專利名稱：：促進蘭科植物種子萌發的三株真菌菌株的制作方法
技術領域：
：本發明涉及生物工程
技術領域：
，具體說涉及促進蘭科植物種子萌發的三株真菌菌株，能夠與蘭科植物種子伴播，用于育苗盤或花盆或苗床的育苗或大田的栽培。
背景技術：
：蘭科植物中有很多傳統名貴中藥，比如石斛，白芨等。根據《中國藥典》2005版的記載，石斛具有益胃生津、滋陰清熱的功效，還能利咽明目，調節人體免疫功能。白芨以塊莖入藥，具有收斂止血、消腫生肌等功效，主治咳血吐血，外傷出血，瘡瘍腫毒，皮膚皸裂，肺結核咳血、潰瘍病出血，同時還能治療尿血、便血等癥。藥用石斛的記載始見于《神農本草經》，被列為上品，是"九大仙草"之首。可作藥用的蘭科石斛屬植物有30多種，目前國內鐵皮石斛、金釵石斛、束花石斛，齒瓣石斛、鼓槌石斛等一些名貴的藥用石斛資源奇缺，其中鐵皮石斛("e/7rfroZit/忍ca/7力'&歷Wall,exLindl)的自然資源已瀕臨枯竭，該植物己被列入國家保護植物名錄，而其昂貴的價格更加劇了對其資源的毀滅性破壞。石斛屬植物的自然繁殖率低，生長緩慢，這也是導致其資源瀕危的一個重要因素。白芨目前基本上依靠采集野生藥材經加工后供藥用。由于需求量的增加，導致藥農對野生資源大量采挖，野生資源在不斷減少，產量在不斷下降，價格卻一直在不斷增長，目前已經處于瀕危狀態。為了實現對瀕危物種的保護和應用的雙重目的，在拯救和保護珍稀瀕危物種的同時，還要對物種所在的整個生態系統進行研究，以利于資源的可持續利用。蘭科藥用植物種子的田間萌發一直是一個難題，尤其是石斛種子的田間萌發國內外尚無人研究。研究石斛屬種子的萌發以及真菌在種子萌發過程中所起的作用，是石斛屬植物資源保護的一個重要內容。關于石斛屬植物的栽培技術研究目前已有一些報道，利用組織培養的方法已經能夠獲得栽培用的幼苗，并在云南省和浙江省等地有小規模的栽培。但是在實際應用中，使用組培快繁獲得的無菌苗進行栽培時，練苗和移栽兩個環節不僅從技術上，也從生產成本上限制了該方法的推廣應用。在這方面技術未獲得突破之前，石斛屬植物還難以實現大面積的栽培生產。關于白芨的栽培技術目前僅有散見的報道，但是都缺乏系統的研究，而且沒有大面積栽培基地出現，傳統的依靠野生植株無性繁殖的方法進行栽培目前還有很多問題需要解決。野生變家種需要一段較長的馴化過程，但是目前還未見有此方面的報道。使用組織培養的方法解決瀕危植物的繁殖和種質保存問題是一條有效的途徑，目前，巳經有一些單位開展了種子，莖尖及側芽，假鱗莖的組織培養和快速繁殖研究，能夠在一段時間內獲得無菌苗，但是練苗和移栽是一個限制其應用的難題，目前還沒有有效的練苗移栽方法，這方面技術獲得突破后，才可能得到實際的應用。另外，白芨作為一種常用的中藥，其發生療效的作用基礎往往是復合化學成分的共同作用，而無菌苗在繁殖中由于激素或其他因素作用，可能導致內部成分發生變異，這種變異在培養中往往不易辨認，因此無菌苗栽培得到的植株，其成分含量有無變化，能否代替藥材使用，也是有待研究的課題。蘭科植物的種子被稱為"灰塵種子"，具有以下特點種子細小，種子量巨大，每個蒴果內有幾萬到幾十萬粒種子，在自然界很難萌發，只有依靠適合的真菌為其提供營養才能夠萌發。找到能促進蘭科藥用植物種子萌發的真菌，并利用互作技術使種子能夠在自然條件下萌發，是實現蘭科藥用植物田間栽培的有效方法。目前，國內外有關促進蘭科藥用植物種子萌發真菌的研究報道很少，還沒有發現能促進種子萌發優良真菌。近幾年，我們使用新的真菌分離技術，分離到了對蘭科藥用植物種子萌發有促進作用的真菌。與種子的無菌萌發和組織培養相比，種子與真菌的共生萌發能解決蘭科藥用植物種子的田間應用難題，從而減少生產環節，降低生產成本，具有巨大的應用價值。
發明內容本發明的目的是提供能夠促進蘭科植物種子萌發的三株真菌菌株。為解決蘭科植物某些種的瀕危現狀提供一條新的途徑。本發明采用的3株真菌經鑒定分別為絲核菌屬真菌Bsgll(朋/卵"o/w'asp.)，保藏編號CGMCCNo.2450，膠膜菌屬真菌Bsgl4(7WaOTe77asp.),保藏編號CGMCCNo.2451，這2株真菌于2008年4月14日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，小菇屬真菌MF24(補ce朋sp.)，保藏編號CGMCCNo.1350，該菌株于2005年4月20日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏單位地址北京市朝陽區大屯路甲3號，中國科學院微生物研究所。3株真菌的保藏和存活證明見附件。三株真菌的培養特性分別為Bsgll:在PDA培養基上，菌落圓形，初期菌落白色，后期正面和背面都為淺黃色，氣生菌絲不發達，25。C生長一周的菌落直徑為8.8厘米，常規培養基上不產生孢子。Bsgl4:在PDA培養基上，初期和后期的菌落都為白色，菌落圓形，氣生菌絲不發達，25"C生長一周的菌落直徑為6.8厘米，常規培養基上不產生孢子。MF24:在PDA培養基上，初期和后期的菌落都為白色，菌落圓形，氣生菌絲較發達，25r生長一周的菌落直徑為5.5厘米，常規培養基上不產生孢子。本發明所述三株真菌的內轉錄間隔區核糖體DNA的序列如序列表所示。本發明所述三株真菌具有與蘭科植物種子互作使種子共生萌發的作用，蘭科植物種類可以為鐵皮石斛，兜唇石斛，黑毛石斛，束花石斛，齒瓣石斛，白芨。本發明所述三株真菌可以用于蘭科植物種子共生萌發的研究，也可以與蘭科植物種子伴播，用于育苗盤或花盆或苗床的育苗或大田的栽培。本發明的有益效果是-本發明所述的真菌菌株具有與部分蘭科植物種子互作而使其共生萌發的生理活性，有助于解決蘭科植物種子在田間難于萌發的問題，能夠為蘭科植物資源的保護和可持續利用以及繁殖和栽培提供一個有力的工具，具有巨大的應用價值。具體實施方式實施例l萌發真菌的分離在白芨和石斛的適宜生長環境中播種種子，獲得種子、原球莖和幼苗，經過對萌發材料表面消毒后分離篩選得到萌發真菌。實施例2Bsgl4對鐵皮石斛種子的萌發效果把鐵皮石斛種子播種到已經長滿Bsgl4真菌菌絲的麥麩、樹葉和鋸末上，以滅菌的麥麩、樹葉和鋸末上播種種子為對照，在培養室中培養，培養溫度為23-27'C，每日光照12小時，光照強度為1200Lx,兩個月時調查種子萌發情況，結果為接種Bsgl4真菌處理的鐵皮石斛種子萌發率為67.3%，不接真菌處理的鐵皮石斛種子萌發率為0.0%。實施例3Bsgl4對鐵皮石斛種子的萌發效果把鐵皮石斛種子播種到已經長滿Bsgl4真菌菌絲的麥麩、樹葉和鋸末上，以滅菌的麥麩、樹葉和鋸末上播種種子為對照，在溫室中培養，培養溫度為15-26'C,自然光照，每日光照時間為8-IO小時，兩個月時調查種子萌發情況，結果為接種Bsgl4真菌處理的鐵皮石斛種子萌發率為65.1%，不接真菌處理的鐵皮石斛種子萌發率為0.0%。實施例4Bsgl4對鐵皮石斛種子的萌發效果把真菌菌絲接種到麥麩、樹皮和鋸末上，待長滿菌絲后，把以上接菌材料撒到大田，在這些菌材上播種種子，然后覆蓋一層枯枝落葉，保持濕度；以不接種真菌，其他條件相同的處理為對照，三個月時調査種子萌發情況，結果為接種Bsgl4真菌處理的鐵皮石斛種子萌發率為56.9%，不接真菌處理的鐵皮石斛種子萌發率為0.0%。實施例5Bsgl4對白芨種子的萌發效果把白芨種子播種到已經長滿Bsgl4真菌菌絲的麥麩、土壤和鋸末上，以滅菌的麥麩、土壤和鋸末上播種為對照，在溫室中培養，培養溫度為15-26'C,自然光照，每日光照時間為8-10小時，三個月時調查萌發率，結果為接種Bsgl4真菌處理的白芨種子萌發率為61.2%，不接真菌處理的白芨種子萌發率為O.0%。實施例6Bsgll對白芨種子的萌發效果把白芨種子播種到己經長滿Bsgll真菌菌絲的麥麩、土壤和鋸末上，以滅菌的麥麩、土壤和鋸末上播種為對照，在溫室中培養，培養溫度為15-26'C，自然光照，每日光照時間為8-10小時，三個月時調查萌發率，結果為接種Bsgl4真菌處理的白芨種子萌發率為45.2%，不接真菌處理的白芨種子萌發率為O.0%。實施例7MF24對白芨種子的萌發效果把白芨種子播種到已經長滿MF24真菌菌絲的麥麩、土壤和鋸末上，以滅菌的麥麩、土壤和鋸末上播種為對照，在溫室中培養，培養溫度為15-26'C，自然光照，每日光照時間為8-10小時，三個月時調查萌發率，結果為接種Mf24真菌處理的白芨種子萌發率為36.9%，不接真菌處理的白芨種子萌發率為O.0%。實施例6Bsgl4對束花石斛種子的萌發效果把束花石斛種子播種到已經長滿Bsgl4真菌菌絲的麥麩、樹葉或鋸末上，以滅菌的麥麩、樹葉或鋸末上播種為對照，在溫室中培養，培養溫度為15-26'C,自然光照，每日光照時間為8-10小時,兩個月時調査種子萌發情況，結果為接種Bsgl4真菌處理的束花石斛種子萌發率為73.2%，不接真菌處理的束花石斛種子萌發率為0.0%。實施例7Bsgl4對齒瓣石斛種子的萌發效果把齒瓣石斛種子播種到已經長滿Bsgl4真菌菌絲的麥麩、樹葉或鋸末上，以滅菌的麥麩、樹葉或鋸末上播種為對照，在溫室中培養，培養溫度為15-26'C,自然光照，每日光照時間為8-10小時，兩個月時調査種子萌發情況，結果為接種Bsgl4真菌處理的齒瓣石斛種子萌發率為65.1%，不接真菌處理的齒瓣石斛種子萌發率為0.0%。實施例8Bsgl4對兜唇石斛種子的萌發效果把兜唇石斛種子播種到已經長滿Bsgl4真菌菌絲的麥麩、樹葉或鋸末上，以滅菌的麥麩、樹葉或鋸末上播種為對照，在溫室中培養，培養溫度為15-26'C，自然光照，每日光照時間為8-10小時,兩個月時調查種子萌發情況，結果為接種Bsgl4真菌處理的兜唇石斛種子萌發率為16.4%，不接真菌處理的兜唇石斛種子萌發率為0.0%。實施例9Bsgl4對黑毛石斛種子的萌發效果把黑毛石斛種子播種到巳經長滿Bsgl4真菌菌絲的麥麩、樹葉或鋸末上，以滅菌的麥麩、樹葉或鋸末上播種為對照，在溫室中培養，培養溫度為15-26'C,自然光照，每日光照時間為8-10小時，兩個月時調查種子萌發情況，結果為接種Bsgl4真菌處理的黑毛石斛種子萌發率為85.4%，不接真菌處理的黑毛石斛種子萌發率為0.0%。比較例l光照對真菌Bsgl4與鐵皮石斛種子共生萌發的影響采用菌葉法進行實驗，把真菌接種到滅菌的栗樹葉上，待樹葉表面長滿菌絲后把鐵皮石斛種子播種到樹葉表面，于25土2'C的環境中共培養。光照條件設以下2種處理(1)光照培養光照強度為1200Lx，光周期為12小時。在此條件下，與真菌Bsgl4共生培養的處理組記作L，不接真菌的對照組記作LCK。(2)黑暗培養在此條件下，與真菌Bsgl4共生培養的處理組記作D，不接真菌的對照組記作DCK。以上各組均設4次重復。從培養的第l周開始，每周調查各組種子的萌發率。結果見表l。表l.光照對真菌Bsgl4與鐵皮石斛種子共生萌發率的影響處理組萌發率(％)第l周第2周第3周第4周第5周第6周第7周第8周第9周第10周00007.1628.1560.8467.2867.2867.28LCK0000000000D00004.4216.2335.8969.472.6772.67DCK0000000000光照能夠促進真菌與鐵皮石斛種子的共生萌發，表現為在種子萌發初期L處理組的萌發率高于D處理組，培養第7周時，L處理組的萌發率極顯著高于D處理組(PO.01);黑暗更有利于鐵皮石斛種子的萌發，表現為D處理組的最終萌發率高于L處理組，培養第10周時，D處理組的萌發率顯著的高于L處理組的萌發率。繼續培養觀察發現，黑暗條件下萌發的種子不能形成幼苗，而光照條件下的萌發的種子在2-3個月就可以形成幼苗。鐵皮石斛種子不能在無菌的樹葉上萌發，表明菌葉法中真菌Bsgl4是誘導鐵皮石斛種子萌發的唯一因素，說明真菌Bsgl4具有促進鐵皮石斛種子萌發的生理功能。比較例2光照對真菌Bsgl4與白芨種子共生萌發的影響采用菌葉法進行實驗，把滅菌的栗樹葉置于真菌培養基表面，接種真菌，樹葉表面長滿菌絲后把白芨種子播種在樹葉表面，于25士2'C的環境中共培養。光照條件設以下2種處理(1)光照培養光照強度為1200Lx，光周期為12小時。在此條件下，與真菌Bsgl4共生培養的處理組記作L，不接真菌的對照組記作LCK。(2)黑暗培養在此條件下，與真菌Bsgl4共生培養的處理組記作D，不接真菌的對照組記作DCK。以上各組均設4次重復。從培養的第l周開始，每周調査各組種子的萌發率。結果見表2。表2.光照對真菌Bsgl4與白芨種子共生萌發率的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>光照能夠促進真菌與白芨種子的共生萌發，表現為在種子萌發初期L處理組的萌發率高于D處理組，培養第6周時，L處理組的萌發率顯著高于D處理組(PO.05);最終萌發率仍然是L處理組高于D處理組，培養第8周時，L處理組的萌發率高于D處理組的萌發率。白芨種子不能在無菌的樹葉上萌發，表明菌葉法中真菌Bsgl4是誘導白芨種子萌發的唯一因素，說明真菌Bsgl4具有促進白芨種子萌發的生理功能。比較例33株真菌對白芨種子萌發的影響。該實驗與比較例2的試驗時間及所用的種子不同。實驗方法為把白芨種子播種到已經長滿真菌菌絲的樹葉上，真菌選用三種，分別為Bsgl4，Bsgll，MF24。以無菌的樹葉上播種為對照，在溫室條件下培養，培養溫度為20-27'C，從培養的第l周開始，每周調査各組種子的萌發情況，結果見表3。以上每種處理重復4次。表3.3株真菌對白芨種子萌發率的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>3種真菌菌株都對白芨種子有很好的萌發效果。不加真菌的對照組種子萌發率始終為0%，而加入真菌以后的試驗處理組都有很高的萌發率，萌發的速度也很快，在第8周達到了最大萌發率。不同真菌菌株與白芨種子互作使白芨種子共生萌發的效果有些差別，3株真菌中，Bsgl4促進白芨種子萌發的效果最好，種子的最終萌發率最高，而且萌發的速度較快。三株真菌的內轉錄間隔區核糖體DNA的序列，又稱為ITS序列，分別如下Bsgll:60120180240300360420480540AAATTTTAAAATCTGATCTCAAATCAGGTAGGACTACCCGCTGAACTTAABsgl4:60120180240300360420480GCTCGCGTCACCAAGTCCTCGTCCTTTGGGATGCTGMF24:60120180240300360420480540權利要求1、促進蘭科植物種子萌發的三株真菌菌株，它們的分類命名分別為保藏編號為CGMCCNo.2450的絲核菌屬真菌Bsg11(Rhizoctoniasp.)，保藏編號為CGMCCNo.2451的膠膜菌屬真菌Bsg14(Tulasnellasp.)和保藏編號為CGMCCNo.1350的小菇屬真菌MF24(mycenasp.)，三株真菌的保藏單位是中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。2、如權利要求1所述的3株真菌，其特征在于它們的內轉錄間隔區核糖體DNA的序列，又稱為ITS序列，如下Bsgll:60120180240300360420480540AAATTTTAAAATCTGATCTCAAATCAGGTAGGACTACCCGCTGAACTTAABsgl4:60120180240300360420480GCTCGCGTCACCAAGTCCTCGTCCTTTGGGATGCTGMF24:601201802403003603、如權利要求1所述的3株真菌的用途，其特征在于蘭科植物可以為鐵皮石斛，兜唇石斛，黑毛石斛，束花石斛，齒瓣石斛，白芨。4、如權利要求1所述的3株真菌，其特征在于可以用于蘭科植物種子共生萌發的研究，或與蘭科植物種子伴播，用于育苗盤或花盆或苗床的育苗或大田的栽培。全文摘要本發明公開了促進蘭科植物種子萌發的三株真菌菌株，它們的分類命名分別為保藏編號為CGMCCNo.2450的絲核菌屬真菌Bsg11(Rhizoctoniasp.)，保藏編號為CGMCCNo.2451的膠膜菌屬真菌Bsg14(Tulasnellasp.)和保藏編號為CGMCCNo.1350的小菇屬真菌MF24(Mycenasp.)，上述三株有效真菌菌株對于解決蘭科植物種子的萌發問題具有重要意義；這三株有效真菌菌株可以與蘭科植物種子伴播，用于育苗盤或花盆或苗床的育苗或大田的栽培，具有代替組織培養獲得種苗的應用價值。文檔編號A01P21/00GK101565676SQ20081009395公開日2009年10月28日申請日期2008年4月24日優先權日2008年4月24日發明者房慧勇,肖培根,郭順星,陳曉梅申請人:中國醫學科學院藥用植物研究所