專利名稱：：櫛孔扇貝g-型溶菌酶基因多態性標記篩選及其輔助育種方法
技術領域：
：本發明屬于水產生物
技術領域：
中的貝類分子標記輔助育種技術，是一種能在貝類抗病品種培育中應用的貝類抗病相關基因標記及其輔助育種方法。
背景技術：
：我國的扇貝養殖業在經過最初階段的蓬勃發展以后，逐漸暴露出了許多亟待解決的問題。長期的近親繁育、累代養殖導致了近交衰退，使得櫛孔扇貝生長緩慢、抗逆性降低。再加上病害肆虐、環境惡化等因素，扇貝養殖業經常發生大規模死亡事件，造成巨大經濟損失。因此，加快育種核心前沿技術的研究和抗逆優良品種的選育己成為保障扇貝養殖業持續發展的關鍵。但由于目前國內外對貝類抗病機理及抗病功能基因的研究較少，缺乏抗病相關的分子標記，導致貝類抗病品種培育的研究進展緩慢，很大程度上制約了扇貝養殖業穩定、健康和可持續發展。貝類機體免疫防御反應分為細胞免疫和體液免疫。參與體液免疫的因子很多，溶菌酶是其中十分重要的一員。溶菌酶是一類具有殺菌作用和免疫功能的效應分子，在機體的天然免疫中發揮重要作用(ChengandRodrick,1975)。自1999年報道了第一種貝類溶菌酶基因序列后，先后從冰島扇貝、貽貝、美洲牡蠣和櫛孔扇貝等貝類中獲得了溶菌酶基因的全長序列。研究表明，溶菌酶具有廣譜的抗菌效應，參與機體多種免疫反應，能改善和增強巨噬細胞的吞噬能力和消化功能(Biggaretal.,1977);并在溶菌過程中形成一個水解體系，破壞和消除侵入體內的異物，從而實現機體的免疫防御(ChengandRodrick，1975;Chengetal.,1975)。研究還發現，溶菌酶能與帶負電荷的病毒蛋白直接作用形成復合物，使侵入體內的病毒失活。此外，溶菌酶可誘導調節機體其它免疫因子的合成與分泌，協同其它免疫因子(抗菌肽等)進行免疫防御(Chalketal.，1994;Patrzykatetal.，2001)。對于缺少特異性免疫的無脊椎動物來說，溶菌酶是其免疫體系中非常重要的一個環節(Lee,2000;Sotelo-Mundo,2003);而對于水生無脊椎動物而言，由于其生存環境中富含各種各樣的潛在病原，溶菌酶的免疫防御功能就顯得尤為重要。目前研究表明，在魚類、昆蟲等多種物種中溶菌酶表達水平的升高與免疫力的增強密切相關(CaipangCM,2007;ChengAC,2008)，但其多態性與貝類抗病力強弱之間的關系研究仍未見報道。
發明內容-本發明的目的是篩選出櫛孔扇貝抗病相關的G-型溶菌酶基因標記，建立相應的櫛孔扇貝分子標記輔,助育種方法，為梓孔扇貝抗病品種培育提供基因標記和技術方法。本發明的技術內容為一、櫛孔扇貝抗病相關G-型溶菌酶基因標記，包括1、櫛孔扇貝G-型溶菌酶基因啟動區部分序列的克隆；2、抗病群體和敏感群體的制備；3、抗病相關G-型溶菌酶基因標記的篩選；4、攜帶抗病相關基因標記個體的快速篩査；二、櫛孔扇貝抗病相關G-型溶菌酶基因標記輔助育種方法。一、櫛孔扇貝抗病相關G-型溶菌酶基因標記，包括1、櫛孔扇貝G-型溶菌酶基因啟動區部分序列的克隆；2、抗病群體和敏感群體的制備；3、抗病相關G-型溶菌酶基因標記的篩選；4、攜帶抗病相關基因標記個體的快速篩查。1、櫛孔扇貝G-型溶菌酶基因啟動區部分序列的克隆參照分子克隆所述方法從櫛孔扇貝閉殼肌中提取總DNA;根據已知的G-型溶菌酶基因序列在其啟動子區設計引物，克隆得到一段762堿基的DNA序列，連入T載體后進行測序，獲得其核苷酸序列。2、抗病群體和敏感群體的制備采用人工感染途徑獲得抗病群體和敏感群體；即從不同海區和養殖場收集扇貝個體之后，用病原菌浸泡感染，根據死亡時間判斷對病原菌感染抵抗能力，將扇貝分為抗病群體和敏感群體。3、抗病相關G-型溶菌酶基因標記的篩選對5個個體的IO個克隆進行了測序，發現了10處多態性位點；PCR擴增42個敏感個體和40個抗病個體的G-型溶菌酶啟動區序列后，針對-754TATCTCGATCAGG插入/缺失(I/D)及-391A/G轉換分別選用TaqI和HapII對PCR產物進行酶切，聚丙烯酰胺凝膠電泳后，各發現兩種基因型，-754II，-754ID，-391M和-391AG;其中-754ID和_754II個體在抗病群體和敏感群體中出現的頻率無顯著差異,而-391AA個體在敏感群體中出現的頻率顯著高于抗病群體，-391AG個體在抗病群體中出現的頻率顯著高于敏感群體。因此，-391AA被認為是疾病敏感相關的G-型溶菌酶基因標記，而-391AG被認為是抗病相關的G-型溶菌酶基因標記。4、攜帶抗病相關基因標記個體的快速篩査取櫛孔扇貝全血lu1作為模版，PCR擴增G-型溶菌酶基因啟動區序列，用H印II對產物進行酶切，聚丙烯酰胺凝膠電泳分型后，參照圖譜3-B選擇-391AG個體作為抗病個體。二、櫛孔扇貝抗病相關G-型溶菌酶基因標記輔助育種方法以在抗病群體中高頻出現的G-型溶菌酶基因型作為抗病相關G-型溶菌酶基因標記。將攜帶這種抗病基因標記的櫛孔扇貝進行繁殖，培育后代，克隆得到后代中的G-型溶菌酶基因啟動區序列，研究其多態性；同時進行病原微生物感染實驗，研究抗病相關G-型溶菌酶基因標記的遺傳規律及其與櫛孔扇貝抗病力的關系，從中篩選出既含有抗病G-型溶菌酶基因標記，抗病力又顯著提高的貝苗進行多代繁殖和培育后即可建立抗病新品種。本發明與已有技術相比其特點為本發明采用功能基因組技術，以櫛孔扇貝為材料首次發掘了我國養殖貝類抗病相關G-型溶菌酶基因標記，初步建立了櫛孔扇貝抗病相關G-型溶菌酶基因標記輔助育種技術，該技術具有操作簡便快捷、選育效率高、周期短等特點，為貝類抗病品種的培育開辟了新的分子育種技術途徑，對養殖貝類抗病品種的選育具有重要理論意義和應用價值。圖l:櫛孔扇貝G-型溶菌酶基因啟動區部分序列圖2:櫛孔扇貝G-型溶菌酶基因啟動區多態性位點圖3:櫛孔扇貝G-型溶菌酶基因不同基因型的酶切圖譜圖4:櫛孔扇貝抗病群體及敏感群體中G-型溶菌酶不同基因型的分布頻率以及相應的卡方檢驗具體實施例方式下面以櫛孔扇貝抗病相關G-型溶菌酶基因標記的篩選及其輔助育種技術的建立為例，對本發明的技術內容進行詳細說明。一、櫛孔扇貝抗病相關G-型溶菌酶基因標記，包括1、櫛孔扇貝G-型溶菌酶基因啟動區部分序列的克隆；2、抗病群體和敏感群體的制備；3、櫛孔扇貝抗病相關G-型溶菌酶基因標記的篩選；4、攜帶抗病相關基因標記個體的快速篩査。1、櫛孔扇貝G-型溶菌酶基因啟動區部分序列的克隆參照分子克隆所述方法從梓孔扇貝閉殼肌中提取總DNA;根據已知的G-型溶菌酶基因序列在啟動區設計引物CFLyspl(5'-GCTGAGTAGACTGGAACAAGCGGMTGA-3')和CFLysp2(5'-MGACGAGTGAAGGCCGGGGAGTAGGT-3')，克隆得到一段762堿基的DNA序列，連入T載體后進行測序，獲得其核苷酸序列(圖l)。2、抗病群體和敏感群體的制備采用人工感染途徑獲得抗病群體和敏感群體；即從不同海區和養殖場收集扇貝個體，用鰻弧菌浸泡感染，根據死亡時間判斷扇貝對鰻弧菌感染的抵抗能力，將扇貝分為抗病群體和敏感群體。3、櫛孔扇貝抗病相關G-型溶菌酶基因標記的篩選對5個個體的10個克隆進行了測序，發現了10處多態性位點(圖2);PCR擴增42個敏感個體和40個抗病個體的G-型溶菌酶啟動區序列后，針對-754TATCTCGATCAGG插入/缺失及-391A/G分別選用TaqI和HapII對PCR產物進行酶切。對于-754插入型等位基因，TaqI酶切后會產生大小分別為36,37,43，80，147,419bp的6個片段，而對于-754缺失型等位基因則會產生大小分別為43，60,80，147,419bp的5個片段。用HapII酶切之后，-391A型等位基因產生長度為16,79，102，565bp的4個片段，而-391G型等位基因則產生長度為16,79,102，240,325bp的5個片段。酶切產物經鄉聚丙烯酰胺凝膠電泳分型，在這兩處位點各發現兩種基因型，-754II，-754ID,-391AA和-391AG(圖3)。抗病群體和敏感群體中不同基因型出現的頻率見圖4。經卡方檢驗分析后發現，-754ID和-75411個體在抗病群體和敏感群體中出現的頻率無顯著差異，而-391AA個體在敏感群體中出現的頻率顯著高于抗病群體，-391AG個體在抗病群體中出現的頻率顯著高于敏感群體(表l)。因此，-391M被認為是疾病敏感相關的G-型溶菌酶基因標記，而-391AG被認為是抗病相關的G-型溶菌酶基因標記。表1:梓孔扇貝G-型溶菌酶不同基因型在抗病群體和敏感群體中分布頻率的卡方檢驗<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>4、攜帶抗病相關基因標記個體的快速篩査:取櫛孔扇貝全血1H1作為模版，以CFLyspl和CFLysp2為引物PCR擴增G-型溶菌酶啟動區序列，用HapII對產物進行酶切，聚丙烯酰胺凝膠電泳分型后，參照圖譜3-B選擇-391AG個體作為抗病個體。二、櫛孔扇貝抗病相關G-型溶菌酶基因標記輔助育種方法以在抗病群體中高頻出現的G-型溶菌酶基因型-391AG作為抗病相關G-型溶菌酶基因標記。將攜帶這種抗病相關基因標記的櫛孔扇貝進行繁殖，培育后代，克隆獲得后代中的G-型溶菌酶基因，研究其多態性；同時進行病原微生物感染實驗，研究抗病相關G-型溶菌酶基因標記的遺傳規律及其與扇貝抗病力的關系，從中篩選出既含有抗病相關G-型溶菌酶基因標記，抗病力又提高的貝苗，進行多代繁殖和培育后即可建立抗病優良品種。序列表<110>中國科學院海洋研究所<120〉櫛孔扇貝G-型溶菌酶基因多態性標記篩選及其輔助育種方法<140>〈141〉2008-04-02<薩1〈170〉Patentlnversion3.2<210>1<211>762<212>腿<213>梓孔扇貝(Chlamysfarreri)〈400>1gctgagtagactggaacsagcggeiatgaagtstctcgatc3gggat8c33sacscagtgc60cttgccgtgactcgaacccggaactcttctgtcacatgcttagcgtcctaccattcgact120agcgcacattgagctagtcattttattgaaaatctgtcttaggtacataattaagttaag180tttatttctggatcaggactattaaaaaacagacctctataccagactccaataaataca240aaataaataataaagttctttgagtaccccttacattaatctgttttgggatgtttgtat300ctctatgtgcttctgcatatggatctgtacgtaactttttgttaggtttttaccactact360tgttttcatttacagctagttacgagttaaatgcatgctagtccgggcaaacaggagtta420ttccccctcgcaatatcaaacctcttttcatttaaattatgaagttaagttattgagatt480tattaacccctgtgatggttgaatEitgaaataaatatgaaat犯atgcatttgtcgaata540tcacattggcttatgtggaagttaaactaaattscgtatatattatcataatttcacgat600tatgc犯tgatttttgtgtttcctgacagtagtgaataatgaccggacacgt朋gcaatei660caattcgtgactgaccaaactcgaccttagtgtaaataattctaaatataaatatttatc720tgtctaagataagagacctactccccggccttcactcgtctt76權利要求1、一種櫛孔扇貝抗病相關G-型溶菌酶基因標記，其特征在于它的技術內容包括以下四個方面1)櫛孔扇貝G-型溶菌酶基因啟動區部分序列的克隆；2)抗病群體和敏感群體的制備；3)抗病相關G-型溶菌酶基因標記的篩選；4)攜帶抗病相關基因標記個體的快速篩查。1)櫛孔扇貝G-型溶菌酶基因啟動區部分序列的克隆參照分子克隆所述方法從櫛孔扇貝閉殼肌中提取總DNA；根據已知的G-型溶菌酶基因序列在其啟動子區設計引物，克隆得到一段762個堿基的DNA序列，連入T載體后進行測序，獲得其核苷酸序列。2)抗病群體和敏感群體的制備采用人工感染的方法獲得抗病群體和敏感群體；即從不同海區和養殖場收集櫛孔扇貝個體，用病原菌浸泡感染，根據死亡時間判斷扇貝對病原菌感染抵抗能力，將扇貝分為抗病群體和敏感群體。3)抗病相關G-型溶菌酶基因標記的篩選對來自5個個體的10個克隆進行了測序，發現了10處多態性位點；PCR擴增42個敏感個體和40個抗病個體的G-型溶菌酶啟動區序列后，針對-754TATCTCGATCAGG插入/缺失(I/D)及-391A/G轉換分別選用TaqI和HapII對PCR產物進行酶切，聚丙烯酰胺凝膠電泳后，各發現兩種基因型，-754II，-754ID，-391AA和-391AG；其中-754ID和-754II個體在抗病群體和敏感群體中出現的頻率無顯著差別，而-391AA個體在敏感群體中出現的頻率顯著高于抗病群體，-391AG個體在抗病群體中出現的頻率顯著高于敏感群體。因此，將-391AA作為疾病敏感相關的G-型溶菌酶基因標記，而將-391AG作為抗病相關的G-型溶菌酶基因標記。4)攜帶抗病相關基因標記個體的快速篩查取櫛孔扇貝個體全血1μl作為模版，PCR擴增G-型溶菌酶基因啟動區序列，用HapII對產物進行酶切，聚丙烯酰胺凝膠電泳分型后，選擇-391AG個體作為抗病個體。2、一種G-型溶菌酶基因輔助育種方法，其特征為以在抗病群體中高頻出現的G-型溶菌酶基因型作為抗病相關G-型溶菌酶基因標記；將攜帶這種抗病相關基因標記的櫛孔扇貝進行繁殖，培育后代，克隆得到后代中的G-型溶菌酶基因啟動區序列，研究其多態性；同時進行病原微生物感染實驗，研究抗病相關G-型溶菌酶基因標記的遺傳規律及其與梓孔扇貝抗病力的關系，從中篩選出既帶有抗病相關G-型溶菌酶基因標記，抗病力又顯著提高的貝苗進行多代繁殖和培育后即可建立抗病新品種。全文摘要本發明是一種櫛孔扇貝G-型溶菌酶基因多態性標記篩選及其輔助育種方法，屬于水產生物
技術領域：
中的貝類分子標記輔助育種技術，其主要內容包括櫛孔扇貝G-型溶菌酶基因啟動區部分序列的克隆，抗病和敏感群體的制備，抗病相關G-型溶菌酶基因標記的篩選，抗病個體的快速篩查以及基因標記輔助育種技術的建立。本發明克隆了櫛孔扇貝G-型溶菌酶基因的啟動區序列，并篩選了其多態性位點。其中-391AG個體在抗病群體中出現的頻率顯著高于敏感群體，因此，以-391AG作為櫛孔扇貝抗病相關的G-型溶菌酶基因標記，建立了抗病相關基因標記輔助育種方法。本發明具有針對性強、選育效率高、操作簡便快捷等特點，適用于貝類抗病相關標記的篩選和抗病優良品種的選育。文檔編號A01K67/00GK101255477SQ200810015048公開日2008年9月3日申請日期2008年4月2日優先權日2008年4月2日發明者宋林生,凌李,趙建民申請人:中國科學院海洋研究所