本發明屬于煙草育種技術領域，具體涉及一種同時改善烤煙植株抗病性、氮利用率和煙堿含量的方法。
背景技術：
煙草是卷煙的主要原料作物，也是中國的重要經濟作物，而品種是烤煙生產的基礎。長期以來，我國烤煙生產上使用的主栽品種一直是云煙87和k326，這主要是因為其煙葉品質好而深受卷煙工業的喜愛。但是，近些年來，這兩大主栽品種遇到了三大問題：一是由于這兩大主栽品種種植歷史長，致使普通花葉病(tmv)等病毒病和氣候斑點病等葉面病害的危害日趨嚴重，嚴重降低了煙草產量和品質，經濟損失慘重，已成為我國優質烤煙生產的重要制約因素；二是由于這兩大主栽品種對氮肥的利用效率不高，因而在栽培種植的過程中，為了保證產量，而需要施用大量的化學肥料，尤其是需要施用大量的氮肥，從而造成氮肥資源的巨大浪費，增加種煙成本，并構成水體富營養化的面污染源；三是由于這兩大主栽品種在栽培種植過程中氮肥施用量過大，加之近幾年煙葉生產過程要求去除部分上部葉和部分下部葉，導致有效留葉數較少，進而造成上部煙葉煙堿含量偏高，工業可用性下降。如果采用傳統的育種方法，針對上述三大問題，對這兩大主栽品種進行改良，則又會面臨著兩大問題：一是采用傳統育種方法對這兩大品種進行改良，難以保障改良品種仍然保持這兩大品種原來具有的深受卷煙工業喜愛的煙葉風格特征；二是采用傳統育種方法對這兩大品種進行改良，所需年限較長，難以在短時間內滿足煙葉生產的需求。近幾年來出現了一些通過嫁接來改良烤煙植株特性的新技術，接穗生長所需的水分、礦質養分由砧木根系提供，砧木所需同化產物由接穗供給，嫁接后的煙株既能保持接穗品種的優良性狀，又能利用砧木的有利特性。通過嫁接改良的煙株當年即可應用于大田生產，而不需要花費太長年限。如中國專利件201110387997.7公開了一種以玫瑰葡萄為砧木、采用舌接法嫁接來改良k326烤煙品種的方法，專利件201110388642.x公開了一種以香葉天竺葵為砧木、采用靠接法嫁接來改良云煙87烤煙品種的方法，專利件201110387720.4公開了一種以香菊為砧木、采用腹接法嫁接來改良云煙97烤煙品種的方法，專利件201110387818.x公開了一種以青蒿為砧木、采用插接法嫁接來改良中煙100烤煙品種的方法，專利件201110388641.5公開了一種以墨紅玫瑰為砧木、采用芽接法嫁接來改良nc102烤煙品種的方法，專利件201110387785.9公開了一種以法國野葡萄為砧木、采用舌接法嫁接來改良nc297烤煙品種的方法，專利件201310737512.1公開了一種以油菜為砧木、采用插接法嫁接來改良烤煙植株的培育方法，專利件201410020314.8公開了一種以茄屬茄子抗青茄砧為砧木、采用插接法嫁接來改良煙株青枯病抗性的方法。這些專利件都是以非煙草植物為砧木，通過不同嫁接方法來改良烤煙品種的。眾所周知，煙堿是由煙草根系合成的，然后通過煙株莖稈運輸到煙株葉片中。雖然煙草之外的茄科植物根系也能合成煙堿，但其煙堿合成量與煙草相比，幾乎可以忽略不計。煙堿是煙葉的特征化學成分，內在質量好的烤煙煙葉一般要求煙堿含量在1.5％-3.5％之間，以2.5％左右為宜。若煙葉中煙堿含量過高，則生理強度大，吃味變劣，刺激性增強，卷煙工業上不好使用，反之，煙堿含量過低，則煙葉吃味平淡，不能滿足吸食需要，卷煙工業上也不喜歡。因此，上述幾件專利所公開的方法盡管能夠提高煙株的抗病蟲能力或抗逆能力，甚至賦予煙葉特殊的香氣，但所獲得的煙株因砧木根系無法合成煙堿或合成的煙堿幾乎為零，致使煙葉失去特征化學成分煙堿，進而降低了煙葉的特征香氣和吃味，因此，采用這些方法去改良目前烤煙生產上大面積使用的主栽品種，在烤煙生產中無實際意義。況且，這些方法都未涉及嫁接后煙株氮肥利用效率的表現，這些方法采用非煙草植物作為砧木，其需肥特性與烤煙本身的需肥特性有很大差異，因而對煙株的氮肥利用率是否有改良效果也就不得而知。中國專利件201310415281.2公開了一種以籽粒莧為砧木、采用合接法嫁接來改良烤煙植株的培育方法。這一方法雖然能夠提高煙葉鉀含量，但對所獲得煙株的抗病性和氮肥利用率不得而知，而且同樣存在所獲得的煙株因砧木根系無法合成煙堿，致使煙葉失去特征化學成分煙堿的問題，因而在烤煙生產中也無實際意義。中國專利件201310737474.x公開了一種以大豆為砧木、采用插接法嫁接來改良烤煙植株的培育方法。該方法試圖利用大豆根瘤菌的生物固氮作用，以減少煙株施氮量。但是，煙草屬于大株距大行距作物，個體較大，而大豆屬于密植作物，個體較小，因而大豆根系發育受到一定限制，難以支撐煙株個體的充分發育，致使煙株容易倒伏。此外，該方法所得煙株的抗病性如何不得而知，也同樣存在著所獲得的煙株因砧木根系無法合成煙堿，致使煙葉失去特征化學成分煙堿的問題，因而在烤煙生產中也無實際意義。中國專利件201210064290.7公開了一種以黃花煙草為砧木、采用劈接法嫁接來改良烤煙植株的培育方法，試圖利用黃花煙草根系富集cd的能力，以降低cd在煙葉中的積累量。黃花煙草多屬地方品種或野生種，綜合抗病抗逆能力較強，因而以黃花煙草為砧木，所獲得的烤煙植株的抗病抗逆能力也會有所改善，但由于黃花煙草非常耐肥，且其根系合成煙堿能力顯著高于烤煙，因而以黃花煙草為砧木，難以改善所獲得烤煙植株的氮利用率和煙堿含量。中國專利件201210389062.7公開了一種通過嫁接來整合煙草品種特性的方法。該方法以抗病品種為砧木、感病優質品種為接穗，整合的只是煙草品種的抗病性，并未涉及所獲得煙株的氮利用率及其煙葉中的煙堿含量。本領域技術人員都知曉，在眾多的煙草種質資源中，不乏兼抗根莖類病害和葉面病害的種質，也不乏氮利用率高而根系合成煙堿量較少的種質，但僅有少數一些種質材料既表現氮利用率高、根系合成煙堿量較少，又兼抗根莖類病害和葉面病害，如cv87、k8等。然而這些種質材料不宜直接作為砧木，通過嫁接去解決烤煙主栽品種k326和云煙87存在的上述三大問題。如cv87、k8等種質材料，由于根系非常發達，因而氮肥利用率非常高，雖然能夠抗旱抗倒伏，但對氮肥非常敏感，不易烘烤。若用其作為砧木通過嫁接來改良烤煙品種k326和云煙87，則所獲嫁接后煙株同樣因根系過于發達而對氮肥非常敏感，加之植煙土壤的肥力千差萬別，致使煙農對嫁接后煙株的施肥量難以控制，進而影響煙葉烘烤質量。此外，這些種質材料若作為砧木通過嫁接來改良烤煙品種k326和云煙87，雖然由于其根系合成煙堿量較少而能解決目前烤煙主栽品種k326和云煙87上部葉煙堿含量偏高問題，但又會使嫁接后煙株表現出煙葉中煙堿含量偏低的問題。因此，如若利用嫁接技術來改良烤煙主栽品種k326和云煙87，那么采取有效的手段使cv87、k8等種質材料的氮肥敏感性得以緩沖，根系合成煙堿能力稍有提高，進而成為理想的砧木就顯得尤為重要。申請人試圖將嫁接技術與傳統育種方法相結合，為此進行了試驗研究，探討出了一種同時改善烤煙植株抗病性、氮利用率和煙堿含量的方法。
技術實現要素：
本發明提供一種同時改善烤煙植株抗病性、氮利用率和煙堿含量的方法，既能使改良后的烤煙植株保持烤煙主栽品種k326和云煙87的原有煙葉風格特征，又能使改良后的烤煙植株提高抗病抗逆性、氮利用率和上部煙葉的工業可用性，節省肥料和農藥投資成本，減少環境污染,并大大縮短育種周期。
本發明提供的技術方案：所述一種同時改善烤煙植株抗病性、氮利用率和煙堿含量的方法，其特征在于具體步驟如下：
(1)以廣適、抗黑脛病而感tmv和氣候斑點病的生產上使用的烤煙品種為母本，以兼抗黑脛病、tmv和氣候斑點病，且根系發達、氮利用率高、煙葉中煙堿含量偏低的常規烤煙種質材料為父本，雜交得到雜交組合f1代種子；
(2)以步驟(1)獲得的雜交組合f1代幼苗作為砧木，以生產上使用的烤煙品種幼苗作為接穗進行嫁接，得到嫁接植株并進行培育；
(3)將步驟(2)獲得的嫁接成活煙株按照當地烤煙生產技術要求方法移栽至大田。
本發明方法中，步驟(1)中所述母本品種與步驟(2)中所述接穗品種是一致的，包括k326和云煙87或其不育系。
本發明方法中，步驟(1)中所述父本包括cv87或k8。cv87和k8均是中國農業科學院煙草研究所用抗tmv、赤星病、氣候斑點病主抗源cv58作母本，以美國引進抗根莖病害優質品種主親源g28、nc82、g80等品種的f1代組合做父本，進行多親本復交選育而成的烤煙新種質，1994年通過煙草行業專家鑒定，并提交國家煙草種質庫保存，同時發放給各煙草育種單位使用。
本發明方法中，步驟(2)中接穗品種按正常的烤煙育苗節令播種育苗，砧木材料比接穗品種提前5-10天播種育苗，以控制兩種煙苗的生長勢，備嫁接；育苗方法選用煙草漂浮育苗技術育苗；漂浮育苗在溫室大棚內進行，育苗基質按草炭與珍珠巖體積比為2﹕1配制，每m3基質加50％多菌靈可濕性粉劑200g，氮、磷、鉀含量為15﹕15﹕15三元復合肥3kg，肥藥混合均勻。
本發明方法中，步驟(2)中，嫁接一般選擇在陰天或者晴天的早上和下午為宜；嫁接工具需用酒精消毒，嫁接人員的手需清洗干凈。
本發明方法中，步驟(2)中，嫁接時，砧木選取苗齡45-55天，莖高4.0-6.0cm，直徑0.20-0.40cm的健壯無病的砧木材料的煙苗作為砧木；接穗選取苗齡40-50天，莖高3.5cm以上，直徑0.15-0.25cm的健壯無病的接穗品種的煙苗作為接穗。
本發明方法中，步驟(2)中，嫁接方法可采用劈接法、斜劈接法、舌接法或合接法，嫁接后將嫁接煙株移入愈合養護室。
其中，k326由美國northrupking種子公司用mcnair225×(mcnair30×nc95)雜交選育而成，1983年在美國開始推廣，1985年引入我國并提交國家煙草種質庫保存，同時發放給各煙草育種單位，1989年經過試驗示范，由全國煙草品種審定委員會審定為優良品種，并在全國推廣。為了杜絕煙農自留種現象并防止品種混雜退化，本世紀初，中國農科院煙草研究所將k326轉育成不育系msk326，并替代常規品種k326在全國推廣，目前烤煙生產上大面積種植的k326既有常規品種k326，也有k326雄性不育系msk326。云煙87由云南省煙草科學研究所以云煙2號為母本、k326為父本雜交選育而成，2000年由全國煙草品種審定委員會審定為優良品種，并在全國推廣，同時提交國家煙草種質庫保存，并發放給各煙草育種單位。為了杜絕煙農自留種現象并防止品種混雜退化，近年來，云南玉溪煙草種子公司將云煙87轉育成不育系ms云煙87，并替代常規品種云煙87在全國推廣，目前烤煙生產上大面積種植的云煙87既有常規品種云煙87，也有云煙87雄性不育系ms云煙87。
所述劈接法即插接法，具體做法是：去除砧木的生長點，將其莖桿縱軸用刀片垂直向下劈深1-1.5cm的切口；接穗切除根部并去除部分較大地葉片，在近子葉節處兩邊各削一刀形成楔形，削面長度1-1.5cm，將削好的接穗垂直插入砧木的劈口，使砧木與接穗削面平整對齊，為了使砧木與接穗切面緊密貼合，用嫁接夾固定或用塑料薄膜條帶捆扎結實。
所述斜劈接法即腹接法，具體做法是：將接穗根部切除并去除部分較大地葉片，用刀將接穗下端削成緩斜的楔形平面，用刀斜角向下切至砧木直徑的1/4處，將接穗插入砧木的切口，用透明膠布綁縛。嫁接成活后，將嫁接位以上的砧木剪去。
所述舌接法，具體做法是：去除砧木的生長點，從上向下斜切一刀，切面長為1-1.5cm；接穗切除根部并去除較大地葉片，僅保留1葉1心，然后在近子葉節處同樣斜切一刀，切面長度與砧木切面長度保持一致；再在砧木斜面上靠近尖端1/3處和接穗斜面上靠近尖端2/3處，各自垂直向下切一刀，深約1-1.5cm，將接穗和砧木“舌”形切口相卡，并對準形成層，上下擠緊，將兩舌間插合在一起。此法結合非常緊密，可不用捆扎。
所述合接法，具體做法是：去除砧木的生長點，從上向下斜切一刀，切面長為0.8-1.2cm；接穗切除根部并去除較大地葉片，僅保留1葉1心，然后在近子葉節處同樣斜切一刀，切面長度與砧木切面長度保持一致；使用塑料套管嫁接，將砧木的切面朝上插進套管，再把接穗的煙苗切面朝下插進套管中，使砧木與接穗的切面緊緊貼合在一起。
本發明方法中，步驟(2)中，嫁接后前3天注意遮光，保溫、保濕，控制空氣濕度在80％以上，溫度20-28℃；3天后通風和見光，控制空氣濕度以接穗不萎蔫為基準，至完全愈合，7-10天后移出養護室，并拿掉嫁接夾(套)或解除綁條。
有益效果
(1)本發明方法以生產上使用的烤煙主栽品種為母本，以兼抗多種病害、氮利用率高而煙堿含量偏低的種質材料為父本，配制雜交組合，將得到的雜交組合f1代作為砧木，將得到的雜交組合的母本作為接穗，得到的嫁接改良煙株能夠最大程度地維持接穗品種原有的卷煙工業所喜愛的煙葉風格特征。
(2)本發明方法以生產上使用的抗根莖類病害黑脛病而感tmv、氣候斑點病等葉面病害的烤煙主栽品種為母本，以根系非常發達、兼抗根莖類病害黑脛病和葉面病害tmv、氣候斑點病等多種病害的種質材料為父本，配制雜交組合，則得到的雜交組合f1代同樣根系非常發達，且兼抗根莖類病害黑脛病和葉面病害tmv、氣候斑點病等多種病害。將得到的雜交組合f1代作為砧木，將得到的雜交組合的母本作為接穗，得到的嫁接改良煙株與接穗品種相比，不僅具有抗黑脛病和抗旱、抗倒伏性能，而且在生育期、形態特征、農藝性狀、經濟性狀、烘烤和吸食品質方面與原接穗品種無明顯差異，在抗tmv、氣候斑點病等葉面病害以及適應性方面優于接穗品種。
(3)本發明方法以生產上使用的極度耐肥的烤煙主栽品種為母本，以根系非常發達、因氮肥利用率非常高而對氮肥非常敏感的種質材料為父本，配制雜交組合，則得到的雜交組合f1代同樣根系非常發達，且氮肥利用率和對氮肥的敏感性居于母本和父本之間。將得到的雜交組合f1代作為砧木，將得到的雜交組合的母本作為接穗，得到的嫁接改良煙株的氮肥利用率較接穗品種明顯提高，且又對氮肥的敏感性較雜交組合f1代的父本明顯降低。嫁接改良煙株與接穗品種進行比較的結果表明，嫁接煙株在保證煙葉正常產量和質量的條件下，能夠明顯降低煙株施氮量，并且單株施氮量容易為煙農控制。
(4)本發明方法以生產上使用的烤煙主栽品種為母本，以煙葉中煙堿含量偏低的種質材料為父本，配制雜交組合，則得到的雜交組合f1代煙葉中煙堿含量居于母本和父本之間。將得到的雜交組合f1代作為砧木，將得到的雜交組合的母本作為接穗，得到的嫁接改良煙株的上部葉煙堿含量較接穗品種明顯降低，且又較雜交組合f1代的父本明顯提高。嫁接改良煙株與接穗品種進行比較的結果表明，嫁接煙株上部葉煙堿含量處于適宜范圍，上部葉的工業可用性得到提高。
(5)本發明方法以廣適、抗黑脛病而感tmv和氣候斑點病的生產上使用的烤煙品種為母本，以兼抗黑脛病、tmv和氣候斑點病，且根系發達、氮利用率高、煙葉中煙堿含量偏低的常規烤煙種質材料為父本，配制雜交組合，將得到的雜交組合f1代作為砧木，將得到的雜交組合的母本作為接穗，得到的嫁接改良煙株不僅抗病性得以提高，氮肥利用率也得以提高，既降低了肥料和農藥投資成本，又減少了環境污染。
(6)本發明方法以廣適、抗黑脛病而感tmv和氣候斑點病的生產上使用的烤煙品種為母本，以兼抗黑脛病、tmv和氣候斑點病，且根系發達、氮利用率高、煙葉中煙堿含量偏低的常規烤煙種質材料為父本，配制雜交組合，將得到的雜交組合f1代作為砧木，將得到的雜交組合的母本作為接穗，得到的嫁接煙株在抗病性、氮利用率和上部葉煙堿含量方面同時都得到了改善，而花費的時間僅需1年，與傳統育種方法相比，大大地縮短了育種周期。
具體實施方式
下面結合實施例對本發明作進一步的說明，但本發明的實施方式不限于此。下述實施例中所使用的試驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
實施例一：利用種質材料k8改良烤煙品種k326
烤煙品種k326煙葉品質優良，深受卷煙工業喜愛，長期的田間表現情況觀察和鑒定結果表明，烤煙品種k326中抗根莖類病害黑脛病，但易感葉面性病害普通花葉病毒病(tmv)、馬鈴薯y病毒病(pvy)、赤星病和氣候斑點病，田間表現極度耐肥，需氮量高，加之近些年來要求去除部分上部葉和部分下部葉，導致有效留葉數較少，進而造成上部煙葉煙堿含量偏高，工業可用性下降。而常規種質材料k8根系非常發達，抗旱抗倒伏，兼抗根莖類病害黑脛病和葉面性病害tmv、pvy、赤星病和氣候斑點病，但因氮肥利用率非常高而對氮肥非常敏感，不易烘烤，且煙葉中煙堿含量偏低。
在海南三亞南繁基地，同時種植烤煙品種k326和種質材料k8，并于元月份盛花期以k326為母本，以k8為父本進行雜交，得到雜交組合f1代種子，記作(k326×k8)f1。
將得到的(k326×k8)f1以及k326和k8在恩施州利川育種基地育苗大棚內進行漂浮育苗，育苗基質按草炭與珍珠巖體積比為2﹕1配制，每m3基質加50％多菌靈可濕性粉劑200g，氮、磷、鉀含量為15﹕15﹕15三元復合肥3kg，肥藥混合均勻。2月20日播種(k326×k8)f1，3月1日播種k326和k8。按煙草漂浮育苗技術要求進行苗期管理。
各品種于播種后10-12天開始出苗。4月20-25日進行嫁接。砧木材料(k326×k8)f1選取苗齡45-55天，莖高4.0-6.0cm，直徑0.20-0.40cm的健壯無病的煙苗作為砧木。接穗品種k326選取苗齡40-50天，莖高3.5cm以上，直徑0.15-0.25cm的健壯無病的煙苗作為接穗。在早上或下午采用劈接法嫁接。去除砧木的生長點，將其莖桿縱軸用刀片垂直向下劈深1-1.5cm的切口；接穗切除根部并去除部分較大地葉片，在近子葉節處兩邊各削一刀形成楔形，削面長度也是1-1.5cm，將削好的接穗垂直插入砧木的劈口，使砧木與接穗削面平整對齊，為了使砧木與接穗切面緊密貼合，用嫁接夾固定或用塑料薄膜條帶捆扎結實。嫁接煙株記作k326/(k326×k8)f1。
嫁接時注意嫁接工具需用酒精消毒，嫁接人員的手需清洗干凈。嫁接結束后，將嫁接煙株移入愈合養護室。前3天注意遮光，保溫、保濕，控制空氣濕度在80％以上，溫度20-28℃。3天后通風和見光，控制空氣濕度以接穗不萎蔫為基準，至完全愈合，7-10天后移出養護室，并拿掉嫁接夾或解除綁條。
5月10日，將k326/(k326×k8)f1、(k326×k8)f1、k326和k8一起移栽至大田，進行不同施氮量的小區比較試驗。采用裂區試驗設計，品種(k326/(k326×k8)f1、(k326×k8)f1、k326、k8)為主處理，施氮量(0、2.5、4.5、6.5kg/畝)為副處理。其中施氮量6.5kg/畝為目前大田生產上k326正常施氮量，施氮量2.5kg/畝為k8正常施氮量。各處理氮磷鉀配比均為1∶1.5∶3。每小區種植80株，3次重復。行距和株距分別為120cm和60cm。四周設置保護行。其它栽植方法和大田管理按照當地烤煙生產技術要求進行。成熟摘葉采收，密集式烤房烘烤。烘烤結束后除施氮量0kg/畝處理外，各品種均按小區計產計質，各處理分別取中部葉混合樣和上部葉混合樣測定煙堿含量，同時各品種取c3f等級煙樣進行評吸鑒定。試驗過程中，在每個品種中選用施氮量6.5kg/畝的處理，選取均勻一致的5株煙進行定株，按生育進程采集根、莖、葉(成熟一片采一片)、頂和杈等進行殺青、烘干、稱重，并分別測定其n含量，以施氮量0kg/畝處理為不施氮肥的空白對照，采用差減法測算各品種的氮利用率。此外，還將k326/(k326×k8)f1、(k326×k8)f1、k326和k8煙苗移栽入黑脛病病圃和病毒病病圃，均采用隨機區組設計，3次重復，每小區20株，以進行黑脛病和tmv抗性接種鑒定，同時田間調查氣候斑點病發病情況。上述試驗結果分別列于表1、表2和表3。
試驗結果表明，嫁接改良煙株對黑脛病、tmv和氣候斑點的抗性均較接穗品種k326有明顯改善。嫁接改良煙株的氮利用率也比接穗品種k326明顯提高，與作為砧木的(k326×k8)f1的氮利用率相近，又比砧木(k326×k8)f1的父本k8的氮利用率有所降低。從經濟性狀來看，接穗品種在畝施氮量6.5kg時綜合經濟性狀表現最好，但上部煙葉中煙堿含量超出適宜范圍3.5％；而嫁接改良煙株在畝施氮量4.5kg時綜合經濟性狀表現最好，且與接穗品種在畝施氮量6.5kg時的綜合經濟性狀表現相當，此時中部葉和上部葉煙堿含量都處于適宜范圍，接近最佳值2.5％，隨著施氮量增加，嫁接改良煙株因煙葉落黃成熟變得困難而經濟性狀變差，上部葉煙堿含量也遠離最佳值。從評吸質量來看，嫁接改良煙株與接穗品種k326相當。由上可見，在保障煙葉品質風格和綜合經濟性狀的情況下，嫁接改良煙株綜合抗病性得到了改善，氮利用率得到了提高，而施氮量明顯降低，上部葉煙堿含量也明顯降低且更趨于適宜。
表1各品種的氮利用率與病情指數
表2各品種的不同施氮量經濟性狀表現與煙堿含量
表3各品種的評吸結果
實施例二：利用種質材料k8改良烤煙品種云煙87
烤煙品種云煙87煙葉品質優良，深受卷煙工業喜愛，長期的田間表現情況觀察和鑒定結果表明，烤煙品種云煙87中抗根莖類病害黑脛病，但易感葉面性病害tmv、pvy、赤星病和氣候斑點病，田間表現極度耐肥，需氮量高，加之近些年來要求去除部分上部葉和部分下部葉，導致有效留葉數較少，進而造成上部煙葉煙堿含量偏高，工業可用性下降。而常規種質材料k8根系非常發達，抗旱抗倒伏，兼抗根莖類病害黑脛病和葉面性病害tmv、pvy、赤星病和氣候斑點病，但因氮肥利用率非常高而對氮肥非常敏感，不易烘烤，且煙葉中煙堿含量偏低。
在海南三亞南繁基地，同時種植烤煙品種云煙87和種質材料k8，并于元月份盛花期以云煙87為母本，以k8為父本進行雜交，得到雜交組合f1代種子，記作(云煙87×k8)f1。
將得到的(云煙87×k8)f1以及云煙87和k8在恩施州利川育種基地育苗大棚內進行漂浮育苗，育苗基質按草炭與珍珠巖體積比為2﹕1配制，每m3基質加50％多菌靈可濕性粉劑200g，氮、磷、鉀含量為15﹕15﹕15三元復合肥3kg，肥藥混合均勻。2月28日播種(云煙87×k8)f1，3月5日播種云煙87和k8。按煙草漂浮育苗技術要求進行苗期管理。
各品種于播種后10-12天開始出苗。4月25-30日進行嫁接。砧木材料(云煙87×k8)f1選取苗齡45-55天，莖高4.0-6.0cm，直徑0.20-0.40cm的健壯無病的煙苗作為砧木。接穗品種云煙87選取苗齡40-50天，莖高3.5cm以上，直徑0.15-0.25cm的健壯無病的煙苗作為接穗。在早上或下午采用斜劈接法嫁接。將接穗根部切除并去除部分較大地葉片，用刀將接穗下端削成緩斜的楔形平面，用刀斜角向下切至砧木直徑的1/4處，將接穗插入砧木的切口，用透明膠布綁縛。嫁接煙株記作云煙87/(云煙87×k8)f1。
嫁接時注意嫁接工具需用酒精消毒，嫁接人員的手需清洗干凈。嫁接結束后，將嫁接煙株移入愈合養護室。前3天注意遮光，保溫、保濕，控制空氣濕度在80％以上，溫度20-28℃。3天后通風和見光，控制空氣濕度以接穗不萎蔫為基準，至完全愈合，7-10天后移出養護室，并將嫁接位以上的砧木剪去。
5月15日，將云煙87/(云煙87×k8)f1、(云煙87×k8)f1、云煙87和k8一起移栽至大田，進行不同施氮量的小區比較試驗。采用裂區試驗設計，品種(云煙87/(云煙87×k8)f1、(云煙87×k8)f1、云煙87、k8)為主處理，施氮量(0、2.5、4.5、6.5kg/畝)為副處理。其中施氮量6.5kg/畝為目前大田生產上云煙87正常施氮量，施氮量2.5kg/畝為k8正常施氮量。各處理氮磷鉀配比均為1∶1.5∶3。每小區種植80株，3次重復。行距和株距分別為120cm和60cm。四周設置保護行。其它栽植方法和大田管理按照當地烤煙生產技術要求進行。成熟摘葉采收，密集式烤房烘烤。烘烤結束后除施氮量0kg/畝處理外，各品種均按小區計產計質，各處理分別取中部葉混合樣和上部葉混合樣測定煙堿含量，同時各品種取c3f等級煙樣進行評吸鑒定。試驗過程中，在每個品種中選用施氮量6.5kg/畝的處理，選取均勻一致的5株煙進行定株，按生育進程采集根、莖、葉(成熟一片采一片)、頂和杈等進行殺青、烘干、稱重，并分別測定其n含量，以施氮量0kg/畝處理為不施氮肥的空白對照，采用差減法測算各品種的氮利用率。此外，還將云煙87/(云煙87×k8)f1、(云煙87×k8)f1、云煙87和k8煙苗移栽入黑脛病病圃和病毒病病圃，均采用隨機區組設計，3次重復，每小區20株，以進行黑脛病和tmv抗性接種鑒定，同時田間調查氣候斑點病發病情況。上述試驗結果分別列于表4、表5和表6。
試驗結果表明，嫁接改良煙株對黑脛病、tmv和氣候斑點的抗性均較接穗品種云煙87有明顯改善。嫁接改良煙株的氮利用率也比接穗品種云煙87明顯提高，與作為砧木的(云煙87×k8)f1的氮利用率相近，又比砧木(云煙87×k8)f1的父本k8的氮利用率有所降低。從經濟性狀來看，接穗品種在畝施氮量6.5kg時綜合經濟性狀表現最好，但上部煙葉中煙堿含量超出適宜范圍3.5％；而嫁接改良煙株在畝施氮量4.5kg時綜合經濟性狀表現最好，且與接穗品種在畝施氮量6.5kg時的綜合經濟性狀表現相當，此時中部葉和上部葉煙堿含量都處于適宜范圍，接近最佳值2.5％，隨著施氮量增加，嫁接改良煙株因煙葉落黃成熟變得困難而經濟性狀變差，上部葉煙堿含量也遠離最佳值。從評吸質量來看，嫁接改良煙株與接穗品種云煙87相當。由上可見，在保障煙葉品質風格和綜合經濟性狀的情況下，嫁接改良煙株綜合抗病性得到了改善，氮利用率得到了提高，而施氮量明顯降低，上部葉煙堿含量也明顯降低且更趨于適宜。
表4各品種的氮利用率與病情指數
表5各品種的不同施氮量經濟性狀表現與煙堿含量
表6各品種的評吸結果
實施例三：利用種質材料cv87改良烤煙品種msk326
烤煙品種msk326煙葉品質優良，深受卷煙工業喜愛，長期的田間表現情況觀察和鑒定結果表明，烤煙品種msk326中抗根莖類病害黑脛病，但易感葉面性病害tmv、pvy、赤星病和氣候斑點病，田間表現極度耐肥，需氮量高，加之近些年來要求去除部分上部葉和部分下部葉，導致有效留葉數較少，進而造成上部煙葉煙堿含量偏高，工業可用性下降。而常規種質材料cv87根系非常發達，抗旱抗倒伏，兼抗根莖類病害黑脛病和葉面性病害tmv、pvy、赤星病和氣候斑點病，但因氮肥利用率非常高而對氮肥非常敏感，不易烘烤，且煙葉中煙堿含量偏低。
在海南三亞南繁基地，同時種植烤煙品種msk326和種質材料cv87，并于元月份盛花期以msk326為母本，以cv87為父本進行雜交，得到雜交組合f1代種子，記作(msk326×cv87)f1。
將得到的(msk326×cv87)f1以及msk326和cv87在恩施州利川育種基地育苗大棚內進行漂浮育苗，育苗基質按草炭與珍珠巖體積比為2﹕1配制，每m3基質加50％多菌靈可濕性粉劑200g，氮、磷、鉀含量為15﹕15﹕15三元復合肥3kg，肥藥混合均勻。2月23日播種(msk326×cv87)f1，3月2日播種msk326和cv87。按煙草漂浮育苗技術要求進行苗期管理。
各品種于播種后10-12天開始出苗。4月22-27日進行嫁接。砧木材料(msk326×cv87)f1選取苗齡45-55天，莖高4.0-6.0cm，直徑0.20-0.40cm的健壯無病的煙苗作為砧木。接穗品種msk326選取苗齡40-50天，莖高3.5cm以上，直徑0.15-0.25cm的健壯無病的煙苗作為接穗。在早上或下午采用舌接法嫁接。去除砧木的生長點，從上向下斜切一刀，切面長為1-1.5cm；接穗切除根部并去除較大地葉片，僅保留1葉1心，然后在近子葉節處同樣斜切一刀，切面長度與砧木切面長度保持一致；再在砧木斜面上靠近尖端1/3處和接穗斜面上靠近尖端2/3處，各自垂直向下切一刀，深約1-1.5cm，將接穗和砧木“舌”形切口相卡，并對準形成層，上下擠緊，將兩舌間插合在一起。此法結合非常緊密，可不用捆扎。嫁接煙株記作msk326/(msk326×cv87)f1。
嫁接時注意嫁接工具需用酒精消毒，嫁接人員的手需清洗干凈。嫁接結束后，將嫁接煙株移入愈合養護室。前3天注意遮光，保溫、保濕，控制空氣濕度在80％以上，溫度20-28℃。3天后通風和見光，控制空氣濕度以接穗不萎蔫為基準，至完全愈合，7-10天后移出養護室。
5月13日，將msk326/(msk326×cv87)f1、(msk326×cv87)f1、msk326和cv87一起移栽至大田，進行不同施氮量的小區比較試驗。采用裂區試驗設計，品種(msk326/(msk326×cv87)f1、(msk326×cv87)f1、msk326、cv87)為主處理，施氮量(0、2.5、4.5、6.5kg/畝)為副處理。其中施氮量6.5kg/畝為目前大田生產上msk326正常施氮量，施氮量2.5kg/畝為cv87正常施氮量。各處理氮磷鉀配比均為1∶1.5∶3。每小區種植80株，3次重復。行距和株距分別為120cm和60cm。四周設置保護行。其它栽植方法和大田管理按照當地烤煙生產技術要求進行。成熟摘葉采收，密集式烤房烘烤。烘烤結束后除施氮量0kg/畝處理外，各品種均按小區計產計質，各處理分別取中部葉混合樣和上部葉混合樣測定煙堿含量，同時各品種取c3f等級煙樣進行評吸鑒定。試驗過程中，在每個品種中選用施氮量6.5kg/畝的處理，選取均勻一致的5株煙進行定株，按生育進程采集根、莖、葉(成熟一片采一片)、頂和杈等進行殺青、烘干、稱重，并分別測定其n含量，以施氮量0kg/畝處理為不施氮肥的空白對照，采用差減法測算各品種的氮利用率。此外，還將msk326/(msk326×cv87)f1、(msk326×cv87)f1、msk326和cv87煙苗移栽入黑脛病病圃和病毒病病圃，均采用隨機區組設計，3次重復，每小區20株，以進行黑脛病和tmv抗性接種鑒定，同時田間調查氣候斑點病發病情況。上述試驗結果分別列于表7、表8和表9。
試驗結果表明，嫁接改良煙株對黑脛病、tmv和氣候斑點的抗性均較接穗品種msk326有明顯改善。嫁接改良煙株的氮利用率也比接穗品種msk326明顯提高，與作為砧木的(msk326×cv87)f1的氮利用率相近，又比砧木(msk326×cv87)f1的父本cv87的氮利用率有所降低。從經濟性狀來看，接穗品種在畝施氮量6.5kg時綜合經濟性狀表現最好，但上部煙葉中煙堿含量超出適宜范圍3.5％；而嫁接改良煙株在畝施氮量4.5kg時綜合經濟性狀表現最好，且與接穗品種在畝施氮量6.5kg時的綜合經濟性狀表現相當，此時中部葉和上部葉煙堿含量都處于適宜范圍，接近最佳值2.5％，隨著施氮量增加，嫁接改良煙株因煙葉落黃成熟變得困難而經濟性狀變差，上部葉煙堿含量也遠離最佳值。從評吸質量來看，嫁接改良煙株與接穗品種msk326相當。由上可見，在保障煙葉品質風格和綜合經濟性狀的情況下，嫁接改良煙株綜合抗病性得到了改善，氮利用率得到了提高，而施氮量明顯降低，上部葉煙堿含量也明顯降低且更趨于適宜。
表7各品種的氮利用率與病情指數
表8各品種的不同施氮量經濟性狀表現與煙堿含量
表9各品種的評吸結果
實施例四：利用種質材料cv87改良烤煙品種ms云煙87
烤煙品種ms云煙87煙葉品質優良，深受卷煙工業喜愛，長期的田間表現情況觀察和鑒定結果表明，烤煙品種ms云煙87中抗根莖類病害黑脛病，但易感葉面性病害tmv、pvy、赤星病和氣候斑點病，田間表現極度耐肥，需氮量高，加之近些年來要求去除部分上部葉和部分下部葉，導致有效留葉數較少，進而造成上部煙葉煙堿含量偏高，工業可用性下降。而常規種質材料cv87根系非常發達，抗旱抗倒伏，兼抗根莖類病害黑脛病和葉面性病害tmv、pvy、赤星病和氣候斑點病，但因氮肥利用率非常高而對氮肥非常敏感，不易烘烤，且煙葉中煙堿含量偏低。
在海南三亞南繁基地，同時種植烤煙品種ms云煙87和種質材料cv87，并于元月份盛花期以ms云煙87為母本，以cv87為父本進行雜交，得到雜交組合f1代種子，記作(ms云煙87×cv87)f1。
將得到的(ms云煙87×cv87)f1以及ms云煙87和cv87在恩施州利川育種基地育苗大棚內進行漂浮育苗，育苗基質按草炭與珍珠巖體積比為2﹕1配制，每m3基質加50％多菌靈可濕性粉劑200g，氮、磷、鉀含量為15﹕15﹕15三元復合肥3kg，肥藥混合均勻。2月21日播種(ms云煙87×cv87)f1，3月3日播種ms云煙87和cv87。按煙草漂浮育苗技術要求進行苗期管理。
各品種于播種后10-12天開始出苗。4月25-30日進行嫁接。砧木材料(ms云煙87×cv87)f1選取苗齡45-55天，莖高4.0-6.0cm，直徑0.20-0.40cm的健壯無病的煙苗作為砧木。接穗品種ms云煙87選取苗齡40-50天，莖高3.5cm以上，直徑0.15-0.25cm的健壯無病的煙苗作為接穗。在早上或下午采用合接法嫁接。去除砧木的生長點，從上向下斜切一刀，切面長為0.8-1.2cm；接穗切除根部并去除較大地葉片，僅保留1葉1心，然后在近子葉節處同樣斜切一刀，切面長度與砧木切面長度保持一致；使用塑料套管嫁接，將砧木的切面朝上插進套管，再把接穗的煙苗切面朝下插進套管中，使砧木與接穗的切面緊緊貼合在一起。嫁接煙株記作ms云煙87/(ms云煙87×cv87)f1。
嫁接時注意嫁接工具需用酒精消毒，嫁接人員的手需清洗干凈。嫁接結束后，將嫁接煙株移入愈合養護室。前3天注意遮光，保溫、保濕，控制空氣濕度在80％以上，溫度20-28℃。3天后通風和見光，控制空氣濕度以接穗不萎蔫為基準，至完全愈合，7-10天后移出養護室，并去除塑料套管。
5月11日，將ms云煙87/(ms云煙87×cv87)f1、(ms云煙87×cv87)f1、ms云煙87和cv87一起移栽至大田，進行不同施氮量的小區比較試驗。采用裂區試驗設計，品種(ms云煙87/(ms云煙87×cv87)f1、(ms云煙87×cv87)f1、ms云煙87、cv87)為主處理，施氮量(0、2.5、4.5、6.5kg/畝)為副處理。其中施氮量6.5kg/畝為目前大田生產上ms云煙87正常施氮量，施氮量2.5kg/畝為cv87正常施氮量。各處理氮磷鉀配比均為1∶1.5∶3。每小區種植80株，3次重復。行距和株距分別為120cm和60cm。四周設置保護行。其它栽植方法和大田管理按照當地烤煙生產技術要求進行。成熟摘葉采收，密集式烤房烘烤。烘烤結束后除施氮量0kg/畝處理外，各品種均按小區計產計質，各處理分別取中部葉混合樣和上部葉混合樣測定煙堿含量，同時各品種取c3f等級煙樣進行評吸鑒定。試驗過程中，在每個品種中選用施氮量6.5kg/畝的處理，選取均勻一致的5株煙進行定株，按生育進程采集根、莖、葉(成熟一片采一片)、頂和杈等進行殺青、烘干、稱重，并分別測定其n含量，以施氮量0kg/畝處理為不施氮肥的空白對照，采用差減法測算各品種的氮利用率。此外，還將ms云煙87/(ms云煙87×cv87)f1、(ms云煙87×cv87)f1、ms云煙87和cv87煙苗移栽入黑脛病病圃和病毒病病圃，均采用隨機區組設計，3次重復，每小區20株，以進行黑脛病和tmv抗性接種鑒定，同時田間調查氣候斑點病發病情況。上述試驗結果分別列于表10、表11和表12。
試驗結果表明，嫁接改良煙株對黑脛病的抗性與接穗品種ms云煙87相當，但對tmv和氣候斑點的抗性均較接穗品種有明顯改善。嫁接改良煙株的氮利用率也比接穗品種ms云煙87明顯提高，與作為砧木的(ms云煙87×cv87)f1的氮利用率相近，又比砧木(ms云煙87×cv87)f1的父本cv87的氮利用率有所降低。從經濟性狀來看，接穗品種在畝施氮量6.5kg時綜合經濟性狀表現最好，但上部煙葉中煙堿含量超出適宜范圍3.5％；而嫁接改良煙株在畝施氮量4.5kg時綜合經濟性狀表現最好，且與接穗品種在畝施氮量6.5kg時的綜合經濟性狀表現相當，此時中部葉和上部葉煙堿含量都處于適宜范圍，接近最佳值2.5％，隨著施氮量增加，嫁接改良煙株因煙葉落黃成熟變得困難而經濟性狀變差，上部葉煙堿含量也遠離最佳值。從評吸質量來看，嫁接改良煙株與接穗品種ms云煙87相當。由上可見，在保障煙葉品質風格和綜合經濟性狀的情況下，嫁接改良煙株綜合抗病性得到了改善，氮利用率得到了提高，而施氮量明顯降低，上部葉煙堿含量也明顯降低且更趨于適宜。
表10各品種的氮利用率與病情指數
表11各品種的不同施氮量經濟性狀表現與煙堿含量
表12各品種的評吸結果