專利名稱：：農桿菌介導的中國小麥品種新春9號幼胚的遺傳轉化方法
技術領域：
：本發明涉及農桿菌介導的中國小麥品種新春9號幼胚的遺傳轉化方法。
背景技術：
：自1997年Cheng等首次利用農桿菌介導法轉化小麥獲得了轉基因植株，農桿菌轉化已逐步成為小麥功能基因組學研究的重要工具。與基因槍轉化相比，農桿菌轉化具有以下優勢目的基因多為單拷貝或低拷貝；插入邊界多為T-DNA左右邊界，重排率低;容易排除冗余的質粒DNA序列；容易獲得無選擇標記的轉基因植株(Cheng等，2004;Jones，2005;Wu等，2006)。與其他農作物相比，小麥農桿菌轉化比較困難且進展緩慢。近年來，世界各國不同的研究小組從小麥基因型、外植體的選擇和預處理、農桿菌菌株，Ti質粒、雙元載體及接種和共培養條件等方面，進行了一系列的探索和研究。目前，小麥農桿菌可轉化基因型已報道的主要有Bobwhite(春)，Cadenza(春)，Florida(冬)，Fielder(春)，Veery-5(春)，Vesna(春)等。外植體類型主要有新鮮幼胚，預培養1-6天的幼胚，培養14天的胚性愈傷及芽尖和成熟胚愈傷組織(Jones等，2005)。對Cadenza(春)、Florida(冬)新鮮幼胚和預培養1-6天的胚性愈傷進行轉化研究后發現，新鮮幼胚具有較好的再生和轉化效率(Wu等，2003)。農桿菌菌株和雙元載體主要有C58-ABI(pM0N18365)，C58-ABI(pM0N30139)，C58-CI(pPTN155)，LBA4404(pHK21)和AGL1(pAL154/pAL156)，AGL0(pBGXI)等，其中，AGL0和AGL1菌株因為還含有致毒力較強的Ti質粒pTiBo542，所以對寄主的侵染和致瘤能力更強(Cheng等，1997)。Khanna等(2003)通過構建超級雙元表達載體服21和在培養基中加入多胺類化合物，轉化效率達到了1.2-3.9%。Cheng等(2003)認為農桿菌感染后對外植體進行干燥處理可顯著提高T-DNA轉運水平和轉化效率。值得指出的是，Hu等(2003)對基因槍法和農桿菌法轉化小麥進行了同步比較，表明農桿菌轉化效率明顯高于基因槍法，而且農桿菌法獲得的單拷貝整合植株比率顯著多于基因槍法，并將EPSPS基因導入了小麥品種Bobwhite。到2007年1月為止與小麥遺傳轉化方法有關的國內外專利共計29項，包括有關基因槍轉化方法的4項，農桿菌轉化方法的8項，原生質體轉化方法的2項，其他轉化方法的15項。根據專利保護的地域分類，包括國際專利8項，美國專利14項，中國專利3項，日本專利1項，英國專利1項，墨西哥專利l項。按照專利保護的內容主要包括五個方面，轉化受體組織的選擇(包括小麥幼胚愈傷組織、芽尖、成熟胚愈傷組織、中胚軸分裂組織外植、懸浮細胞系體、分裂能力強的全能細胞等)；培養基成分的調整(包括利用硫辛酸提高愈傷組織的再生能力，增加培養基中銅離子含量等)；轉基因再生組織的優化；新型選擇標記的使用(包括氨腈水合酶基因的利用，草甘膦除草劑抗性基因的利用等)；新型表達載體的構建(包括將小麥基因組序列插入表達載體，利用同源重組提高轉化效率)。目前，小麥農桿菌轉化多采用LBA4404和C58普通農桿菌菌株，轉化頻率較低(0.01-0.5%)，個別轉化事件效率高但重現性差。同時，由于小麥基因型、外植體類型和生理狀態對轉化效率影響較大，適宜轉化的外國品種又難以在中國直接利用和進行品種改良，因此，引進國外小麥高效農桿菌轉化技術，建立中國小麥品種農桿菌轉化體系并加以完善，對我國小麥功能基因組學研究和特異基因資源利用及小麥商業化生產是十分必要的。新春9號為優質強筋面包春小麥品種，具有較好的組培特性，主要種植在我國新疆和寧夏春麥區。
發明內容本發明的一個目的是提供一種轉化中國小麥品種新春9號的方法。本發明所提供的轉化中國小麥品種新春9號的方法，包括如下步驟用目的農桿菌侵染中國小麥品種新春9號的幼胚，再進行共培養，將目的基因導入小麥幼胚；所述目的農桿菌為將目的基因導入根癌農桿菌菌株AGL1得到的。所述幼胚為授粉12-14天后的心型胚。所述侵染可以包括如下步驟將所述幼胚盾片朝上放置于接種培養基上，再向其中倒入所述目的農桿菌菌液(OD為1.0-1.5),在黑暗條件下浸泡0.5-1.5小時；所述菌液中含有終濃度為0.015%的表面活性劑和終濃度為300-500uM的乙酰丁香酮，所述百分含量為體積百分含量；所述乙酰丁香酮的終濃度優選為400uM;所述浸泡的時間優選為lh。所述共培養的方法可以包括如下步驟將所述侵染后的幼胚置于共培養培養基中，在22-25°C的溫度下暗培養1-3天;所述共培養培養基中包括終濃度為4-10mg/L的氨氯吡啶酸；所述共培養的時間優選為3天；所述氨氯吡啶酸的終濃度優選為10mg/L。本發明的另一個目的是提供一種培育中國小麥品種新春9號的轉基因小麥的方法。本發明所提供的培育中國小麥品種新春9號的轉基因小麥的方法，包括如下步驟用上述任一種方法將目的基因導入中國小麥品種新春9號的幼胚中，再進行誘導培養、再生培養、篩選培養，得到轉基因小麥。所述誘導培養可以包括如下步驟將所述共培養后的幼胚置于誘導培養基中，在22-25'C溫度下暗培養1-4周；所述誘導培養基中包括終濃度為150-170mg/L的特美汀和終濃度為1-2.5mg/L的氨氯吡啶酸；所述氨氯吡啶酸的終濃度優選為2.5mg/L;所述誘導培養的時間優選為3周。所述再生培養可以包括如下步驟將經過所述誘導培養后的幼胚置于再生培養基中，在溫度為22-25。C、光照強度為700-800uEs—'m—2、光照時間為14-18h/d的條件下培養2-4周；所述再生培養基中包括終濃度為150-170mg/l的特美汀；所述培養的條件優選為所述光照強度為750uEs—V2，所述光照時間為16h/d，所述培養的時間為3周。所述目的基因可以是通過插入載體pGreen的多克隆位點形成重組載體導入根癌農桿菌AGL1中的。所述篩選培養可以包括如下步驟將經過所述再生培養的幼胚置于篩選培養基中，在溫度為22-25。C、光照強度為700-800"Es—'m—2、光照時間為14-18h/d的條件下培養2-4周；所述篩選培養基中包括終濃度為2-4mg/L的草丁膦和終濃度為150-170mg/l的特美汀；所述培養的條件優選為所述光照強度為750uEs—V2，所述光照時間為16h/d，所述培養的時間為3周。所述方法還可以包括如下步驟將經過所述篩選培養的存活植株移至恢復培養基中，在為22-25。C、光照強度為700-800uEs-'nf2、光照時間為14-18h/d的條件下培養2-4周；所述恢復培養基中包括終濃度為150-170mg/l的特美汀；所述光照強度優選為750uEs—V2，所述光照時間優選為16h/d，所述培養的時間優選為3周。本發明建立的新春9號幼胚農桿菌轉化體系，轉化效率高，可達3.1%，重復性好。本發明方法對Picloram在共培養和誘導培養基中的濃度對愈傷組織再生的影響進行了研究，結果表明，共培養和誘導培養基中Picloram的濃度分別為4-10mg/l和2-2.5mg/l時，經農桿菌侵染后的幼胚愈傷組織再生頻率大大提高。因此，本發明方法對我國小麥品種的遺傳改良、完善小麥種質等具有十分重要的意義。圖1為共培養基和誘導培養基中Picloram的濃度分別為2mg/1和lmg/1時，幼胚愈傷組織的再生情況。圖2為共培養和誘導培養基中Picloram的濃度分別為4-10mg/l和2-2.5mg/l時，幼胚愈傷組織的再生情況。圖3為GUS在轉化植株的胚狀體、幼芽、葉子、花藥和花粉中的穩定表達。圖4為農藝性狀表現正常的轉基因植株在溫室中生長情況。圖5為Bar基因的PCR擴增結果。圖6為WW基因的PCR擴增結果。具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明均為常規方法。實施例1、農桿菌介導的中國小麥品種新春9號的遺傳轉化一、實施例中用到的培養基及其組成如表l、表2和表3所示<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>表2、再生、篩選和恢復培養基的組成成分<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>表3、MG/L培養基的組成(每升)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>其中，各成分的配制方法如下1、MSMacrosalts(xlO):16.5g/1NH4N03(FisherScientificUK,Leicestershire,UK)19.0g/1K亂(Sigma-Aldrich,Dorset,UK)1.7g/1KH2P0々(FisherScientificUK)3.7g/1MgS04.7H20(FisherScientificUK)4.4g/1CaCl2.2H20(FisherScientificUK)12rC高壓滅菌20min，4t:保存。2、MSVitamins(xlOOO):0.1.g/1ThiamineHCl(Sigma-Aldrich)，0.5g/1PyridoxineHCl(Sigma-Aldrich)，0.5g/1Nicotinicacid(Sigma-Aldrich).抽濾，4'C保存。3、L7Microsalts(xlOOO):15.0g/1MnS04(FisherScientificUK)5.0g/1H3B03(FisherScientificUK)7.5g/1ZnS04.7H20(FisherScientificUK),0.75g/1KI(FisherScientificUK)0.25g/1Na2Mo04.2H20(VWRInternationalUd.，Leicestershire,UK)100．025g／lCuSO。．5H20(FisherScientificUK)0．025g／1CoCl2．6H20(Sigma—Aldrich)每次準備lOOml，抽濾后4℃保存。4、MSVitamins／Inosit01(x200)40．0g／1myo—Inositol(Sigma—Aldrich)，2．0g／lThiamineHCI，0．2g／lPyridoxineHCI，0．2g／1Nicotinicacid，0．2g／1Ca—Pantothenate(Sigma—Ald,、ich)，0．2g／1Asco]’biCacjd(Sigma…A1d1’ich)．抽濾后，分裝成lOml，20℃保存。5、2，，1一Dichloropllenoxyaceticacid(2，4一D)(Sigma—Aldrich)用70％乙醇溶解，至終濃度為1mg／ml。捕濾后，分裝成1IIli，一20~C保存。6、ZeatinmixedisomeI，s(Sigma，一A]_drich)將1OOmgZeatin溶解在ImliMHC]，無菌水定容到lOm]，使Zeatin的終濃度為10mg／ml。抽濾后，分裝成lml，一20。C保存。7、Picloi、aIll(hng／m1)(Sigma—Ai&’ict。1)lOOmgPiclmc、anl溶解在少量無菌水中，幾滴1MNa，Ot{助溶，定容到OOm]。抽濾后，分裝成2ml，一20~C保存。二、遺傳轉化步驟1、重組農桿菌的構建選用農桿菌菌株為根癌農桿菌菌株AGLl。載體pALl54~NpGreen-UB—UG，是由J工C基于pSoup／pGreen~載體系統發展而來(HellensRP，EdwardsEA，LeylandNR，BeanS，MullineauxPM．PgreenAversatileandflexiblebinaryTivectorforAgrobacteriugt-mediatedplanttransformation．Plant11101歷D-2000，42819-832。中國農業科學院作物科學研究所)。pALl54作為輔助質粒，除具有促進pGreen復制和擴增功能外，還含有額外的15一kb的Komari片段，大大增強和提高了菌株侵染和轉移Ti質粒的效率。pGreen—UB—UG含有一個T-DNA，這個T-DNA具有Bar和GUS基因的表達盒，均由Ubiquitin啟動子啟動表達(Christensen和Quail，1996)，其中因GUS基因還帶有Intron，在農桿菌中不能表達，因而減少了瞬時表達的假陽性，pGreen-UB-UG中還含有Bar抗性基因(抗草丁瞵)。將載體pAL154和pGreen-UB-UG通過電擊法導入農桿菌AGL1，電擊參數按Biorad公司電擊儀使用指南進行。陽性重組農桿菌的篩選將重組菌在含有200ug/ml羧芐青霉素和lOOug/ml的卡那霉素的培養基中培養三天，篩選得到含有載體pAL154和pGreen-UB-UG的重組農桿菌，命名為重組農桿菌AGLl/pAL154/pGreen。2、重組菌的培養及接種菌液的制備將重組農桿菌AGL1/pAL154/pGreen接種于MG/L培養基(表3)，進行培養，至其對數生長期；離心菌液，棄上清，收集菌體，然后用不含植物凝膠的接種培養基(如表l所示)重懸菌體，使菌液0D6。。值為1-1.5。3、受體材料和組織培養實驗表明，中國小麥品種新春9號在不接農桿菌的情況下，再生率可達100%。所以本發明以中國小麥品種新春9號的新鮮幼胚(心型胚)作為受體材料。將中國小麥品種新春9號(來源于國家種質資源庫)種植在可控溫室條件下，條件為18-2CTC/10-14°C(白天/黑夜)，光照為16/8小時(光/暗)，400W鈉燈，光強為750uEs—'111-2，濕度為50-70%。取授粉后12-14天的未成熟種子(其中含有心型胚)，在70%乙醇中浸泡30-60s，然后用10%次氯酸鈉Bleach(Lever)消毒15min,再用無菌水沖洗3-5次，在無菌條件下分離幼胚，幼胚大小一般為0.8-1.5mm。4、接種將步驟3獲得的新鮮剝離的幼胚盾片向上接種在含有植物凝膠的接種培養基上，然后向其中倒入步驟2獲得的接種菌液4ml，使幼胚浸泡在步驟2獲得的接種菌液中，同時向其中加入60ul1%(體積百分比)表面活性劑(Silwet-77)(Lehleseeds,USA)至其終濃度為0.015。/。(體積百分含量)，然后在黑暗條件下浸泡lh。接種培養基的組成如表1所示。5、共培養相對來講，在共培養和誘導培養基中添加Picloram要比添加2，4-D更能促進愈傷組織的再生，從而提高愈傷組織的再生頻率(BaiTO等，1999)。本實驗中對共培養和誘導培養基中Piclomm的濃度對幼胚愈傷組織再生的影響進行了檢測，共進行12次轉化實驗，每次重復3-4次，共培養和誘導培養基中Picloram的濃度設置如表4所示，其余轉化條件均相同。共培養將侵染后的外植體轉移到共培養培養基上，然后在22-25'C條件下暗培養3天。共培養的培養基如表1所示。其中，Picloram的濃度在12次不同的轉化實驗中不同(表4)。同時以未轉化的中國小麥品種新春9號的幼胚為對照。6、誘導培養將共培養3天后的外植體轉移到含有150mg/LTimentin(SmithklineBeecham,UK;Ticarcillin:clavulanicacid15:1)的誘導培養基中，然后在22-25。C暗培養3周，形成愈傷組織。誘導培養基的組成如表1所示，其中Picloram的濃度在12次不同的轉化實驗中不同(表4)。Timentin的作用是控制農桿菌的生長。7、再生培養將誘導培養形成的愈傷組織轉移到含有150mg/lTimentin的再生培養基(RDZ)中，然后在24-25°C、光照強度750uEs—'m—2、光照時間16h/d的條件下共培養3-4周，統計再生頻率。再生培養基的組成如表2所示，再生頻率的計算公式如下再生頻率=產生再生苗的愈傷數目/接種在接種培養基上的幼胚總數。結果如表4所示，結果表明，當共培養和誘導培養基中Picloram的濃度分別為2mg/1和lmg/1時，非轉化對照愈傷組織的再生頻率幾乎達到100%，但經農桿菌侵染后的幼胚愈傷組織再生頻率很低，兩次轉化試驗共7個處理，平均為14和27%(圖1和表4，圖1中A為未轉化的植株；B為已轉化的植株)；提高Picloram在共培養和誘導培養基中的濃度后，明顯提高了農桿菌侵染后的幼胚愈傷組織再生頻率(圖2，表4)。在所有處理中，非轉化對照愈傷組織的再生頻率幾乎達到100%，而且與共培養和誘導培養基中Picloram的濃度變化并沒有明顯關系，但農桿菌侵染后的幼胚愈傷組織再生頻率卻隨Picloram的濃度變化，變化很大，采用共培養和誘導培養基中Picloram的濃度分別為10mg/l和2.5mg/1時，四次轉化試驗共16個處理，平均再生頻率分別為57%、72%、78%和58%，其中一個處理最高可達86%，大大提高了獲得轉基因植株的幾率。因此，通過本實驗得出，共培養和誘導培養基中Picloram的濃度分別為4-10mg/1和2-2.5mg/1時，非轉化對照愈傷組織的再生頻率幾乎達到100%，經農桿菌侵染后的幼胚愈傷組織再生頻率也大大提高(圖2和表4，圖2中A為未進行轉化的愈傷再生植株；B為已轉化的愈傷再生植株)。表4、共培養和誘導培養基中Picloram的濃度及其對愈傷自<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>8、篩選培養與壯苗培養:一次篩選將再生苗轉移到含有150mg/lTimentin的篩選培養基(RPPT)中，在22-25°C、光照強度750uEs—V2、光照時間16h/d的條件下培養3-4周，篩選得到存活苗。篩選培養基的組成如表2所示，是在R培養基的基礎上添加了不同濃度的Glufosinateammonium(PPT)，其濃度從2mg/1至6mg/l不等。二次篩選將一次篩選得到的存活苗再進行一次篩選，方法同一次篩選相同。篩選的結果由于采用6.0mg/lPPT進行篩選，濃度太大，經過幾周處理后，有7次實驗所有植株均未成活。而PPT濃度為2-4mg/l時，轉化苗可以順利存活。表明篩選培養基中PPT的適宜濃度為2-4mg/1。利用其余5次實驗來統計轉化率。壯苗培養將經過二篩的存活植株，可以轉移到R培養基上進行壯苗培養l-2周。R培養基的成份見表2。9、移栽將經過兩輪PPT篩選仍然存活的植株，壯苗培養1-2周后移栽到溫室土缽中，存活植株的生長狀況較好(圖4)。三、轉化苗的檢測對存活的抗性苗進行^r基因PCR檢測和^/5基因的PCR和組織表達檢測，以確定轉基因陽性植株和轉化效率。1、Bar基因PCR檢測的方法為擴增Bar基因的引物序列如下PI:5GTCTGCACCATCGTCAACC-3，，P2:5'-GAAGTCCAGCTGCCAGAAAC-3，；以抗性苗的葉片基因組DNA為模板，用上述引物進行PCR擴增，擴增產物用瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，同時以未轉入任何載體的植株作為對照。結果如圖5(泳道卜10為轉化陽性植株；泳道11和12為未轉化的陰性對照；泳道13為Marker)所示，表明擴增產物為目的基因。2、GUS基因的表達檢測將存活苗的胚狀體、幼芽、葉片和小花等在X-Gluc緩沖液中，37'C培養過夜，檢測GUS的表達。檢測GUS基因表達的方法如文獻(JeffersonRA(1987)Assayingchimericgenesinplants:theGUSgenefusionsystem.PlantMolBiolR印5:387-405)中所述。分別對存活苗的胚狀體、幼芽、葉子、花藥和花粉進行GUS基因表達檢測。結果如圖3所示，表明，GUS基因在存活苗的胚狀體、幼芽、葉子、花藥和花粉中穩定表達(A為胚狀體，B為幼芽，C為葉子，D為花藥，E為花粉)。3、WW基因PCR檢測的方法為擴增仍'W基因的引物序列如下P3:5AGTGTACGTATCACCGTTTGTGTGAAAC-3，，P4:5'ATCGCCGCTTTGGACATACCATCCGTA-3，，以抗性苗葉片的基因組DNA為模板，用上述引物進行PCR擴增，擴增產物用瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，結果如圖6所示(泳道l、18表示Marker;泳道2、17表示陰性對照；泳道3、4、5、7、8、10、16表示仍WA陽性植株；泳道6、9、12、13、14表示仍VA陰性植株；泳道15表示水)，表明擴增產物為目的基因。將Bar基因PCR檢測為陽性且表現為PPT抗性的存活苗認為是陽性轉化苗。陽性轉化率的計算公式為轉化率=陽性轉化苗/用于轉化的幼胚總數。5次轉化實驗中，每次用于接種的幼胚數目、再生頻率、標記基因的PCR檢測結果、標記基因的表達檢測結果、陽性植株數目和轉化效率等如表5所示。表5、轉化頻率與目的基因的表達<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>結果表明，共接種1280個幼胚，獲得17個株系為5^"PCR陽性，并表現為明顯的PPT抗性，其中只有11個株系為仍'WPCR陽性，8個株系既是仍'd4PCR陽性又有GUS表達；不同試驗批次的轉化效率不同，具體為0.5-3.1%。由于受體材料生理狀態等不同，導致不同試驗批次的轉化效率不盡相同，實驗表明，本發明已經建立并完善了中國春小麥品種新春9號新鮮幼胚的遺傳轉化體系。權利要求1、一種轉化中國小麥品種新春9號的方法，包括如下步驟用目的農桿菌侵染中國小麥品種新春9號的幼胚，再進行共培養，將目的基因導入小麥幼胚；所述目的農桿菌為將目的基因導入根癌農桿菌菌株AGL1得到的。2、根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述幼胚為授粉12-14天后的心型胚。3、根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于所述侵染包括如下步驟將所述幼胚盾片朝上放置于接種培養基上，再向其中倒入所述目的農桿菌菌液，在黑暗條件下浸泡0.5-1.5小時；所述菌液中含有終濃度為0.015%的表面活性劑和終濃度為300-500uM的乙酰丁香酮，所述百分含量為體積百分含量；所述乙酰丁香酮的終濃度優選為400uM;所述浸泡的時間優選為lh。4、根據權利要求l、2或3所述的方法，其特征在于所述共培養的方法包括如下步驟將所述侵染后的幼胚置于共培養培養基中，在22-25'C的溫度下暗培養1-3天；所述共培養培養基中包括終濃度為4-10mg/L的氨氯吡啶酸；所述共培養的時間優選為3天；所述氨氯吡啶酸的終濃度優選為10rag/L。5、一種培育中國小麥品種新春9號的轉基因小麥的方法，包括如下步驟用權利要求1-4中任一所述方法將目的基因導入中國小麥品種新春9號的幼胚中，再進行誘導培養、再生培養、篩選培養，得到轉基因小麥。6、根據權利要求5所述的方法，其特征在于所述誘導培養包括如下步驟將所述共培養后的幼胚置于誘導培養基中，在22-25t:溫度下暗培養l-4周；所述誘導培養基中包括終濃度為150-170mg/L的特美汀和終濃度為1-2.5mg/L的氨氯吡啶酸；所述氨氯吡啶酸的終濃度優選為2.5mg/L;所述誘導培養的時間優選為3周。7、根據權利要求5或6所述的方法，其特征在于所述再生培養包括如下步驟將經過所述誘導培養后的幼胚置于再生培養基中，在溫度為22-25'C、光照強度為700-800ixEs—V2、光照時間為14-18h/d的條件下培養2-4周；所述再生培養基中包括終濃度為150-170mg/l的特美汀；所述光照強度優選為750uEs-'nf2，所述光照時間優選為16h/d，所述培養的時間優選為3周。8、根據權利要求5-7中任一所述的方法，其特征在于所述目的基因是通過插入載體pGreen的多克隆位點形成重組載體導入根癌農桿菌AGL1中的。9、根據權利要求8所述的方法，其特征在于所述篩選培養包括如下步驟將經過所述再生培養的幼胚置于篩選培養基中，在溫度為22-25r、光照強度為700-800uEs—V2、光照時間為14-18h/d的條件下培養2-4周；所述篩選培養基中包括終濃度為2-4mg/L的草丁膦和終濃度為150-170mg/1的特美汀；所述光照強度優選為750"Es—V2，所述光照時間優選為16h/d，所述培養的時間優選為3周。10、根據權利要求5-9中任一所述的方法，其特征在于所述方法包括如下步驟將經過所述篩選培養的存活植株移至恢復培養基中，在為22-25'C、光照強度為700-800ixEs—V2、光照時間為14-18h/d的條件下培養2-4周；.所述恢復培養基中包括終濃度為150-170mg/l的特美汀；所述光照強度優選為750uEs—'m—2，所述光照時間優選為16h/d，所述培養的時間優選為3周。全文摘要本發明公開了一種農桿菌介導的中國小麥品種新春9號的遺傳轉化方法。本發明方法包括如下步驟用目的農桿菌侵染中國小麥品種新春9號的幼胚，再進行共培養，將目的基因導入小麥幼胚；所述目的農桿菌為將目的基因導入根癌農桿菌菌株AGL1得到的。本發明建立的新春9號新鮮幼胚農桿菌轉化體系，轉化效率高，可達3.1％，重復性好。因此，本發明方法對我國小麥品種的遺傳改良、完善小麥種質等具有十分重要的意義。文檔編號A01H1/00GK101307324SQ20081011672公開日2008年11月19日申請日期2008年7月16日優先權日2008年7月16日發明者何中虎,夏蘭琴,赫德瓊斯,陳新民申請人:中國農業科學院作物科學研究所