專利名稱：羅非魚耐鹽育種技術的制作方法
技術領域：
本發明屬于水產養殖和魚類育種領域；更具體的，本發明涉及一種適合海 水養殖的魚類的育種和制種方法。
背景技術：
目前在中國的咸、海水水域中，養殖生產都存在一些亟待解決的問題，比 如，海水網箱養殖，缺少適合的養殖對象和養殖模式，現有的養殖對象幾乎全 部是肉食性魚類，苗種來源困難，餌料不易解決，不僅養殖成本高昂，養殖風 險大，而且由于大量、長期投喂冰鮮雜魚也容易產生生態和環境問題；而中西 部咸水養殖的主要問題是缺乏優良的養殖對象，現有的魚類，大多生長緩慢、 經濟價值低。
"羅非"魚類原產非洲，屬熱帶性魚類。其中"尼羅羅非"魚因個體大、 肉厚色白、質嫩刺少、富有彈性、細膩味美，含有豐富的蛋白質、鈣、磷、鐵 和維生素等營養成分，同時含有多種不飽和脂肪酸等特點，是老少皆宜的健康 食品，符合人類追求健康食品的要求。隨著世界鱈魚和野生鮭鱒魚類資源的減 少，美國、歐洲、日本、韓國白魚肉市場正在尋找新的替代品種。羅非魚因其 具有生長速度快、抗病能力強、飼料易解決、養殖周期短、易加工保鮮、生產 成本低、營養價值高，市場前景廣等特點，成為聯合國糧農組織向世界推薦的
最有發展前景的水產優良養殖對象之一。同時由于肉質潔白而少刺，而被稱為 "白色三文魚"，可替代短缺的鱈魚等海洋優質魚，成為人類的"21世紀的魚"。 目前世界"羅非"魚總產量逾200萬噸。其中養殖產量約占3/4，而"尼羅羅 非"魚占有90%以上，但其耐鹽性不強，不能再海水中養殖，基本上局限于在 淡水水體中養殖生產。
由于淡水養殖存在水域面積和水資源有限、水質易于受到環境污染等問 題，每年獲得的魚產量難以滿足市場的需求；而海洋的面積遠遠大于淡水的面 積，且污染小。此外，淡水養殖的魚類有時還會存在土腥味。因此開發海水養 殖是非常有必要的，特別是利用海水來養殖一些經濟魚類。然而，使一些常規在淡水中養殖的魚在海水中生長繁殖并非是容易的事情。
因此，目前迫切需要突破"尼羅羅非"魚在鹽度條件下不能生長繁殖的限 制，開發一種適合于在海水中養殖的、抗逆性強的、且具有"尼羅羅非"魚的 生長快速、肉質優美、營養價值高等優點的魚種，從而為海水魚類養殖提供新 的優良品種。
發明內容
本發明的目的在于提供一種在海水中生長速度較快、抗逆性強、肉質好的 羅非魚雜交種的制種方法，解決"尼羅羅非"魚不能在較高鹽度海水中養殖的 問題。
因此，在本發明提供一種適合海水養殖的魚類的育種方法，所述方法包括 如下步驟
(1) 將"尼羅羅非"魚與"薩羅"魚作為雜交組合；
(2) 從成熟的雌性親魚取卵，從成熟的雄性親魚取精，將卵子和精子在氯 化鈉溶液中混勻，其中氯化鈉的濃度按照重量體積比在0.65 1.5%，從而獲得 雜種受精卵；和
(3) 孵育(2)獲得的受精卵，從而得到雜交魚，所述雜交魚是適合海水養 殖的魚類。
在另一優選例中，所述的雜交魚能在鹽度為0 32的水中生長。 在另一優選例中，所述的氯化鈉溶液中氯化鈉的濃度按照重量體積比在 0.65 0,9%。
在另一優選例中，所述的氯化鈉溶液是充分曝氣的氯化鈉溶液。 在另一優選例中，步驟(1)中，所述的雜交包括正交或反交，所述的正交
為"尼羅羅非"魚早x "薩羅"魚-，所述的反交為"薩羅"魚早x "尼羅羅
非"魚3。
在另一優選例中，采用正交的方式進行雜交。
在另一優選例中，所述的"尼羅羅非"魚是"吉富尼羅羅非"魚；更佳地， 所述的"尼羅羅非"魚是"新吉富尼羅羅非"魚。
在另一優選例中，步驟(1)中，選擇年齡為2 4齡的親魚；其中，"尼 羅羅非"魚體重不低于500g，"薩羅"魚體重不低于200g。在另一優選例中，雄魚選擇有明顯的婚姻色，體色鮮艷，尾鰭變紅，腹部 粉紅，且輕壓腹部能擠出清白色精液的魚。
在另一優選例中，雌魚選擇后腹部飽滿、柔軟，生殖乳突大而突出，孔圍 呈現紅暈的魚。
在另一優選例中，步驟(1)中，其中雌性親魚與雄性親魚的比例是2: 1左右。
在另一優選例中，步驟(1)中，卵子和精子混勻的時間是0.5 10分鐘； 較佳地1 3分鐘。
在另一優選例中，步驟(1)中，在取卵或取精前，對雌性親魚和/或雄性 親魚注射催產素。
在另一優選例中，所述的催產素包括絨毛膜促性腺激素(HCG)和/或促
黃體生成素釋放激素類似物(LRH-A2)。較佳的，絨毛膜促性腺激素單次注射 的劑量為1500 2500單位(優選2000單位)/Kg魚體重、促黃體釋放激素類似 物單次注射的劑量為4 6微克/Kg魚體重。
在另一優選例中，母本親魚采用一或兩次注射催產素，父本親魚采用一次 注射催產素。
在另一優選例中，步驟(2)中，包括將受精卵在魚類孵化器中進行流水 孵化，水溫保持在26 32'C(優選26-30°C)，調節孵化器中水流至受精卵能上 下翻動。
在另一優選例中，每隔0.5-1小時，察看孵化器內孵化情況，除去死亡的 卵子。
在另一優選例中，所述的"尼羅羅非"魚滿足以下至少一個條件
(a) 身體兩側有與體軸垂直、平行的條紋7 9條；和/或
(b) 尾鰭上垂直或平行排列的斑點條紋13條以上；和/或
(c) 體長與體高的比例不低于2.18;和/或
(d) 背鰭D: XV X VII'12 14;禾口/或
(e) 臀鰭A: UI'8 10;和/或
(f) 上側線鱗數13 26;和/或
(g) 下側線鱗數13 20;和/或
(h) 第一鰓弓外側鰓耙數27 31;和/或
(i) 生長快在3000 4000尾/畝密度下，池塘飼養6個月，體重達600
7謂克；
或者，所述的"薩羅"魚滿足以下至少一個條件
(a) 體色灰白，腹側珍珠藍，背部橘黃或金黃，成體頰部有一顯著黑斑； 禾口/或
(b) 頭長與全長的比例為0.27 0.29;禾口/或
(c) 背鰭D: XV XVI 10 12;禾口/或
(d) 臀鰭A: III 8 10;禾口/或
(e) 側線上鱗3 4;和/或
(f) 上側線鱗數18 21;和/或
(g) 下側線鱗數10 12;和/或
(h) 在20 35鹽度的海水中正常生長。
在另一優選例中，步驟(1)中，所述的成熟親魚滿足以下條件所述成熟親
魚為2 4年齡，"尼羅羅非"魚體重不低于500g，"薩羅"魚體重不低于200g。 其中，D是背鰭的代號，A是臀鰭的代號，羅馬數字(如XV X VII)代表 硬棘數量，阿拉伯數字(如12 14)代表軟鰭條數量。
在另一優選例中，還包括步驟(3):
對步驟(2)獲得的雜交魚進行培育和繁殖(可正常自然繁殖)，從而獲得遺傳 穩定的、可育的后代魚，所述雜交魚能在鹽度為0 32的水中生長。
較佳的，所述的雜交魚能在鹽度為0 32的水中生長；更佳的，所述的雜 交魚能在鹽度為10 25的水中生長；如生長于鹽度為20 25的海水中。
在另一優選例中，所述的方法包括
(i) 選用"新吉富尼羅羅非"魚早X "薩羅"魚》作為雜交組合；
(ii) 在水溫26 32。C時，在步驟(i)中選擇后腹部飽滿、柔軟，生殖孔突 起，體格健壯，體形較好的"新吉富尼羅羅非"魚早，挑選輕按腹部即有清白 色精液流出的"薩羅"魚4，按2:1的雌雄比例，放入網箱中，充氣以保證溶 氧充足；
(iii) 采用催產素絨毛膜促性腺激素和促黃體生成素釋放激素類似物注射 親魚；"新吉富尼羅羅非"魚早釆用1 2次注射，"薩羅"魚4采用1次注 射；
(iv) 將步驟(ii)注射催產激素后的親魚放入網箱；當水溫在26 3(TC， 在催產素效應時間20 30小時后；捕起雌性"新吉富尼羅羅非"，揩干其身體上的水分，將成熟卵子擠入潔凈干燥的容器中；隨即取出雄性"薩羅"魚， 揩干其身體上水分，擠出精液至剛排出的卵上；用快速拌勻卵和精，再倒入已 充分曝氣的氯化鈉溶液(優選氯化鈉濃度在0.65 0.9%)，使卵子受精1 3分 鐘；
(v) 將受精卵倒入孵化器中進行流水孵化；孵化采用充分曝氣的水，水溫 保持在26 3(TC，調節孵化器中水流至卵能上下翻動；
(vi) 在孵化過程中，每隔0.5 1小時，查看孵化器里的情況，將死亡的 卵吸去；和
(vii) 孵化結束，獲得適合海水養殖的魚類。
本發明的其它方面由于本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而 易見的。
圖1顯示了不同鹽度下雜交魚與父本的絕對增重率比較。
圖2顯示了 "新吉富"羅非魚？ X "薩羅"魚^的雜交Fl代魚的形態特征。
具體實施例方式
為了開發適合于在海水中生長和繁育的魚類，本發明人經過了長期而反復 的試驗，意外地發現"薩羅"魚特別適合作為與"尼羅羅非"魚遠緣雜交的對 象，其雜交后代可育，不僅具有生長速度快、抗逆性強、肉質好的特性，而且 還能夠在海水中正常生長。并且，本發明人在長期的研究過程中積累了豐富的 經驗，優化了 "尼羅羅非"魚與"薩羅"魚的雜交后代的培育方法，在此基礎 上完成了本發明。
"薩羅"魚(&/^/^ocfow we/a"o^ero")，與"尼羅羅非"魚同為艫形目 (i^c!/orme力，麗魚科(Cz'cWWae)，但為不同屬。"尼羅羅非"魚歸"羅非"魚 屬(Oeoc&om，而"薩羅"魚歸"薩羅"魚屬(SaraAerocto")，它們的親緣
關系較遠。
"新吉富"羅非魚是尼羅羅非魚(Oeoc/iram" m7o"CM)的選育良種，其 特點是(1)生長快，抗逆性強，規格齊；(2)體型高，出肉率髙；(3)尾鰭條
9紋典型個體比例高，易識別；(4)遺傳純度高，具可檢測的特有分子遺傳標記。但其耐鹽性不強，不能在海水中養殖。所述的"新吉富"羅非魚可簡稱為"新吉富"魚。
"薩羅"魚具有較強的耐鹽性，據報道，在鹽度為35時可正常繁殖。然而，這種魚盡管耐鹽性良好，但因其生長速度慢，養殖價值并不大。
除非另外解釋或說明，本發明中涉及的術語與本領域常用的術語相同，例如，所述的"親本"和"親魚"可以互相交換使用。所述"親本"或"親魚"是指"父本"或"母本"。所述的"雌魚"即為"母本"，所述的"雄魚"即為"父本"。
本發明中，所述的"遠緣雜交"是指雜交親本之間的親緣關系較遠，超過種內關系的雜交。遠緣雜交可分為種間雜交、屬間雜交、亞科間雜交等，通常親緣關系越遠的雜交成功率越低，普遍存在受精率和孵化率極低、后代不能正常發育和繁育等問題。找到合適的、理想的遠緣雜交對象是遠緣雜交技術的難點，通過遠緣雜交獲得可正常生長，正常繁殖的后代尤為困難。"尼羅羅非"魚與"薩羅"魚的雜交組合為屬間的"遠緣雜交"。
本發明中，"母本"也可以以符號"早"表示；"父本"也可以以符號"<T，表示。
本發明中，所述的"雜交"包括"正交"或"反交"，所述的"正交"為"尼羅羅非"魚早X "薩羅"魚^,正交獲得的后代也可稱為"尼薩"魚；所述的"反交為"薩羅"魚罕X "尼羅羅非"魚<^,"反交"的后代也可稱為"薩尼"魚。
本發明中，水的鹽度可以釆用本領域常規測量鹽度的方法進行測定，本發
明沒有特別的限制。以往，鹽度用千分比(％。)，如"30%。"，轉換為目前的表示方式，為"鹽度30"，或"30個鹽度"。
不同屬的兩種魚由于親緣關系較遠，因此要成功地獲得它們的雜交后代存在諸多的困難，例如親本雌魚與親本雄魚合適的成熟度的掌握，人工授精時易于出現假受精現象，受精成功率極低，子代畸形率高等。因此，要得到性狀良好的"薩羅"魚與"尼羅羅非"魚子代魚，需要優化各種雜交條件，從而提高雜交的成功率。
因此，本發明人在經過長期而反復的試驗研究之后，成功地找到了一種適合海水養殖的魚類的育種方法，所述方法包括如下步驟(1)將"尼羅羅非"魚與"薩羅"魚作為雜交組合，從成熟的雌性親魚取卵，從成熟的雄性親魚取精，將卵和精混勻，從而獲得雜種受精卵；和(2)孵育(1)獲得的受精卵，從而得到雜交魚。
在自然情況下，"尼羅羅非"魚通過雌性魚口含的方式孵卵，"薩羅"魚通過雄性魚口含的方式孵卵；并且，雌性親魚的卵在自然情況下是分批成熟的；因此，通過讓魚自行孵卵的方式可操作性極差，極難控制。考慮到上述因素以及遠緣雜交的困難性，本發明人選擇了人工授精的方式來制備受精卵，也即采用離體方式制備受精卵并孵育魚苗，而并沒有選擇通過親本之間自然交配培育后代雜交魚。
作為本發明的優選方式，所述的"尼羅羅非"魚是"新吉富"品種。在親本的選擇上，本發明人發現，選擇體質健壯、色澤正常、體厚背高，年齡為2 4齡的親魚，"尼羅羅非"魚體重不低于500g，"薩羅"魚體重不低于200g，可以獲得較好的卵子和精子，在人工授精后，獲得的受精卵質量較
高，從而可提高雜交的成功率。
所述的雜交可以是正交或反交，所述的正交為"尼羅羅非"魚早X "薩羅"魚4，所述的反交為"薩羅"魚早X "尼羅羅非"魚^。本發明人通過檢測正交后代和反交后代的生長情況、繁殖情況發現，反交后代魚的生長速度不如正交后代魚，且繁殖能力也不如正交后代魚。因此，作為本發明的優選方式，采用正交的方式進行雜交。
作為本發明的優選方式，用于雜交取精或取卵時，選擇的雌性親魚與雄性親魚的比例在2 : 1左右是合適的，可以得到相對于卵子或精子數而言較高比例的受精卵，該比例也是最為經濟的。
作為本發明的優選方式，步驟(1)中，在取卵或取精前，對雌性親魚和/
或雄性親魚注射催產素。對母本注射催產素可以促進卵子的成熟和同步排卵；
對父本注射催產素可以促進精子的產生。
所述的催產素優選的是絨毛膜促性腺激素(HCG)和/或促黃體生成素釋放激素類似物(LRH-A2)。較佳的，絨毛膜促性腺激素單次注射的劑量為1500 2500單位(優選2000單位)/Kg魚體重、促黃體釋放激素類似物單次注射的劑量為4 6微克/Kg魚體重。
在分別獲得了卵子和精子后，可將卵子和精子在適當的介質中混勻，從而
11促使卵子受精，這個步驟是人工授精技術中非常關鍵的，決定了雜交的成敗。經過了無數次的試驗后，本發明人意外地發現，在取得雌性親魚與雄性親魚的卵子和精子后，將它們置于氯化鈉溶液中受精可很有效地提高雜交的成功率，成功率可提高30%以上。
優選地，所述的氯化鈉溶液中氯化鈉的濃度按照重量體積比在0.65 1.5%范圍內，更佳的氯化鈉的濃度是0.65 0.9%范圍內。適合濃度的氯化鈉溶液為卵子的受精提供了良好的條件(如適當的滲透壓)，從而有利于提髙受精成功率，降低受精卵死亡率，降低雜交子代的畸形率。
更優地，所述的氯化鈉溶液是經過充分曝氣的氯化鈉溶液，如曝氣1 2天。卵受精的時間為0.5 10分鐘；優選1 3分鐘。
所獲得的受精卵可在常規的魚類孵化器中進行孵化。在進行孵化時，水溫條件的選擇對于成功獲得魚苗也是較為重要的。作為本發明的優選方式，較佳的水溫條件是26 32'C，優選26-30'C，如27'C， 28°C。在所述的水溫條件下，受精卵可較好地發育和孵化，有效減少受精卵夭折的可能性，減少孵化的畸形率，從而可獲得盡可能多的魚苗。
本發明人發現，將原本口孵的卵子進行離體孵化，保持孵化器中一定的水流動也是非常有利于受精卵的孵化的；優選地，調節孵化器中水流至受精卵能緩慢地上下翻動。在孵化過程中，及時地去除孵化器內出現的死亡卵子。在26 3(TC孵化水溫條件下，通常在受精孵化5 7天(如約6天)后，受精卵可形成魚苗。
獲得的魚苗在平游后即可入池，入池后3天卵黃囊未吸收盡，不喂食；第4天開始，喂飼適量的蛋黃；每3天加量喂食蛋黃，從而使得魚苗良好地生長發育；在使用蛋黃喂食8 12天后，改用常規的粉狀飼料進行喂飼，每天喂4 7次。
在獲得了F1代雜交魚后，還包括步驟對獲得的雜交魚進行培育、養成，通過正常的自然交配繁殖，以批量地生產F2代雜交魚，從而滿足養殖生產的需要。
本發明人檢測了雜交后代的平均成活時間(Mean survival time, MST)，發現在鹽度為32的海水中，試驗魚的平均成活時間大于1小時。將健康試驗魚從淡水直接移入鹽度為32的海水后，魚的50%成活時間(Median survival dme，ST5())大于3小時。而在鹽度為20 25條件下，正、反交魚均能成活和生長。
12本發明獲得的雜交魚能在鹽度為0 32的水中生長；較佳的，所述的雜交魚能在鹽度為0 32的水中生長；更佳的，所述的雜交魚能在鹽度為10 25的
水中生長；如可在鹽度為20 25的海水中正常生長。
本發明的方法獲得的雜交魚具有保留了親本的優勢、兼具優良生長性能和耐鹽性能、能在海水中正常養殖。從性狀特征來看，本發明的方法獲得的雜交
魚形似"薩羅"魚，但有部分可數性狀與"新吉富"魚相似；在遺傳學方面，雜交魚既繼承了 "薩羅"魚的遺傳物質，又繼承了 "新吉富"魚的遺傳物質。并且，所述的雜交魚的后代性狀穩定，具有良好的耐鹽性，可正常繁育，且生
長速度較快，肉質鮮美。同時，本發明的方法獲得的雜交魚在鹽度為20度的條件下的生長速度是父本"薩羅"魚的4倍多，耐鹽性能較其母本"新吉富"魚(在20鹽度下不能存活)有了極大的提高，且肉質似海魚，無泥腥味。
本發明人將獲得的雜交后代稱為"尼薩"魚(正交)或"薩尼"魚(反交)，也稱為"吉麗羅非魚"或"吉麗"魚。
本發明的主要優點在于
(1) 本發明意外地找到了一組適合于屬間遠緣雜交的對象，以生產速度快的"尼羅羅非"魚和耐鹽性強的"薩羅"魚和為主要遺傳材料，通過遠緣雜交，培育出了耐鹽性和生長速度兼優的具有雜交優勢的羅非魚新品種一一 "吉麗"羅非魚。
(2) 本發明優化了 "尼羅羅非"魚和"薩羅"魚人工授精技術以及受精卵離體孵育技術，從而大大提高了獲得雜交后代的成功率，為大規模養殖該魚類雜交新品種提供了良好的條件。
(3) 在海水中養殖的"吉麗"羅非魚，不僅沒有淡水養殖羅非魚常有的土腥味，而且肉質緊密富彈性，品質好，極具商業應用價值。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。除非另行定義，文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。實施例1.雌雄雙親群體的選擇
(1) 新吉富羅非魚種質特征
① 遺傳型特征
"新吉富"群體的遺傳多樣性為10.5±0.5%，平均雜合度不大于0.027;個體間平均遺傳相似度大于92.7%。
② 表型特征
(a) 成魚身體兩側有與體軸垂直、平行的點狀條帶7 9條。
(b) 背鰭、臀鰭及尾鰭上均有黑白相間的斑點，在背、臀鰭上呈斜向排列，尾鰭上的斑點呈線條狀垂直、平行排列，成魚在13條以上；性成熟雄魚的尾鰭及背鰭邊緣呈紅色。背鰭邊緣黑色；幼魚階段背鰭有一個大而顯著的斑點，以后逐漸消失；體型較高；
(c) 體長與體高的比例不低于2.18;
(d) 背鰭D: XV X VII'12 14;
(e) 臀鰭A: IH'8 10;禾口/或
(f) 上側線鱗數13 26;
(g) 下側線鱗數13 20;
(h) 第一鰓弓外側鰓耙數27 31。
(2) 薩羅魚種質特征
(a) 體色灰白，腹側珍珠藍，背部橘黃或金黃，成體頰部有一顯著黑斑；
(b) 頭長與全長的比例為0.27 0.29;
(c) 背鰭D: XV XVI 10 12;
(d) 臀鰭A: III 8 10;
(e) 側線上鱗3 4;
(f) 上側線鱗數18 21;
(g) 下側線鱗數10 12。
(3) 配種親魚的個體選擇
選擇體質健壯、色澤正常、體厚背高，年齡為2 4齡的親魚。
雄魚腹部后方有兩個開口，前為肛門，后為泄殖孔。
雌魚在腹部后方緊鄰著有3個開口，依次為肛門、生殖孔和泌尿孔。在進行挑選時，成熟雄魚選擇有明顯的婚姻色，體色鮮艷，尾鰭變紅，腹部粉紅，全身棕紅，且輕壓腹部可擠出少量清白色精液。
在進行挑選時，成熟雌魚選擇后腹部飽滿、柔軟，生殖乳突大而突出，孔圍呈現紅暈。
實施例2.親魚池的準備、親魚的配組及飼養
親魚池面積為501112左右。水位在100 120cm。親魚下池前用生石灰或漂白粉進行清池消毒。
按雌雄比例2 : 1進行親魚詞養。下池前用3%的食鹽水浸泡消毒。在繁殖初期一是看水質情況施放追肥；二是投喂羅非魚專用人工配合飼料，適當搭配一些有利于性腺發育的青飼料，如浮萍、苦荬菜等。配合飼料投喂量為魚體總重量的3 5%，每天投喂兩次，并根據水色、天氣情況、魚體活動情況等及時調整投喂量。
實施例3.親魚的人工授精及其育苗孵化
在水溫達26X:以上時，拉網檢查兩種羅非魚性腺發育情況。選擇后腹部飽
滿、柔軟，生殖孔突起并發紅，體格健壯體形較好的"新吉富"魚作為母本；
雜交父本則挑選輕按腹部即有乳白色精液流出的雄"薩羅"魚，同時按雌雄比
2:1選兩種親魚，本實施例選擇雌性魚20條、雄性魚10條。
將上述親魚放入網箱中；采用催產素進行人工注射，催產素分別為絨毛膜促性腺激素(HCG)劑量為2000單位/Kg魚體重、促黃體釋放激素類似物(LRH-A2)劑量為4 6微克/Kg魚體重。母本"新吉富"魚采用2次注射，間隔8 10小時，對雄性"薩羅"魚可注射1次催產素；將親魚注射催產激素后，放入網箱中飼養。
當水溫在26 3(TC，效應時間一般為20 30小時；取出網箱中的雌性"新吉富"魚，用紙揩干其身體上的水分，將成熟卵子擠入洗凈并擦干的白瓷碗中，隨即取出雄性"薩羅"魚，揩干水分，擠出清白色精液至剛排出的卵上，用干凈、柔軟的毛筆快速拌勻，倒入已充分曝氣的氯化鈉溶液中(氯化鈉濃度在0.65%至0.9%)，使卵受精1 3分鐘。
然后，將受精卵倒入準備好的孵化器中進行流水孵化，孵化采用充分曝氣的水，水溫在26 3(TC，調節孵化器中水流至卵能上下翻動為好；在孵化過程200810042029.0 6天后，小苗孵出。
反交("薩羅"魚？x "新吉富"魚3)的條件和處理方法與正交("新
吉富"魚？X "薩羅"魚^)基本相同。
實施例4.苗種培育
用漂白粉對池子進行徹底消毒，暴曬3天后，加入池塘肥水。加水時用細 篩絹過濾，以免帶入其它魚苗和大型浮游生物。魚苗平游后即可入池，入池后 3天卵黃囊未吸收盡，不喂食。第4天開始，每天每池喂2個蛋黃，每3天加 一個蛋黃，共喂10天，然后改喂粉狀詞料，每天喂4 7次。
本發明人將獲得的正交后代稱為"尼薩"魚，也稱為"吉麗羅非魚"或"吉 麗魚"。該雜交后代的外觀形態如圖2所示。
在一批試驗中，本發明人采取實施例3的方法，不同處在于將成熟卵子和 精子放在白瓷碗中后，倒入常規的水，使卵受精1 3分鐘。多次試驗發現， 該方法獲得的受精卵的質量低于采用氯化鈉溶液的情況，最終獲得魚苗的數量 比采用實施例3的方法少30%以上。
在另一批試驗中，本發明人采取實施例3的方法，不同處在于孵化時水溫 在22 25。C，且孵化時不采用流水孵化而使受精卵靜置于水中，結果發現，孵 化時間可拖延至2周，孵化率極低。
實施例5.雜交種尼薩魚在不同鹽度下的生長性能
2006年，在河北中捷國家級羅非魚良種場對雜交種"尼薩"魚及其父本"薩 羅"魚進行了不同鹽度下生長對比試驗。結果發現，雜交種在20 25鹽度下 生長速度最快，其絕對增重率是其父本"薩羅"魚的4倍多，不同鹽度下雜交 種及其父本的絕對增重率、瞬時增重率以及成活率等的計算結果如表1和圖1 所示。表1
鹽度魚別實驗末體重 (g)絕對增重率 (g d-1)瞬時增重率 (% d.1)成活率 (%)
Mean土SDMean土SDMean土SDMean士SD
0"尼薩"魚70.25±27.571.14±0.394.24±2.83卯
"薩羅"魚18.31±7.780.28±0.133.36±4.5996.7
15"尼薩" "薩羅"魚 魚82.03±25.11 22.68±8.551.33±0.33 0.34±0.134.20±2.26 3.17±3.2392.2 94.3
20"尼薩" "薩羅"魚 魚92.46±22.63 22.94±8.691.49±0.27 0.34±0.144.13 ±1.99 3.36±4.0793.3 97.8
25"尼薩" "薩羅"魚 魚90.59±30.89 23.12±10.291.47±0.34 0.35±0.164.26±1.89 3.47±4.3893.3 95.6
實施例6.雜交種尼薩魚耐鹽性能 耐鹽指標如下
(1) 平均成活時間(Mean survival time, MST)
將健康試驗魚從淡水直接移入鹽度為32的海水中，記錄每尾試驗魚的成 活時間，然后計算每種魚的所有魚的平均值，即為該種魚的平均成活時間。
(2) 50%成活時間(Median survival time, ST5(0
將健康試驗魚從淡水直接移入鹽度為32的海水后，記錄正好只有一半魚 存活的時間。
(3) 96h半致死鹽度(Median lethal salinity-96h， MLS-96)
將健康試驗魚直接移入各種鹽度梯度中，記錄飼養96h后各鹽度中試驗魚 的死亡數目，通過Excel軟件作出鹽度與死亡數目的相關曲線， 一半試驗魚死 亡所對應的鹽度即為96h半致死鹽度的觀察值。
對雜交種及其親本進行了耐鹽試驗，雜交后代及其親本的平均體重、平均存活 時間、50%存活時間、96h半致死鹽度的比較結果見表2，從表中可以清楚地看 到，雜交種的各項耐鹽指標較其母本"新吉富"魚有了很大提高，這說明雜交
17種適合在咸水中養殖'
2
指標
種類
平均體重(g) Mean土SD
平均存活時間 (min) Mean士SD
50%存活時間 (min) Mean士SD
96h半致死
鹽度
薩羅"魚(父本)0.987±0.158359.33±32.81 305.33±7.02
33.9
"新吉富"魚
1.271±0.186 75.87±16.83 74.33±1.15
(母本)
"尼薩"魚 1.254±0.173185.28±42.12 188.00±2.65
13.8 23.2
實施例7.雜交種尼薩羅非魚遺傳多樣性分析
采用6對微衛星引物對雜交種及其親本進行遺傳多樣性分析，各遺傳指標 的分析結果見表3，可以看出雜交種的各遺傳指標都比其親本大，表現了顯著 的雜交優勢。
表 3
群體
有效等位基因數多態信息含:
群體平均雜合度
'新吉富"魚 "尼薩"魚 "薩羅"魚
2,21 3.79 1.92
0.375 0.674 0.333
0.485 0.725 0.537
分析雜交種的可育性，發現雜交種可正常地自然繁殖，正交魚("新吉富" 魚？X "薩羅"魚3)的繁殖情況與"新吉富"魚基本相同，即1對雌雄魚能夠 繁殖1000 2000條子代魚。
實施例8."新吉富"魚與"薩羅"魚親本對耐鹽羅非魚雜種優勢貢獻力
18的評估
以原始親本"新吉富"魚和"薩羅"魚為對照，正交魚("新吉富"魚 X "薩羅"魚3)自繁第二代(F2)和反交魚("薩羅"魚？X "新吉富" 魚d)自繁第二代(F2)為試驗對象，觀察和比較它們在0、 15、 20及25鹽 度中的耐鹽性和生長性能，并估算雜種優勢及親本的貢獻力。
結果如下
(1) 具有良好的耐鹽性，鹽度20 25是正、反交魚的適宜生長鹽度，它 們在這一范圍鹽度里的日均增重率為"新吉富"魚在鹽度0下的75%左右、
"薩羅"魚在鹽度25下的4倍左右，表明雜交后代的生長速度比較接近"新 吉富"魚，遠優于"薩羅"魚。在鹽度25條件下，正交魚比反交魚生長快 7%左右。正交后代和反交后代均是可育的，但正交魚后代表現出相對更好的 可育性。
(2) 在鹽度15與20下，生長速度和體重變異系數的雜種優勢較明顯， 未發現不同鹽度會導致正反交魚成活率有顯著變化。
(3) 不同親本魚類的強勢性狀，如"新吉富"魚的快速生長、"薩羅" 的高耐鹽性，對雜交后代的不同性狀在不同鹽度中有不同的貢獻力。運用公 式F,《a^i+a2P2(其中，F!代表正反交子代平均值，&和32代表系數，P,和 P2分別代表親本1和親本2某性狀的平均值)進行估算。
結果表明，對雜交后代在15 25鹽度下的生長率，"新吉富"魚的雜 種優勢貢獻力比薩羅的大3 4倍；對雜交后代在25鹽度下的耐鹽性，"新 吉富"魚的貢獻力幾乎為零，而"薩羅"魚的貢獻力幾乎為100%，可見雜 交后代良好地保留了父本和母本的優勢。
實施例9."尼薩"魚的養殖示范
2007年8月17日，從河北中捷羅非魚良種場運送平均體重為1 2g的耐 鹽"尼薩"魚至廣東茂名5000尾、海南海口 12000尾。在廣東茂名，同南美 北對蝦一起，混養于4只鹽度為24的養蝦池內，在海南文昌，飼養于鹽度為 18的對蟲下三池內。
經82天飼養，長到150-200克。證明在18 24的鹽度里，飼養5 6個月 (5月份-10月份)可以長到400 500克的商品魚規格。2008年6月起，進一步在廣東茂名市冠利達水產公司的養蝦基地開展"尼 薩"魚的單養和魚蝦混養試驗，目前魚的生長良好。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻 被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之后， 本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申 請所附權利要求書所限定的范圍。
權利要求
1.一種適合海水養殖的魚類的育種方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟(1)將“尼羅羅非”魚與“薩羅”魚作為雜交組合；(2)從成熟的雌性親魚取卵子，從成熟的雄性親魚取精子，將卵子和精子在氯化鈉溶液中混勻，其中氯化鈉的濃度按照重量體積比在0.65～1.5％，從而獲得雜種受精卵；和(3)孵育(2)獲得的受精卵，從而得到雜交魚，所述雜交魚是適合海水養殖的魚類。
2. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(1)中，所述的雜交包 括正交或反交，所述的正交為"尼羅羅非"魚早X "薩羅"魚4，所述的反交 為"薩羅"魚早X "尼羅羅非"魚《；較佳地，采用正交的方式進行雜交。
3. 如權利要求l所述的方法，其特征在于，步驟(1)中，選擇年齡為2 4齡的親魚；且"尼羅羅非"魚的體重不低于500g，"薩羅"魚的體重不低于 200g。
4. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(1)中，其中雌性親魚 與雄性親魚的比例是2: 1。
5. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(1)中，在取卵或取精 前，對雌性親魚和/或雄性親魚注射催產素。
6. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)中，卵子和精子混 勻的時間是0.5 10分鐘；較佳地1 3分鐘。
7. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(3)中，包括將受精 卵在魚類孵化器中進行流水孵化，水溫保持在26 32'C，調節孵化器中水流至 受精卵能上下翻動。
8. 如權利要求l所述的方法，其特征在于，所述的"尼羅羅非"魚滿足以下 至少一個條件(a) 身體兩側有與體軸垂直、平行的條紋7 9條；和/或(b) 尾鰭上垂直或平行排列的斑點條紋13條以上；和/或(c) 體長與體高的比例不低于2.18;和/或(d) 背鰭D: XV X VII-12 14;禾口/或(e) 臀鰭A: 111-8 10;禾口/或(f) 上側線鱗數13 26;和/或(g) 下側線鱗數13 20;和/或(h) 第一鰓弓外側鰓耙數27 31;和/或(i) 生長快在3000 4000尾/畝密度下，池塘飼養6個月，體重達600 800克；或者，所述的"薩羅"魚滿足以下至少一個條件(a) 體色灰白，腹側珍珠藍，背部橘黃或金黃，成體頰部有一顯著黑斑； 和/或(b) 頭長與全長的比例為0.27 0.29;和/或(c) 背鰭D: XV XVI 10 12;禾口/或(d) 臀鰭A: III 8 10;禾口/或(e) 側線上鱗3 4;和/或(f) 上側線鱗數18 21;和/或(g) 下側線鱗數10 12;和/或(h) 在20 35鹽度的海水中正常生長。
9. 如權利要求l所述的方法，其特征在于，還包括步驟(4):對步驟(3)獲得的雜交魚進行培育和繁殖，從而獲得遺傳穩定的、可育的 后代魚，所述雜交魚能在鹽度為0 32的水中生長。
10. 如權利要求l所述的方法，其特征在于，所述的方法包括(i) 選用"新吉富尼羅羅非"魚辛X "薩羅"魚4作為雜交組合；(ii) 在水溫26 32'C時，在步驟(i)中選擇后腹部飽滿、柔軟，生殖孔突 起，體格健壯，體形好的"新吉富尼羅羅非"魚早，選擇輕按腹部即有清白色 精液流出的"薩羅"魚3，按2:1的雌雄比例，放入網箱中，充氣以保證溶氧 充足；(iii) 采用催產素絨毛膜促性腺激素和促黃體生成素釋放激素類似物注射 親魚；"新吉富尼羅羅非"魚早采用1 2次注射，"薩羅"魚《采用1次注 射；(iv) 將步驟(ii)注射催產激素后的親魚放入網箱；當水溫在26 30°C， 在催產素效應時間20 30小時后；捕起雌性"新吉富尼羅羅非"魚，揩干其 身體上的水分，將成熟卵子擠入潔凈干燥的容器中；隨即取出雄性"薩羅"魚，揩干其身體上水分，擠出精液至剛排出的卵上；快速拌勻卵和精，再倒入已充 分曝氣的氯化鈉溶液，使卵子受精1 3分鐘；(V)將受精卵倒入孵化器中進行流水孵化；孵化采用充分曝氣的水，水溫 保持在26 30'C，調節孵化器中水流至卵能上下翻動；(Vi)在孵化過程中，每隔0.5 1小時，査看孵化器里的情況，將死亡的 卵吸去；和(Vii)孵化結束，獲得適合海水養殖的魚類。
全文摘要
本發明涉及羅非魚耐鹽育種技術，公開了一種適合海水養殖的魚類的育種方法，所述方法包括如下步驟將“尼羅羅非”魚與“薩羅”魚作為雜交組合，從成熟的雌性親魚取卵，從成熟的雄性親魚取精，將卵和精混勻，從而獲得雜種受精卵；孵育受精卵，從而得到雜交魚，所述雜交魚是適合海水養殖的魚類。本發明人通過遠緣雜交，培育出了耐鹽性和生長速度兼優的具有雜交優勢的羅非魚新品種，其不僅沒有淡水養殖羅非魚常有的土腥味，而且肉質緊密富彈性，品質高。
文檔編號A01K61/00GK101658146SQ200810042029
公開日2010年3月3日 申請日期2008年8月25日 優先權日2008年8月25日
發明者張艷紅, 李思發, 筴金華, 蔡完其 申請人:李思發