專利名稱：：藏獒精液冷凍稀釋液的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一種藏獒精液冷凍稀釋液，用于藏獒精液的冷凍及人工授精，屬于動物繁殖
技術領域：
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背景技術：
：犬的精液冷凍具有很高的應用價值，使用犬的精液冷凍與人工授精技術比自然繁殖具有諸多的優越性。如可以高度發揮優秀種犬的利用率；減少各種疾病的傳播，特別是生殖系統疾病的傳播；不受時空限制，引種方便快捷，而且成本低效益高；種質資源可以得到有效保存，特別是對我國藏獒的品種保護和發展具有重要的現實意義。目前，我國在藏獒精液冷凍與人工授精方面研究較少，且在繁殖方面未見比較全面的資料報道。藏獒屬于青藏高原的一個物種，傳說純種藏獒分布于我國的甘肅、青海、四川省交界黃河第一灣一河曲。河曲藏獒被認為是真宗藏獒品群，享有"東方神犬"美譽。藏獒長期受高海拔、低氣溫、低氧量的生態環境影響，具備體型高大，性格剛毅兇猛等特點，深受我國甚至世界藏獒愛好者的稱贊。近20年來，藏獒文化、經濟得到了快速的發展，藏獒養殖已使牧民形成了致富的產業，給牧民帶來了數以千萬經濟收入。但是，由于牧民對優秀純種藏獒血統保護意識薄弱，隨意買賣，原始藏獒與當地牧羊犬血統混雜近親繁殖等，導致優秀純種藏獒越來越少，這一珍稀犬種瀕臨滅絕的危機。據統計在我國純種藏獒不足百條，如今即使在青藏高原的原產地，想尋求一條純種藏獒也是很困難的。其次藏獒繁殖的季節性強，母獒每年只有一次發情，制約了純種藏獒的繁殖和培育。且藏獒精子與其它犬科動物的精子類似，在凍融過程中對低溫損傷的抗性較弱，凍融后精子活力下降，受孕率及窩產仔平均數均低于自然繁殖。藏獒自然繁殖時的受胎率和窩產仔平均數低于其他犬種，約分別為80%85%，57只。因此，如何長期低溫保存優質純種藏獒精液并充分利用優良種源是本領域迫在眉睫需解決的問題。影響犬精液冷凍成功與否的關鍵因素之一是稀釋液配方，稀釋液質量的優劣直接影響藏獒精液冷凍與人工受精的成敗。目前國內外進行犬冷凍精液研究中應用最廣泛的稀釋液有兩類一類是卵黃一乳糖稀釋液，其主要成分是卵黃、乳糖、甘油和抗生素類；另一類是卵黃一tris稀釋液，其主要成分是tris(三羥甲基)、檸檬酸、果糖、甘油和卵黃，使用的抗菌素多為青霉素、鏈霉素和慶大霉素。由潘壽文和禹學禮等實驗證實兩種稀釋液中，卵黃一tris稀釋液優于卵黃一乳糖稀釋液。(潘壽文等，畜牧與獸醫，1986;(3):105-106;禹學禮等，洛陽農業高等專科學校學報1999;(2);2023;河南科技大學學報，2004;(2);32-36)。但是就目前研究水平與自然繁殖相比，受胎率和窩產仔平均數還存在一定差距。
發明內容鑒于現有技術的不足，本發明提供一種藏獒精液冷凍稀釋液，該稀釋液進一步降低了藏獒精子在冷凍過程中受過冷刺激所造成的損害，提高了凍精的活力、復蘇率、頂體的完整率等，從而使受胎率和窩產仔平均數明顯提高，達到或接近了自交水平。為實現上述目的，本發明采用的技術方案是一種藏獒精液冷凍稀釋液，該稀釋液由1液和2液組成1液的各組分及重量為氯化鈣0.200.50g、氯化鉀0.180.36g、氯化鎂0.220.45g、氯化鈉3.55.85g、磷酸二氫鈉0.300.55g、碳酸氫鈉1.383.20g、丙酮酸鈉0.0250.036g、加雙蒸水定容至1L而成；2液以1液為基礎，取l液3555mL，配犢牛血清2030mL、卵黃2025mL、甘油510mL、青霉素1GGGIU/mL混合而成所述稀釋液，且該稀釋液的滲透壓為300330mosmo/L，pH值為6.57.0。本發明優選的配方是該稀釋液由1液和2液組成，1液的各組分及重量為氯化鈣0.30g、氯化鉀0.25g、氯化鎂0.32g、氯化鈉5.85g、磷酸二氫鈉0.45g、碳酸氫鈉2.38g、丙酮酸鈉G.025g、加雙蒸水定容至1L而成；2液以l液為基礎，取l液50mL，配犢牛血清25mL、卵黃20mL、甘油5mL、青霉素1000IU/mL混合而成所述稀釋液，且該稀釋液的滲透壓為325mosmo/L，pH值為6.8。為藏獒精子存活提供最佳基質條件。本發明藏獒精液冷凍稀釋液有以下用途，一是用于藏獒精液低溫保存，另一用途是用于藏獒精液冷凍保存，如果去掉甘油等低溫保護劑，則還可用于藏獒精液的常溫保存。本發明根據藏獒精細胞營養需要、滲透壓、pH值及能量物質的吸收方式等生理特性，將傳統犬的稀釋液配方中的營養物質糖，如葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖、棉籽糖等用犢牛血清替代，作為精細胞能量代謝的來源，并對其他電解質作了較大的調整，以維持精子內外環境的滲透壓平衡。此外，本稀釋液用磷酸二氫鈉和碳酸氫鈉作緩沖劑，同時還加入青霉素等殺菌劑，甘油等保護劑，提高稀釋液的冷凍保護效果。使該稀釋液的滲透壓為300330mosmo/L、pH值為6.57.0，為藏獒精子存活提供了最佳基質條件，進一步降低了藏獒精子在冷凍過程中受過冷刺激所造成的損害，從而使凍精的活力、復蘇率、頂體的完整率、冷凍精子的受胎率和窩產仔平均數等指標分別達0.65士0.05、82.3±5.55、51.2±1.23、84%和5只，相比傳統卵黃-乳糖稀釋液及卵黃-Tris稀釋液的O.30±0.03、38.40±4.56、29.4±1.29、22%和2只及0.47±0.04、59.58±4.63、31.9±1.60、57.1%和3只(禹學禮等，洛陽農業高等專科學校學報，1999;(2):20-23)均有顯著的提高，并且在近幾年的實驗中，各項指標更加趨于穩定，如下表。2007-2008兩年度藏獒冷凍精液及人工授精試驗結果<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>顯然，本發明的稀釋液使藏獒冷凍精液的活力可達到0.60.7，受胎率和窩產仔平均數可分別達到77.3%84%和45只，達到或接近了自交水平，所以本發明是一種具有實際應用和推廣價值的藏獒精液冷凍稀釋液。具體實施例方式本發明中所用的化學試劑均選擇分析純。實施例1。一種藏獒精液冷凍稀釋液，該稀釋液由1液和2液組成，1液的各組分及重量為氯化鈣0.30g、氯化鉀0.25g、氯化鎂0.32g、氯化鈉5.85g、磷酸二氫鈉0.45g、碳酸氫鈉2.38g、丙酮酸鈉0.025g、加雙蒸水定容至1L而成，并加熱溶解，以本領域常規方法過濾消毒，留濾液為l液；2液以1液為基礎，在無菌條件下，取l液50mL，配犢牛血清25mL、卵黃20mL、甘油5mL、青霉素1000IU/mL混合而成所述稀釋液，且該稀釋液的滲透壓為325mosmo/L，pH值為6.8，其對藏獒精液冷凍保存效果極佳。使用時，按h2比例與藏獒精液進行同溫稀釋。實施例2。一種藏獒精液冷凍稀釋液，該稀釋液由1液和2液組成，1液的各組分及重量為氯化鈣0.20g、氯化鉀0.18g、氯化鎂0.22g、氯化鈉5.0g、磷酸二氫鈉G.3g、碳酸氫鈉1.38g、丙酮酸鈉Q.G3g、加雙蒸水定容至1L而成，并加熱溶解，以本領域常規方法過濾消毒，留濾液為1液；2液以1液為基礎，在無菌條件下，取l液35mL，配犢牛血清30mL、卵黃25mL、甘油10mL、青霉素1000IU/mL混合而成所述稀釋液，且該稀釋液的滲透壓為310mosmo/L，pH值為6.5。所配成的稀釋液對藏獒精液冷凍保存效果極佳。使用時，按l:2比例與藏獒精液進行同溫稀釋。實施例3。一種藏獒精液冷凍稀釋液，該稀釋液由1液和2液組成，1液的各組分及重量為氯化鈣0.50g、氯化鉀0.36g、氯化鎂0.45g、氯化鈉3.5g、磷酸二氫鈉G.55g、碳酸氫鈉3.2g、丙酮酸鈉0.036g、加雙蒸水定容至1L而成，并加熱溶解，以本領域常規方法過濾消毒，留濾液為l液；2液以1液為基礎，在無菌條件下，取l液55mL，配犢牛血清20mL、卵黃20mL、甘油5mL、青霉素1000IU/mL混合而成所述稀釋液，且該稀釋液的滲透壓為330mosmo/L，pH值為7，其對藏獒精液冷凍保存效果極佳。使用時，按1:2比例與藏獒精液進行同溫稀釋。權利要求1、藏獒精液冷凍稀釋液，其特征在于該稀釋液由1液和2液組成1液的各組分及重量為氯化鈣0.20～0.50g、氯化鉀0.18～0.36g、氯化鎂0.22～0.45g、氯化鈉3.5～5.85g、磷酸二氫鈉0.30～0.55g、碳酸氫鈉1.38～3.20g、丙酮酸鈉0.025～0.036g、加雙蒸水定容至1L而成；2液以1液為基礎，取1液35～55mL，配犢牛血清20～30mL、卵黃20～25mL、甘油5～10mL、青霉素1000IU/mL，混合而成所述稀釋液，且該稀釋液的滲透壓為300～330mosmo/L，pH值為6.5～7.0。2、根據權利要求1所述的藏獒精液冷凍稀釋液，其特征在于該稀釋液由l液和2液組成，l液的各組分及重量為氯化鈣0.30g、氯化鉀0.25g、氯化鎂0.32g、氯化鈉5.85g、磷酸二氫鈉0.45g、碳酸氫鈉2.38g、丙酮酸鈉0.025g、加雙蒸水定容至1L而成；2液以1液為基礎，取1液50mL，配犢牛血清25mL、卵黃20mL、甘油5mL、青霉素1000IU/mL，混合而成所述稀釋液，且該稀釋液的滲透壓為325mosmo/L，pH值為6.8。全文摘要一種藏獒精液冷凍稀釋液，屬于動物繁殖
技術領域：
。包括1液和2液，1液由氯化鈣0.20～0.50g、氯化鉀0.18～0.36g、氯化鎂0.22～0.45g、氯化鈉3.5～5.85g、磷酸二氫鈉0.30～0.55g、碳酸氫鈉1.38～3.20g、丙酮酸鈉0.025～0.036g、加雙蒸水定容至1L而成；2液取1液35～55ml，配犢牛血清20～30ml、卵黃20～25ml、甘油5～10ml、青霉素1000IU/ml混合而成滲透壓為300～330mosmo/l，pH值為6.5～7.0的所述稀釋液。該稀釋液使藏獒冷凍精液的活力達到0.6～0.7，受胎率和窩產仔平均數分別達到77.3％～84％和4～5只，達到或接近了自交水平，是一種具有實際應用和推廣價值的藏獒精液冷凍稀釋液。文檔編號A01N1/02GK101353643SQ20081016098公開日2009年1月28日申請日期2008年9月17日優先權日2008年9月17日發明者張尤嘉,張振韜申請人:張尤嘉