全部內容在此引作參考)；和賦予下列抗性的基因 慶大霉素抗性、G418抗性、潮霉素抗性、鏈霉素抗性、壯觀霉素抗 性、四環素抗性、氯霉素抗性等。讓細胞或組織在含適當抗生素的 選擇培養基中生長，藉此通常只有表達抗生素抗性標記的那些轉化
子能繼續生長。其他類型標記也適合包括在本發明的表達盒中。例 如，編碼除草劑耐性如耐磺酰脲類的基因、或賦予曱氨蝶呤抗性的 dhfr基因(Bourouis等，￡M50丄2: 1099-1104 (1983),其全部內容在此 引作參考)是有用的。同樣，編碼產生可識別化合物的酶的"報告基 因"也是適用的。基因融合實驗使用最廣泛的報告基因是"WA，這是 源自大腸桿菌的編碼P-葡萄糖醛酸酶蛋白的基因，又稱為GUS [Jefferson等，"GUS Fusions: (3 Glucuronidase as a Sensitive and Versatile Gene Fusion Marker in Higher Plants (GUS融合體作為高等植物靈敏 而通用的基因融合標記的p-葡萄糖醛酸酶)"丄6:3901-3907 (1987),其全部內容在此引作參考]。同樣，產生可因發光而鑒別的化 合物的酶(如熒光素酶)也是有用的。所用的選擇標記將取決于目標物 種；對于特定目標物種，優選不同的抗生素、除草劑或生物合成選 擇標記。隨后，檢測利用抑制劑或其他選擇標記篩選出的植物細 胞和組織是否獲得所述轉基因[Sambrook等，Mo/ecw/ar C7om'wg:爿 Z^orato/j Mcww<2/， Second Edition, Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Press (1989)，其全部內容在此引作參考]。
在含有本發明核酸構建體的融合基因被穩定地摻入轉基
因植物后，該轉基因可以通過有性雜交被轉移到其它植物。可使用 若干標準育種技術的任一種，這取決于待雜交的物種。 一旦產生了 這種類型的轉基因植物，則該植物本身可按照常規程序栽培，使所 述核酸構建體存在于所產生的植物中。或者，從轉基因植物收獲轉 基因種子。這些種子可以隨后被種植在土壤中，并使用傳統程序培 育以生產轉基因植物。本發明包括這些植物的組成部分和果實。本發明可廣泛應用于各種各樣的植物或其種子。適用植 物包括雙子葉植物和單子葉植物。更具體地說，適用植物包括 稻、玉米、大豆、油菜(canola)、馬鈴薯、小麥、綠豆、苜蓿、大 麥、黑麥、棉花、向日葵、花生、甘薯、菜豆、豌豆、菊苣、萵 苣、苣荬菜、巻心菜、抱子甘藍、甜菜、歐洲防風草、蕪菁、花椰
菜、青花菜、蘿卜、菠菜、洋蔥、蒜、茄子、辣椒、芹菜、胡蘿 卜、南瓜、西葫,、小西葫蘆、黃瓜、蘋果、梨、甜瓜、柑橘、草
莓、葡萄、覆盆子、菠蘿、煙草、番茄、高粱、甘蔗、香蕉、擬南 芥、非洲紫羅蘭屬(Sa/"0做to)、矮牽牛、天竺葵、 一品紅、菊花、 香石竹、藏紅花、萬壽菊、水仙花、松、蒺藜苜蓿(M^^"伊 fnmc"rtJa)、 /SWwt/ersw.a "wra油'ac"和百曰菊。本發明的另 一個方面是在植物中表達受氮調節之核酸分 子的方法。這種方法涉及提供用核酸構建體轉化的轉基因植物或轉 基因植物種子，該核酸構建體具有玉米受氮調節的核酸分子、5' DNA啟動子序列和3'終止子序列。所述核酸分子、5'DNA啟動子序
列和3'終止子序列#:作性地連"1矣以允許該核酸分子的轉錄。該方法還
涉及在轉基因植物或由轉基因植物種子生長的植物中能有效表達所 述核酸分子的條件下，培育所述轉基因植物或由所述轉基因植物種 子生長的轉基因植物。在一個實施方案中，轉基因植物或轉基因植 物種子通過以下步驟來提供用本發明核酸構建體轉化非轉基因植 物或非轉基因植物種子，以產生所述轉基因植物或轉基因植物種子。 一方面，培育步驟有效地減少該轉基因植物或由該轉基因植物 種子生長的植物的氮吸收。另一個方面，培育步驟有效地增加了該 轉基因植物或由該轉基因植物種子生長的植物的氮吸收。再 一 方 面，培育步驟有效地提高了該轉基因植物或由該轉基因植物種子生 長的植物的氮利用效率。轉基因植物或轉基因植物種子的轉化可利
用下述方法實現農桿菌介導轉化、whisker法、真空滲入、基因槍 轉化、電穿孔、顯微注射、聚乙烯介導轉化或激光束轉化。本發明還涉及來自玉米的分離的DNA啟動子，其適用于 誘導由與所述DNA啟動子操作性連接的分離DNA分子所編碼蛋白 質的受氮調節的表達。在本方法使用的適用DNA啟動子可以是此處 所述的任一啟動子，包括例如具下述核苷酸序列的啟動子SEQ ID NO:3、 SEQ ID NO:6、 SEQ ID NO:9、 SEQ ID NO: 12、 SEQ ID NO: 15、 SEQ ID NO: 18、 SEQ ID NO:21、 SEQ ID NO:26、 SEQ ID NO:29、 SEQ ID NO:33、 SEQ ID NO:38、 SEQ ID NO:41和/或SEQ ID NO:46。所述分離DNA啟動子可用于制備如上所述的核酸構建 體。在特定的核酸構建體中，所述分離DNA啟動子可與分離核酸操 作性連接，所述分離核酸或者具有下述核苷酸序列(或其編碼部分) SEQ ID NO: 1、 SEQIDNO:4、 EQIDNO:7、 SEQ ID NO: 10、 SEQ ID NO:13、 SEQ ID NO:16、 SEQ ID NO:19、 SEQ ID NO:22、 SEQ ID NO:24、 SEQ ID NO:27、 SEQ ID NO:30、 SEQ ID NO:34、 SEQ ID NO:36、 SEQ ID NO:39、 SEQ ID NO:42和/或SEQ ID NO:44，或者 編碼具下述氨基酸序列的多肽SEQ ID NO:2、 SEQ ID NO:5、 SEQ IDNO:8、 SEQIDNO:ll、 SEQIDNO:14、 SEQ ID NO: 17、 SEQ ID NO:20、 SEQ ID NO:23、 SEQ ID NO:25、 SEQ ID NO:28、 SEQ ID NO:31、 SEQ ID NO:32、 SEQ ID NO:35、 SEQ ID NO:37、 SEQ ID NO:40、 SEQ ID NO:43和/或SEQ ID NO:45。可由本發明DNA啟動 子調節的其他適用玉米基因包括例如硝酸還原酶、亞硝酸還原酶、
尿卟啉-ni甲基轉移酶。通過將所述核酸構建體插入適當的載體(詳見上文所述)而可制備表達載體，通過用含所述DNA啟動子的所述核
酸構建體進行轉化，可產生轉基因宿主細胞和植物(包括其組成部 分，如果實和種子)。本發明還涉及指導分離核酸在植物中受氮調節的表達的 方法。這種方法涉及用核酸構建體轉化植物細胞，該核酸構建體包 括適合誘導與所述DNA啟動子操作性連接的分離DNA分子所編碼 蛋白的氮調節表達的分離DNA啟動子。這種方法還涉及從轉化植物 細胞再生植株。用這種方法，所述核酸分子在所述DNA啟動子控制 下的表達可在植物中發生并受氮的上調。本方法使用的適用DNA啟 動子可以是此處所述的任一啟動子，包括例如具下述核苷酸序列的 啟動子SEQ ID NO:3、 SEQ ID NO:6、 SEQ ID NO:9、 SEQ ID NO: 12、 SEQ ID NO: 15、 SEQ ID NO: 18、 SEQ ID NO:21、 SEQ ID NO:26、 SEQ ID NO:29、 SEQ ID NO:33、 SEQ ID NO:38、 SEQ ID NO:41和/或SEQ IDNO:46。雖然此處描述并詳細4又述了優選實施方案，^a對相關領
域技術人員來說顯而易見的是，在不脫離本發明精神的情況下，可 以進行各種修改、補充、替代等，因此，所有這些改變都被認為是 落入本發明范圍內，本發明的范圍如下述權利要求書所限定。
權利要求
1.核酸構建體，其包含玉米受氮調節的核酸分子；5’DNA啟動子序列；和3’終止子序列，其中，所述核酸分子、DNA啟動子序列和終止子序列操作性地連接，以允許所述核酸分子轉錄。
2. 權利要求l的核酸構建體，其中，所述核酸分子(a) 或者編碼多肽，所述多肽具有選自以下的氨基酸序列SEQ ID NO:2、 SEQ ID NO:5、 SEQ ID NO:8、 SEQ ID NO:ll、 SEQ ID NO: 14、 SEQ ID NO: 17、 SEQ ID NO:20 NO:25、 SEQ ID NO:28、 SEQ ID NO:31 NO:35、 SEQ ID NO:37、 SEQ ID NO:40、 NO:45;(b) 或者包含選自以下的核苷酸序列 NO:4、 SEQ ID NO:7、 SEQ ID NO: 10、 NO:16、 SEQ ID NO:19、 SEQ ID NO:22 NO:27、 SEQ ID NO:30、 SEQ ID NO:34 NO:39、 SEQ ID NO:42和SEQ ID NO:44;(c) 或者包含選自以下的核苷酸序列中的編碼部分' NO:l、 SEQ ID NO:4、 SEQ ID NO:7、 SEQ ID NO:IO、 NO: 13、 SEQ ID NO: 16、 SEQ ID NO: 19、 SEQ ID NO:22、 NO:24、 SEQ ID NO:27、 SEQ ID NO:30、 SEQ ID NO:34、 NO:36、 SEQIDNO:39、 SEQ ID NO:42和SEQ ID NO:44。
3. 權利要求1的核酸構建體，其中，所迷DNA啟動子序列是組 成型植物啟動子。
4. 權利要求1的核酸構建體，其中，所迷DNA啟動子序列是誘 導型植物啟動子。SEQ ID NO:l、 SEQ ID NO: 13、 SEQ ID NO:24、 SEQ ID NO:36、SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ IDSEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID
5. 權利要求4的核酸構建體，其中，所述誘導型植物啟動子是氮誘導型植物啟動子。
6. 權利要求5的核酸構建體，其中，所述氮誘導型植物啟動子 包含選自以下的核香酸序列SEQIDNO:3、 SEQ ID NO:6、 SEQ ID NO:9、 SEQ ID NO: 12、 SEQ ID NO: 15、 SEQ ID NO:18、 SEQ ID NO:21、 SEQ ID NO:26、 SEQ ID NO:29、 SEQ ID NO:33、 SEQ ID NO:38、 SEQIDNO:41和 SEQIDNO:46。
7. 權利要求1的核酸構建體，其中，所述DNA啟動子序列是組 織特異性啟動子。
8. 權利要求1的核酸構建體，其中，所述DNA啟動子序列是器 官特異性啟動子。
9. 表達載體，其包含權利要求1的核酸構建體。
10. 用權利要求1的核酸構建體轉化的宿主細胞。
11. 權利要求10的宿主細胞，其中，所述宿主細胞是細菌細胞 或植物細胞。
12. 權利要求11的宿主細胞，其中，所述宿主細胞是植物細胞。
13. 用權利要求1的核酸構建體轉化的植物。
14. 權利要求13的植物，其中，植物選自稻、玉米、大豆、 油菜、馬鈴薯、小麥、綠豆、苜蓿、大麥、黑麥、棉花、向曰葵、 花生、甘薯、菜豆、豌豆、菊苣、萵苣、苣荬菜、巻心菜、抱子甘 藍、甜菜、歐洲防風草、蕪菁、花椰菜、青花菜、蘿卜、菠菜、洋 蔥、蒜、茄子、辣椒、芽菜、胡蘿卜、南瓜、西葫蘆、小西葫蘆、 黃瓜、蘋果、梨、甜瓜、柑橘、草莓、葡萄、覆盆子、菠蘿、煙 草、番茄、高粱、甘蔗、香蕉、擬南芥、非洲紫羅蘭屬、矮牽牛、 天竺葵、 一品紅、菊花、香石竹、藏紅花、萬壽菊、水仙花、松、 蒺藜苜蓿、iSawciersow/a awra""'aca和百日菊。
15. 權利要求13的;f直物的組成部分。
16. 利要求13的植物的果實。
17. 由權利要求13的植物產生的植物種子。
18. 用權利要求1的核酸構建體轉化的植物種子。
19. 在植物中表達受氮調節的核酸分子的方法，所述方法包括提供用權利要求1的核酸構建體轉化的轉基因植物或轉基因植 物種子，并且在所述轉基因植物或由轉基因植物種子生長的所述植抹中能有 效表達所述核酸分子的條件下，培育該轉基因植物或由該轉基因植 物種子生長的植物。
20. 權利要求19的方法，其中，所述培育有效地減少所述轉基 因植物或由轉基因植物種子生長的植物的氮吸收。
21. 權利要求19的方法，其中，所述培育有效地增加所述轉基 因植物或由轉基因植物種子生長的植物的氮吸收。
22. 權利要求19的方法，其中，所述培育有效地提高所述轉基 因植物或由轉基因植物種子生長的植物的氮利用效率。
23. 權利要求19的方法，其中，提供轉基因植物。
24. 權利要求19的方法，其中，提供轉基因植物種子。
25. 權利要求19的方法，其中，所述植物選自稻、玉米、大 豆、油菜、馬鈴薯、小麥、綠豆、苜蓿、大麥、黑麥、棉花、向曰 葵、花生、甘薯、菜豆、豌豆、菊苣、萵苣、苣荬菜、巻心菜、抱 子甘藍、甜菜、歐洲防風草、蕪菁、花椰菜、青花菜、蘿卜、菠 菜、洋蔥、蒜、茄子、辣椒、芹菜、胡蘿卜、南瓜、西葫蘆、小西 葫蘆、黃瓜、蘋果、梨、甜瓜、柑橘、草莓、葡萄、覆盆子、菠蘿、煙草、番茄、高粱、甘蔗、香蕉、擬南芥、非洲紫羅蘭屬、矮 牽牛、天竺葵、 一品紅、菊花、香石竹、藏紅花、萬壽菊、水仙 花、松、蒺藜苜蓿、5""w6feraow'a (3wra"",aca和百日菊。
26. 權利要求19的方法，其中，所述提供包括用所述核酸構建體轉化非轉基因植物或非轉基因植物種子，以產生所述轉基因植 物或轉基因植物種子。
27. 權利要求26的方法，其中，所述轉化包括農桿菌介導轉 化、whisker方法轉化、真空滲入、基因槍轉化、電穿孔、顯微注 射、聚乙烯介導轉化或激光束轉化。
28. 來自玉米的分離DNA啟動子，其適用于誘導由與所述DNA 啟動子才喿作性連接的分離DNA分子所編碼蛋白質的氮調節表達，其 中，所述DNA啟動子包含選自以下的核苷酸序列SEQ ID NO:3、 SEQIDNO:6、 SEQIDNO:9、 SEQIDNO:12、 SEQIDNO:15、 SEQ IDNO:18、 SEQIDNO:21、 SEQIDNO:26、 SEQIDNO:29、 SEQ ID NO:33、 SEQIDNO:38、 SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:46。
29. 核酸構建體，其包含 編碼蛋白質的分離核酸分子；權利要求28的分離DNA啟動子，其中，該DNA啟動子操作性 連接到所述分離核酸分子的5'端以誘導該核酸分子的轉錄；和 與所述分離核酸分子操作性連接的.3，終止子序列。
30. 表達載體，其包含權利要求29的核酸構建體。
31. 用權利要求29的核酸構建體轉化的宿主細胞。
32. 用權利要求29的核酸構建體轉化的植物。
33. 由權利要求32的植物產生的植物種子。
34. 用權利要求29的核酸構建體轉化的植物種子。
35. 指導分離的核酸分子在植物中受氮調節表達的方法，所述方 法包括用權利要求29的核酸構建體轉化植物細胞，并 由該轉化植物細胞再生植株，其中，所述核酸分子在所迷DNA 啟動子控制下的表達在所述植抹中發生，并受氮的上調。
36. 玉米中受氮調節的分離核酸分子，其中，所述核酸分子包含選自以下的核苷酸序列SEQ ID NO: 1、 SEQ ID NO:4、 SEQ ID NO:7、 SEQ ID NO:IO、 SEQ ID NO:13、 SEQ ID NO:16、 SEQ ID NO:19、 SEQ ID NO:22、 SEQ ID NO:24、 SEQ ID NO:27、 SEQ ID NO:3Q、 SEQ ID NO:34、 SEQ ID NO:36、 SEQ ID NO:39、 SEQ ID NO:42和SEQ ID NO:44;或選自以下的核苷酸序列中的編碼部分SEQ ID NO: 1、 SEQ ID NO:4、 SEQ ID NO:7、 SEQ ID NO:IO、 SEQ ID NO:13、 SEQ ID NO: 16、 SEQ ID NO: 19、 SEQ ID NO:22、 SEQ ID NO:24、 SEQ ID NO:27、 SEQ ID NO:30、 SEQ ID NO:34、 SEQ ID NO:36、 SEQ ID NO:39、 SEQ ID NO:42和SEQ ID NO:44。
37.分離的蛋白質或多肽，其中，所述分離蛋白質或多肽包含選 自以下的氨基酸序列SEQ ID NO:2、 SEQ ID NO:5 、 SEQ ID NO:8、 SEQ ID NO:ll、 SEQ ID NO:14、 SEQ ID NO:17、 SEQ ID NO:20、 SEQ ID NO:23、 SEQ ID NO:25、 SEQ ID NO:28、 SEQ ID NO:31、 SEQ ID NO:32、 SEQ ID NO:35、 SEQ ID NO:37、 SEQ ID NO:40、 SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:45。
全文摘要
本發明涉及玉米受氮調節(例如上調)的核酸分子、由這些核酸分子編碼的蛋白質或多肽以及這些核酸分子的啟動子。本發明涉及具有玉米受氮調節核酸分子的核酸構建體，以及具有所述核酸構建體的表達系統、宿主細胞、植物和植物種子。本發明還涉及通過培育轉基因植物或由所述構建體轉化的轉基因種子生長的植物，在植物中表達所述受氮調節核酸分子的方法。本發明進一步涉及到分離的DNA啟動子，其可用于指導分離核酸在植物中受氮調節的表達。
文檔編號A01H1/00GK101631454SQ200780051119
公開日2010年1月20日 申請日期2007年10月22日 優先權日2006年12月8日
發明者P·S·施納布爾, S·達什 申請人:衣阿華州立大學研究基金公司