專利名稱：一種農桿菌介導的獲得橡膠樹轉基因植株的方法
技術領域：
本發明涉及一種農桿菌介導的獲得橡膠樹轉基因植株的方法，屬于植物基因工程技術領域。
背景技術：
橡膠樹(HeveaBrasiliensis Mull. Arg)屬于大戟科(Euphorbiaceae)橡膠樹屬(Hevea)，是多年生異花授粉喬木，栽培于熱帶地區。由于橡膠樹生活周期長，從種子萌發到幼齡橡膠樹開割，需要6年以上的時間，因此常規育種周期較長，一般在30年左右。利用轉基因技術對巴西橡膠樹進行遺傳改造，可為橡膠樹品種改良創造優良條件，縮短育種周期。目前，已有不少國家投入大量的人力物カ進行廣泛的研究并取得了一定的進展(Leclercq J, Martin F, Lardet L, et al. benetic transformation and regeneration οι plantover-expressing Cu/inSOD geneto control oxidative stress in rubber tree. In Proceeding of InternationalRubber Conference,Siem Reap,Cambodia, 2007 ；ArokiarajP, Leelawathy R, Yeang H Y. The supervirulence plasmid pToK47 fromAgrobacteriumtumefaciens A281 improves transformation efficiency ofHevea brasiliensis [J].American Journal of Biochemistry andBiotechnology, 2009, 5 (3) : 137-141 ;黃天帶，李哲，孫愛花等.根瘤農桿菌介導的橡膠樹花藥愈傷組織遺傳體系的建立.作物學報，2010，36(10) :1691-1697)。目前，巴西橡膠樹遺傳轉化中受體材料主要以致密的花藥胚性愈傷組織為主，其轉化過程中仍存在很多困難，其主要的是轉化效率較低，轉基因植株獲得率低，以及轉化受體材料受花期限制等，無法滿足試驗和生產需要。為此，人們希望通過建立高效的遺傳轉化體系，來滿足生產和實驗的需要。然而，由于多種因素的限制，建立高效遺傳轉化體系仍面臨諸多困難，如何解決這些困難，最終建立起穩定、高效的遺傳轉化體系成為目前最迫切的任務。
發明內容
本發明的目的是以巴西橡膠樹優良品種的花藥愈傷組織誘導的胚性細胞懸浮系為受體材料，利用根瘤農桿菌介導法進行遺傳轉化，經體細胞胚發生途徑獲得再生轉基因植株。為了實現本發明目的，本發明的一種農桿菌介導的獲得橡膠樹轉基因植株的方法，包括如下步驟I)工程菌液的制備取_80°C保存的根瘤農桿菌菌種在添加有50mg/L卡那霉素、50mg/L利福平的YEB (發根農桿菌培養基)固體培養基上劃線，28°C倒置培養48 72h，挑取單菌落置于添加有相同抗生素的YEB液體培養基中，28°C條件下在220rpm(轉每分鐘)的搖床上振蕩培養24 48h至根瘤農桿菌處于對數生長期，然后取10 30ml菌液，用無菌的50ml離心管室溫條件下4000rpm離心IOmin收集菌體，收集的菌體用100ml AAM培養基重懸，在相同條件下振蕩培養4 6h后用新鮮的AAM培養基稀釋至0D600 = O. I
O.6 (0D600為液體在600nm波長處的吸光值)作為工程菌液；2)工程菌侵染懸浮細胞將橡膠樹胚性懸浮細胞去除培養基后放入20 30mlエ程菌液中浸泡I 5min，讓工程菌侵染橡膠樹胚性懸浮細胞；3)懸浮細胞與工程菌共培養將侵染后的橡膠樹胚性懸浮細胞去除菌液并用無菌濾紙吸干后，接種到共培養基上共培養，培養溫度20 25°C，培養2 8d ;4)懸浮細胞的脫菌培養經共培養的橡膠樹胚性懸浮細胞用無菌水充分漂洗3 5次，盡可能去除農桿菌后，接種到脫農桿菌培養基上，25 28°C條件下暗培養15 30d，去除農桿菌并誘導產生胚性愈傷組織；
5)抗性胚性愈傷組織的篩選將誘導的胚性愈傷組織接到篩選培養基上，25 28°C暗培養，每15 30d轉接到新鮮的篩選培養基上，篩選培養2 4次，挑選出抗性愈傷組織單獨繼續在相同培養基上繼代培養；6)抗性愈傷組織誘導胚狀體將繼代培養后的抗性愈傷組織接到體細胞胚誘導培養基上，25 28°C條件下暗培養，每25 30d轉接到新鮮的培養基上直至體細胞胚發育成熟。7)植株再生將成熟胚狀體接種到再生植株培養基，25 28°C條件下光照培養，光周期為16h/d，直至長出完整再生植株。所述的共培養基的有效成分為改良的MS培養基(七水硫酸鎂300 550mg/L，磷酸ニ氫鉀300 500mg/L,無水氯化I丐150 550mg/L,—水硫酸猛15 45mg/L,五水硫酸銅O. I O. 35mg/L),添加2,4- ニ氯苯氧こ酸O. I 3. Omg/L, α -萘こ酸O. I 2. Omg/L,激動素O. I 3. Omg/L,肌醇O. I O. 2g/L,椰子水30 50ml/L,鹿糖30 70g/L,こ酰丁香酮50 100 μ Μ，植物凝膠2 3g/L ；所述的脫農桿菌培養基的有效成分為改良的MS培養基，添加2，4- ニ氯苯氧こ酸O. I 3. Omg/L, α -萘こ酸 O. I 2. Omg/L,激動素 O. I 3. Omg/L,肌醇 O. I O. 2g/L,椰子水30 50ml/L,鹿糖30 70g/L,替卡西林200 500mg/L,植物凝膠2 3g/L ；所述的篩選培養基有效成分為改良的MS培養基，添加2，4_ ニ氯苯氧こ酸O. I
3.Omg/L, α -萘こ酸O. I 2. Omg/L,激動素O. I 3. Omg/L,肌醇O. I O. 2g/L,椰子水30 50ml/L,鹿糖30 70g/L,替卡西林200 500mg/L,卡那霉素50 200mg/L,植物凝膠2 3g/L ；所述的體細胞胚誘導培養基的有效成分為改良的MS培養基，添加激動素I. O
3.Omg/L, α -萘こ酸O. I O. 5mg/L, 6-節氨基腺嘌呤O. I 3. Omg/L,赤霉素O. I 3. Omg/L,活性炭I 2g/L，肌醇O. I O. 2g/L，椰子水30 50ml/L，蔗糖30 70g/L，植物凝膠
2 3g/L ；所述的再生植株培養基的有效成分為改良的MS培養基，添加激動素O. 5 3. Omg/L, α -萘こ酸O. 01 I. Omg/L,赤霉素O. I 3. Omg/L,鹿糖50 90g/L,活性碳I 2g/し椰子水30 50ml/L，植物凝膠2 3g/L。本發明在巴西橡膠樹胚性細胞懸浮系再生植株體系基本建立的基礎上，建立了以巴西橡膠樹胚性細胞懸浮系為受體的高效的遺傳轉化體系，可以獲得大量均一的橡膠樹遺傳轉化材料，為進一歩建立巴西橡膠樹遺傳轉化育種提供重要基礎。為橡膠樹遺傳轉化育種培育產量高、抗性強且生長快的優良品種。本發明轉化效率高，轉基因再生植株獲得率高，具有很大的應用價值。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。預先按要求配制好各種培養基和工程菌液。取-80°C保存的根瘤農桿菌EHA105 (含質粒pCambia2301-AtCBFl)菌種在含有50mg/L卡那霉素、50mg/L利福平的YEB固體培養基上劃線，28°C倒置培養60h，挑取單菌落置于添加有相同抗生素的YEB液體培養基中，28°C條件下在220rpm振蕩培養30h至根瘤農桿菌處于對數生長期，然后取20ml菌液，用無菌的50ml離心管室溫4000rpm離心IOmin收集菌體，收集的菌體用100ml AAM培養基重懸，在相同條件下振蕩培養5h后，用新鮮的AAM培養基稀釋至0D600 = O. 4 (0D600為液體在600nm波長處的吸光值)作為工程菌液。、用移液槍將巴西橡膠樹熱研8-79胚性懸浮細胞的培養液吸干后，加入25mlエ程菌液浸泡3min，浸泡結束后用移液槍去除菌液并用無菌濾紙吸干殘留菌液后，接種至共培養基上共培養。培養溫度20°C，暗培養4d。共培養基為改良的MS培養基(七水硫酸鎂500mg/L,磷酸ニ氫鉀400mg/L,無水氯化I丐250mg/L, 一水硫酸猛35mg/L,五水硫酸銅
O.2mg/L),添加2,4- ニ氯苯氧こ酸I. Omg/L, α -萘こ酸O. 5mg/L,激動素I. 5mg/L,肌醇
0.lg/L，椰子水40ml/L，蔗糖50g/L，こ酰丁香酮75 μ Μ，植物凝膠2. 2g/L。把經過共培養的橡膠樹胚性懸浮細胞用無菌水充分漂洗5次，用無菌濾紙吸干后，接種到脫農桿菌培養基上進行脫菌培養，暗培養20d，誘導出胚性愈傷組織。脫菌培養基成分為改良的MS培養基，添加2，4- ニ氯苯氧こ酸I. Omg/L, α -萘こ酸O. 5mg/L，激動素
1.5mg/L,肌醇O. lg/L,椰子水40ml/L,鹿糖50g/L,替卡西林400mg/L,植物凝膠2. 2g/L。將胚性愈傷組織轉接到篩選培養基上篩選4次，15d篩選一次，挑選出抗性愈傷組織單獨繼續在相同培養基上繼代培養。篩選培養基成分為改良的MS培養基，添加2，4_ ニ氯苯氧こ酸I. Omg/L, α -萘こ酸O. 5mg/L,激動素I. 5mg/L,肌醇O. lg/L,椰子水40ml/L,鹿糖50g/L,替卡西林300mg/L,卡那霉素100mg/L,植物凝膠2. 2g/L。再將繼代培養后的抗性愈傷組織接到體細胞胚誘導培養基上，每25d轉接到新鮮的培養基上培養，直至體細胞胚發育成熟。體細胞胚誘導培養基成分為改良的MS培養基，添加激動素2. 0mg/L, α -萘こ酸O. 2mg/L, 6-節氨基腺嘌呤L Omg/L,赤霉素2. Omg/L,活性炭I. Og/L，肌醇O. lg/L，椰子水40ml/L，蔗糖50g/L，植物凝膠2. 2g/L。然后將成熟胚狀體接種到再生植株培養基上培養，培養溫度28°C，光照16h/d，以促其再生出完整植株，培養IOd后，子葉形胚開始抽芽，20d后，長成健壯的完整小植株。再生植株培養基的有效成分為改良的MS培養基，添加激動素I. 0mg/L, α -萘こ酸0. lmg/L,赤霉素2. 0mg/L，植物凝膠2. 2g/L，蔗糖70g/L，活性碳I. 5g/L，椰子水40ml/L。雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發明作了詳盡的描述，但在本發明基礎上，可以對之作ー些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發明要求保護的范圍。
權利要求
1.一種農桿菌介導的獲得橡膠樹轉基因植株的方法，其特征在于，包括如下步驟 .1)工程菌侵染懸浮細胞將橡膠樹胚性懸浮細胞去除培養基后放入20 30ml工程菌液中浸泡I 5min，讓工程菌侵染橡膠樹胚性懸浮細胞； .2)懸浮細胞與工程菌共培養將侵染后的橡膠樹胚性懸浮細胞去除菌液并用無菌濾紙吸干后，接種至共培養基上共培養，培養溫度20 25°C，培養2 8d ; 所述的共培養基的有效成分為改良的MS培養基(七水硫酸鎂300 550mg/L，磷酸ニ氫鉀300 500mg/L,無水氯化I丐150 550mg/L,—水硫酸猛15 45mg/L,五水硫酸銅O. I O. 35mg/L),添加2，4- ニ氯苯氧こ酸O. I 3. Omg/L, α -萘こ酸O. I 2. Omg/L,激動素O. I 3. Omg/L,肌醇O. I O. 2g/L,椰子水30 50ml/L,鹿糖30 70g/L,こ酰丁香酮50 100 μ Μ，植物凝膠2 3g/L ； .3)懸浮細胞的脫菌培養經共培養的橡膠樹胚性懸浮細胞用無菌水充分漂洗3 5次后，接種到脫農桿菌培養基上，25 28°C條件下暗培養15 30d，去除農桿菌并誘導產生胚性愈傷組織； 所述的脫農桿菌培養基的有效成分為改良的MS培養基，添加2，4- ニ氯苯氧こ酸O.I 3. Omg/L, α -萘こ酸 O. I 2. Omg/L,激動素 0. I 3. 0mg/L,肌醇 0. I 0. 2g/L,椰子水30 50ml/L,鹿糖30 70g/L,替卡西林200 500mg/L,植物凝膠2 3g/L ； .4)抗性胚性愈傷組織的篩選將誘導的胚性愈傷組織接到篩選培養基上，25 28°C暗培養，每15 30d轉接到新鮮的篩選培養基上，篩選培養2 4次，挑選出抗性愈傷組織單獨繼續在相同培養基上繼代培養； 所述的篩選培養基有效成分為改良的MS培養基，添加2，4- ニ氯苯氧こ酸0. I .3.0mg/L, α -萘こ酸0. I 2. 0mg/L,激動素0. I 3. 0mg/L,肌醇0. I 0. 2g/L,椰子水.30 50ml/L,鹿糖30 70g/L,替卡西林200 500mg/L,卡那霉素50 200mg/L,植物凝膠2 3g/L ； .5)抗性愈傷組織誘導胚狀體將繼代培養后的抗性愈傷組織接到體細胞胚誘導培養基上，25 28°C條件下暗培養，每25 30d轉接到新鮮的培養基上直至體細胞胚發育成熟； 所述的體細胞胚誘導培養基的有效成分為改良的MS培養基，添加激動素I. O 3. Omg/し<!-萘こ酸0.1 0· 5mg/L, 6-節氨基腺嘌呤0. I 3. 0mg/L,赤霉素0. I 3. 0mg/L,活性炭I 2g/L，肌醇0. I 0. 2g/L，椰子水30 50ml/L，蔗糖30 70g/L，植物凝膠2 .3g/L ； .6)植株再生將成熟胚狀體接種到再生植株培養基，25 28°C條件下光照培養，光周期為16h/d，直至長出完整再生植株； 所述的再生植株培養基的有效成分為改良的MS培養基，添加激動素0. 5 3. 0mg/L,α -萘こ酸0. 01 I. 0mg/L,赤霉素0. I 3. 0mg/L,鹿糖50 90g/L,活性碳I 2g/L,椰子水30 50ml/L，植物凝膠2 3g/L。
2.根據權利要求I所述的ー種農桿菌介導的獲得橡膠樹轉基因植株的方法，其特征在干，工程菌液的制備是取_80°C保存的根瘤農桿菌菌種在添加有50mg/L卡那霉素、50mg/L利福平的YEB固體培養基上劃線，28°C倒置培養48 72h，挑取單菌落置于添加有相同抗生素的YEB液體培養基中，28°C條件下在220rpm的搖床上振蕩培養24 48h至根瘤農桿菌處于對數生長期，然后取10 30ml菌液，用無菌的50ml離心管室溫條件下4000rpm離心IOmin收集菌體,收集的菌體用IOOmlAAM培養基重懸,在相同條件下振蕩培養4 6h后用新鮮的AAM培養基稀 釋至0D600 = O. I O. 6 (0D600為液體在600nm波長處的吸光值)作為工程菌液。
全文摘要
本發明涉及一種農桿菌介導的獲得橡膠樹轉基因植株的方法，包括工程菌液的制備，工程菌侵染橡膠樹胚性懸浮細胞，橡膠樹胚性懸浮細胞與工程菌共培養，橡膠樹胚性懸浮細胞去除農桿菌并誘導產生胚性愈傷組織，抗性胚性愈傷組織的篩選及繼代培養，抗性愈傷組織誘導胚狀體，將成熟胚狀體培養出再生植株。本發明可為橡膠樹培育產量高、抗性強且生長快的優良品種，轉化效率高，再生轉基因植株獲得率高，具有很大的應用價值。
文檔編號C12N15/82GK102676574SQ20121011924
公開日2012年9月19日 申請日期2012年4月19日 優先權日2012年4月19日
發明者周權男, 姜澤海, 戴雪梅, 李哲, 畢政鴻, 謝黎黎, 黃華孫, 黃天帶 申請人:中國熱帶農業科學院橡膠研究所