專利名稱：：一種富含飼用功能肽的發酵豆粕制備方法
技術領域：
：本發明涉及以去皮豆粕為原料，利用微生物發酵技術有效去除豆粕中各種抗營養因子，同時得到含有大量多肽發酵豆粕的一種生產工藝，尤其涉及一種多菌種混合固體發酵制備富含飼用功能肽豆粕的微生物發酵工藝。
背景技術：
：隨著畜牧水產業的迅速發展，蛋白類飼料的需求量越來越大，但由于食品安全性問題，尤其是近年來各國限產魚粉、禁止利用一些畜產品下腳料生產的肉骨粉等動物蛋白飼料，因此，人們越來越關注各種植物性蛋白質源的開發利用，其中，豆粕作為優質植物性蛋白源，來源廣泛，營養豐富，豆粕蛋白的高值化利用一直是人們的研究開發熱點。豆粕是我國乃至全世界應用最為廣泛的植物性飼料蛋白質原料，但隨著科技的進歩和研究的深入，人們發現80%左右的大豆蛋白質相對分子質量都在100kDa以上，且大多數分子內部呈反平行p-hdk非有序結構，分子高度壓縮、折疊，使得豆粕蛋白質的消化性和生物學功能遠不及魚粉等動物性蛋白質飼料，此外，豆粕中存在多種抗營養因子也對動物產生毒害作用，嚴重影響了豆粕在動物生產上的應用價值。因此，旨在提高豆粕營養價值、擴大豆粕在畜禽水產上使用的研究就顯得更加重要，同時彌補豆粕營養缺陷的各種加工處理法也相繼應運而生。豆粕除了物理加熱處理、化學浸提法處理外，生物處理法因其綠色、高效的特點受到人們歡迎，尤其是成本較低的微生物發酵處理法，己成為當前研究、應用的熱點。微生物發酵即利用微生物的生長代謝活動及代謝過程中產生的各種酶類對豆粕的營養特性進行改善。與其它方法相比，微生物發酵法因其具有營養破壞性小、改善效果全面、經濟效益高等優點。大量研究證明，利用微生物發酵技術，可使豆粕中的抗營養因子含量下降至飼用水平，基本上消除抗營養因子的抗營養作用，同時有的微生物還可將豆粕大分子蛋白質降解為小分子量蛋白、肽和氨基酸，使其營養特性改善，更易被動物消化吸收利用。另外，微生物發酵豆粕還可得到具有生理活性的抗菌肽、提高保健物質的生物活性，采用適當的加工工藝，還可使發酵豆粕中存有一定數量的益生菌，用于改善動物腸道微生態環境，對動物自身的健康和營養有很大作用。本發明技術主要針對上述提高豆粕營養價值的關鍵問題，通過系統研究多菌種混合固體發酵的發酵工藝參數，最終獲得了一種富含飼用功能肽的發酵豆粕制備方法，這對于解決我國畜牧水產業發展中優質蛋白質源緊缺的問題提供了重要的理論依據和技術支持。
發明內容本發明的目的在于提供一種富含飼用功能肽的發酵豆粕制備方法，進一步促進豆粕在畜牧水產業上的有效利用，使其成為解決我國目前蛋白質飼料資源短缺的途徑之一。本發明的目的通過以下技術方案予以實現本發明提供的一種富含飼用功能肽的發酵豆粕制備方法，其步驟為a.從原始出發菌種枯草桿菌屬細菌和酵母菌屬真菌中挑取一環菌體，分別接種到LB種子培養基和麥芽汁種子培養基中，于3(TC-37'C溫度下，150-170rpm，搖床培養16-24小時后，直到OD6()()=0.7-0.9,停止培養，作為種子液。從原始出發菌種乳酸菌屬細菌中挑取一環菌體，接種到乳酸菌屬培養基中，于3(TC-35'C溫度下靜止培養40-48小時，作為種子液。b.在液體擴大LB培養基(枯草桿菌屬細菌)和麥芽汁培養基(酵母菌屬真菌)中以1_5%接種量接種種子液，于3(TC-37'C溫度下，150-170rpm，搖床培養20—28小時。在液體擴大乳酸菌屬培養基(乳酸菌屬細菌)中以1一5%接種量接種種子液，于3(TC-35'C溫度下靜止培養48小時。將枯草芽孢桿菌、啤酒酵母菌、乳酸菌的各種菌株發酵培養液按1.8:1:1比例混合均勻，作為豆粕發酵菌種液。c.將b中豆粕發酵菌種液以5。/。的接種量接種到含水量為50。/。的豆粕(過40目篩)中，同時加入5%的糖蜜，并混合均勻(初始pH值為7.0)，于4(TC溫度下需氧發酵48小時，然后于6(TC下干燥制樣，最后對發酵前后豆粕進行營養成分分析。d.發酵豆粕成品經稱量、包裝后放于陰涼干燥處，在室溫下可存放6-9個月。e.發酵后的豆粕即可作為豬、雞、羅非魚等的飼料。本發明步驟a中所述的菌種種子LB培養基按重量百分比含有0.3%_0.5%的氯化鈉、0.3%一0.5%的蛋白胨和0.5%—1.0%酵母膏，乳酸菌屬培養基含有0.2%-0.4%的胰蛋白胨、0.3%-0.5%的NaCl、0.2%_0.4°/。的葡萄糖、0.3%的KH2P04、0.3%的K2HP04、0.02%的MgCl2、0.005%的CaS0d和0.2%的淀粉，麥芽汁培養基含有10%的麥芽膏粉和0.01%的氯霉素。本發明步驟a中所述的菌種為枯草芽孢桿菌(Sad〃u^w6rifc)3株、乳酸菌(Z^"o6fl"7/w)l株、啤酒酵母菌(&ccAarowyc^cre他/ae)1株。本發明步驟b中所述的三種液體擴大培養基的配方與步驟a相同。本發明具有以下有益效果本發明采用微生物發酵處理豆粕，避免了化學添加劑和物理法對豆粕蛋白功能性質的影響，發酵過程中產生的各種消化酶、中小分子蛋白(功能肽)、氨基酸、維生素、益生菌等也大大提高了豆粕的營養價值。無論從凝膠色譜中蛋白質分子量變化，還是從電泳中都能明顯的看出，豆粕發酵后大分子蛋白質被明顯降解，按隆丁分區法測定其中小分子蛋白質(飼用功能肽)，占發酵豆粕總蛋白質的53.61%，而未發酵豆粕只占3.47%。發酵后豆粕的氨基酸含量大多都增加了，也更加平衡了，其最缺乏的蛋氨酸增加了一倍多，更有利于機體的吸收利用。從測定結果看，混和發酵后豆粕中的抗營養因子去除效果很明顯，如胰蛋白晦抑制因子、脲酶全部失活。發酵前豆粕中63.53%的磷都以植酸磷的形式存在，發酵后植酸磷明顯下降，只占13.75%。具體實施例方式本發明提供的一種富含詞用功能肽的發酵豆粕制備方法的實施例如下本實施例所用的菌種為枯草芽孢桿菌(few'""s^/6"7is)3株、乳酸菌"3"0&77^)l株、啤酒酵母菌(feccferoyzy^es1株。其具體步驟為a.由5克蛋白胨、5克酵母膏、3克氯化鈉和1升水(pH7.0)組成的LB液體培養基，倒入無菌三角瓶中，制成枯草芽孢桿菌種子液體培養基和液體擴大培養基；由2克蛋自M^、5克NaCl、2克葡萄糖、3克KH2P04、3克K2HP04、0.2克MgCl2、0.05克CaS04、2克淀粉和l升水(pH6.5)組成的乳酸菌屬培養基，倒入無菌三角瓶中，制成乳酸菌種子液體培養基和液體擴大培養基；由100克麥芽膏粉、0.01克氯霉素和1升水〔pH6.0)組成的麥芽汁培養基，倒入無菌三角瓶中，制成酵母菌種子液體培養基和液體擴大培養基。b.從原始出發菌種枯草桿菌屬細菌和酵母菌屬真菌中挑取一環菌體，分別接種到LB種子培養基和麥芽汁種子培養基中，于3(TC-37'C溫度下，150-170rpm，搖床培養16-24小時后，直到OD,二0.7-0.9,停止培養，作為種子液。從原始出發菌種乳酸菌屬細菌中挑取一環菌體，接種到乳酸菌屬培養基中，于3(TC-35'C溫度下靜止培養40-48小時，作為種子液。c.在液體擴大LB培養基(枯草桿菌屬細菌)和麥芽汁培養基(酵母菌屬真菌)中以1一5%接種量接種種子液，于3(TC-37'C溫度下，150-170rpm，搖床培養20—28小時。在液體擴大乳酸菌屬培養基(乳酸菌屬細菌)中以1一5%接種量接種種子液，于30'C-35t:溫度下靜止培養48小時。將枯草芽孢桿菌、啤酒酵母菌、乳酸菌的菌株發酵培養液按1.8:1:1比例混合均勻，作為豆粕發酵菌種液。d.將豆粕發酵菌種液以5°/。的接種量接種到含水量為50%的豆粕(過40目篩)中，同時加入5%的糖蜜，并混合均勻(初始pH值為7.0)，于40。C溫度下需氧發酵48小時，然后于6(TC下干燥制樣。e.對發酵前后豆粕進行營養成分分析。f.發酵豆粕成品經稱量、包裝后放于陰涼干燥處，在室溫下可存放6-9個月。g.步驟f中發酵后的豆粕即可作為豬、雞、羅非魚等的飼料。經上述實例中微生物發酵法制備的豆粕成品的營養特性得到明顯改善，粗蛋白提高了18.03%，蛋白質分子量明顯降低，水溶性蛋白質含量升高了6.57倍，中小分子蛋白質(功能肽)含量升高了17.23倍，多種氨基酸含量都有所增加，蛋氨酸升高了1.23倍；發酵豆粕抗營養因子基本得到消除，胰蛋白酶抑制因子和脲酶完全失活；發酵豆粕還含有豐富的維生素、有益菌及未知生長因子，營養價值大大得到了提高。可較明顯地提高了豆粕在動物水產生產上的應用。其效果如下(1)添加發酵豆粕對肉雞生長的影響。選用21日齡商品嶺南黃肉雞192只，隨機分為4組，每組4個重復，每個重復12只。第一組為對照組，飼喂基礎日糧，其余3組為分別添加5%、10%、15%發酵豆粕處理組1、2、3，設計等氮等能日糧。試驗期22天，研究在飼糧中添加高產多肽發酵豆粕對肉雞生產性能、屠宰性能、血清生化、免疫器官重以及消化道重等指標的影響。結果表明①發酵豆粕可以提高肉仔雞的生產性能，添加5°/。效果最佳，顯著提高了平均日增重(P<0.05)、降低了料重比(P〈0.05)(表l);②發酵豆粕可以増加血清蛋白質含量，加速蛋白質合成代謝，但添加比例過大(159。)時，血清尿素氮顯著增加(P〈0.05)，也加速了蛋白質的分解代謝(表2);③添加發酵豆粕有改善肉雞免疫功能、優化消化道功能的趨勢，而對肉雞的屠宰性能、脂質代謝無影響(表3-表5)。表1不同發酵豆粕添加量對肉雞生產性能的影響日采食量(g/d/羽)日增重(g/d/羽)實驗期(26-48d)料重比全期(0-48d)料重比對照組104.41±1.31ab40.34±0.85a2.59±0.03a2.20±0.03a處理1108.03±0.12a42.87±0.17b2.52±0.01b2.17±0.01b處理2104.38土1.98"40.45±0.50a2.58±0.02ab2.20±0.02*處理3103.58±0.66b40.64±0.57a2.55±0.02ab2.18±0.02'b注肩注小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05).未標注者表示差異不顯著，下同。表2不同發酵豆粕添加量對肉雞血清生化指標的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>(2)斷奶仔豬日糧中發酵豆粕替代代乳粉的研究。試驗選取5~7kg杜長大三元雜健康斷奶仔豬216頭，按體重、胎次相近，性別各半的原則隨機分成3個處理組(第l組代乳粉1組；第2組代乳粉2組；第3組發酵豆粕組)，每組4個重復，每個重復16頭瞎，試驗期為20天。試驗結果表明斷奶仔豬日糧中使用發酵豆粕，其在日增重、日采食量、飼料報酬上，比代乳粉1好，分別改善22.22%、4.67%、16.77%,差異顯著(P〈0.05);與代乳粉2比較差異不顯著(P>0.05)(表6);在腹瀉率方面，發酵豆粕組比代乳粉組略高，但差異不顯著(P>0.05);在斷奶日糧中使用發酵豆粕替代代乳粉在技術上是可行的，可完全替代fi乳粉，對仔豬的生產性能無顯著影響。表6各組斷奶仔豬的生產性能指標處理組1處理組2處理組3平均始重(kg)平均未重(kg)平均日增重(g/d)平均日采食量(g/d)耗料增重比(F/G)6.21±0.1210.26±0.23202.52±0.32366.5±21.01.81±0.066.22±0.0811.24±0.21251.05±9.61391.6±23.41.56±0.096.20±0.1311.15±0.19247.56±12.43383.6±19.61.55±0.11注同行數字后字母不同者，表示相互間差異顯著(P《0.05)。(3)配合飼料中添加發酵豆粕對吉富羅非魚生長性能的影響。實驗設4個組對照組為空白組詞喂基礎飼料，實驗組在基礎伺料中分別添加5%，10%，15%的發酵豆粕(分別記為處理組l、2、3)。每組2個重復，每個重復30尾魚，實驗期共計30天。結果顯示以5%、10%的發酵豆粕添加水平時，羅非魚各項指標均優于對照組和15%添加組，10%添加組羅非魚的日增重、相對增重率、特定生長率與對照組和15%添加組間有顯著性的差異(P<Q.05、P<0.01、P<0.01);15%添加組對羅非魚的養殖效果不如對照組，但兩者之間沒有顯著性差異(P>0.05)(表7)。表7添加發酵豆粕對吉富羅非魚生長性能的影響指標對照組處理組1處理組2處理組3平均初重(g)7,74±0.127.30±0.387,35±0.017.36±0.25平均末重(g)36.48±0.4138.14±1.7241.54±0.7534.77±1.09平均日增重0.96±0.02a1.03±0.04ab1.14±0.02bO.91±O.03a相對增重率374.15±12.46a422.85±3.65ab464.95±9.42b372.10±l.llaSGR5.6±0.09a5.5±0.02ab5.77±0.06b5.17±O.0〗aPER273.47±0.12294.09±16.44300.10±0.14273.36±20.48FCR1.16±0.00051.08±0.061.06±0.00051.17±0.08成活率(％)100100100100注表中上標英文字母不同的同行數值間差異顯著或極顯著(其中平均日增重顯著性水平為0.05,相對增重率和SGR顯著性水平為O.CH)。權利要求1、一種富含飼用功能肽的發酵豆粕制備方法，其步驟為a.從原始出發菌種枯草桿菌屬細菌和酵母菌屬真菌中挑取一環菌體，分別接種到LB種子培養基和麥芽汁種子培養基中，于30℃-37℃溫度下，150-170rpm，搖床培養16-24小時后，直到OD600＝0.7-0.9，停止培養，作為種子液。從原始出發菌種乳酸菌屬細菌中挑取一環菌體，接種到乳酸菌屬培養基中，于30℃-35℃溫度下靜止培養40-48小時，作為種子液。b.在液體擴大LB培養基(枯草桿菌屬細菌)和麥芽汁培養基(酵母菌屬真菌)中以1-5％接種量接種種子液，于30℃-37℃溫度下，150-170rpm，搖床培養20—28小時。在液體擴大乳酸菌屬培養基(乳酸菌屬細菌)中以1-5％接種量接種種子液，于30℃-35℃溫度下靜止培養48小時。將枯草芽孢桿菌、啤酒酵母菌、乳酸菌的各種菌株發酵培養液按1.8∶1∶1比例混合均勻，作為豆粕發酵菌種液。c.將b中豆粕發酵菌種液以5％的接種量接種到含水量為50％的豆粕(過40目篩)中，同時加入5％的糖蜜，并混合均勻(初始pH值為7.0)，于40℃溫度下需氧發酵48小時，然后于60℃下干燥制樣，最后對發酵前后豆粕進行營養成分分析。d.發酵豆粕成品經稱量、包裝后放于陰涼干燥處，在室溫下可存放6-9個月。e.發酵后的豆粕即可作為豬、雞、羅非魚等的飼料。2、根據權利要求l所述的富含飼用功能肽的發酵豆粕的制備方法，其步驟a中所述的菌種種子LB培養基按重量百分比含有0.3%—0.5%的氯化鈉、0.3%—0.5%的蛋白胨和0.5%—1.0%酵母膏，乳酸菌屬培養基含有0.2%-0.4%的胰蛋白胨、0.3%-0.5。/。的NaCl、0.2°/。-0.4%的葡萄糖、0.3%的KH2P04、0.3%的K風、0.02%的MgCl2、0.005%的CaS(X和0.2%的淀粉，麥芽汁培養基含有10%的麥芽膏粉和0.01%的氯霉素。3、根據權利要求1所述的富含飼用功能肽的發酵豆粕的制備方法，其步驟a中所述的菌種為枯草芽孢桿菌(5ac!7^tf3株、啤酒酵母菌(&cctora，'c^1株以及乳酸菌(丄at'to6ac!'〃Ks)1株、。全文摘要本發明公開了一種富含飼用功能肽的發酵豆粕制備方法。本發明涉及以去皮豆粕為原料，利用微生物發酵技術有效去除豆粕中各種抗營養因子，同時得到含有大量多肽發酵豆粕的一種生產工藝，尤其涉及一種多菌種混合固體發酵制備富含飼用功能肽豆粕的微生物發酵工藝。將擴大培養好的枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)3株、啤酒酵母菌(Saccharomycescrevisiae)1株以及乳酸菌(Lactobacillus)1株的發酵培養液按1.8∶1∶1比例混合均勻，以5％的接種量接種到含水量為50％的棉籽粕(過40目篩)中，同時加入5％的糖蜜，并混合均勻(初始pH值為7.0)，于40℃溫度下需氧發酵48小時，然后于60℃下干燥制樣，最后對發酵前后豆粕進行營養成分分析。發酵豆粕成品經稱量、包裝后放于陰涼干燥處，在室溫下可存放6-9個月。發酵后的豆粕即可作為豬、雞、羅非魚等的飼料。文檔編號A23K1/00GK101455267SQ200810219198公開日2009年6月17日申請日期2008年11月18日優先權日2008年11月18日發明者丘銀清,葉明強,徐志宏,潘木水,羅國慶,趙祥杰,鄺哲師,薇陳申請人:廣東省農業科學院農業生物技術研究所;廣東寶桑園健康食品研究發展中心