專利名稱：：遠源百合雜交植株的培育方法
技術領域：
：本發明涉及雜交植株培育方法，特別是涉及遠源百合雜交植株的培育方法。
背景技術：
：百合是百合科(Liliaceae)百合屬(Lillium)植物的總稱，多年生草本。目前，全球約有115種，我國已發現有55個種，18個變種，占世界百合屬植物的一半。20世紀初，國外以荷蘭、日本和美國為中心，開展了百合的育種工作，利用本身已經優良的東方系、麝香系和亞洲系百合進行組間和種間雜交，培育出具有良好商業性狀的新品種，推出OT和LA系列雜交新品種。目前市場上主要的百合切花品種集中在亞洲系(Asiatichybrids)、東方系(Orientalhybrids)、麝香系(Longiflommhybrids)、OT型、LA型等5個品系上。我國對百合雜交后代的培育，僅局限于百合野生資源的種質之間，進行種間雜交，到現在三十多年來沒有新品種獲得商業價值。種間雜交及多倍化育種是國外花卉育種的重要途徑，百合育種更是如此。在百合常規雜交育種過程中，所選配的許多雜交組合或者完全不親和，或者雖然親和，但胚發育不全，致使雜交不易成功。百合種間雜交的不親合一直是困擾國內外百合雜交育種的技術難題。國外對AO、OT和LA曾經采用柱頭離體受精的方法進行過組間雜交，但目前還未見LOT和OTL型雜交新種質的報道。
發明內容本發明所要解決的技術問題是克服現有技術中百合種間雜交的不親和的缺陷，提供一種遠源百合雜交植株的培育方法，該方法能較好的解決種間雜交的不親和問題為了解決上述技術問題，本發明采用如下的技術方案遠源百合雜交植株的培育方法，包括如下步驟(1)子房和花藥的離體培養將百合切花材料插入水中，采開花前12天的花蕾，分離花蕾中成熟但尚未開放的花苞，滅菌后剝去花瓣，將子房和花藥分別接入MS培養基十0.02mg/l萘乙酸的培養基中培養；(2)離體授粉47天后，將母本的子房切斷，直接授粉于子房的切斷面上，將授粉后的子房置于MS培養基+0.02mg/l萘乙酸的培養基中培養；(3)胚培養4550天后，取出膨大而變黃的子房，剝出胚珠接種于誘導培養基中，培養100120天后將胚珠中的胚剝取，接種至MS培養基+0.02mg/l萘乙酸的培養基中，7IO天后即得雜交植株；其中誘導培養基的組成為以MS為基本培養基，含6%蔗糖、0.010.05mg/l萘乙酸、7g/l瓊脂，PH值為5.8。在上述的步驟(2)中，母本的子房最好在距離頂端l2cm處切斷。授粉后的子房的培養條件為25'C、光照強度15001ux、光照時間12小時。上述步驟(1)具體為將百合切花材料插入水中，采開花前12天的花蕾，分離花蕾中成熟但尚未開放的花苞，置于75%酒精中浸泡12分鐘，取出，無菌水清洗3次，0.1%HgCl消毒46分鐘，無菌水再清洗3次，用無菌濾紙吸干水份，剝去花瓣，將子房和花藥分別接入MS培養基+0.02mg/l萘乙酸的培養基中培養。上述步驟(3)具體為4550天后，取出膨大而變黃的子房，剝出胚珠接種于誘導培養基中，在25'C下暗培養21天，然后25'C、15001ux白熾燈條件下全天光照培養21天，此后晚上八點打開白熾燈、早上八點關閉進行培養，100120天后將胚珠中的胚剝取，接種至MS培養基+0.02mg/l萘乙酸的培養基中培養，710天后即得雜交植株。前述遠源百合的母本為L型百合，父本為OT型或O型百合。其中所述L型百合為新鐵炮，OT型百合為黃色風暴，O型百合為蒂伯。國外對AO、OT和LA進行過組間雜交，但還未見LXOT型雜交新種質的報道。本發明通過離體培養對麝香百合系L型"新鐵炮"和OT型"黃色風暴"及O型百合"蒂伯"進行組間雜交，采用前述子房切斷的授粉方式以及離體胚搶救技術來克服受精前后的障礙，獲得了LXOT、LXO的新型百合雜交后代。發明人對不同的授粉方式、滅菌方式以及培養基都進行了研究，具體如下一、材料和方法材料雜交品種OT型"黃色風暴"(L.'yellowenn')、麝香百合系L型"新鐵炮"(L.'formolingi')及O型百合"蒂伯"(L.'Tiber')三個品種，無菌條件下接種在培養基中。方法1.1子房、花藥離體培養在超凈工作臺上，取成熟但尚未開放的花苞，滅菌，剝去花瓣，將子房和花藥分別接入MS+0.02mg/l萘乙酸培養基中，觀察4-5天再進行雜交授粉。雜交組合為LXOT、OTXL和LX01.2授粉方法采用常規授粉和非常規授粉的方法。常規授粉是將花粉直接授在柱頭上，非常規授粉分為切柱頭授粉、柱頭嫁接和子房切斷。其中，切柱頭授粉是將柱頭切掉，直接授粉于花柱上;柱頭嫁接時將花柱切短并將柱頭對換；子房切斷是將子房切掉l2mm左右并直接授粉在切斷后的子房上面，將授粉后的子房置于MS+0.02mg/1萘乙酸的培養基中，培養45-50天。1.3胚培養授粉后45-50天，取出膨大的子房，將種子剝出進行離體培養，分別置于不同濃度培養基共9種蔗糖濃度分別為3%、6%和9%，萘乙酸的濃度分別為0.01mg/1、0.02mg/l和0.05mg/l，瓊脂7g/l，調節PH值為5.8。進行三周暗培養，溫度為25。C。然后全天光照在15001ux白熾燈下，溫度為25。C，保持三周。再次調整光照時間，晚上八點將白熾燈打開，早晨八點關閉，保持12小時光照。二、結果與分析2.1不同滅菌方式對子房離體培養的影響子房、花藥的離體培養中，消毒滅菌是很重要的步驟，它是影響遠緣雜交的外界因素，直接關系到種子成活率。如果消毒不徹底，會引起細菌或真菌感染，導致子房和花藥死亡。在實驗過程中，因為接種操作不規范等引起的細菌感染，可以采取二次滅菌的方式，將子房根部切斷再消毒，使污染率進一步降低。本次實驗為篩選出最適宜的培養基，先進行前期對比實驗，選取162個花苞，分別用75%酒精和0.P/。Hgcl進行消毒然后清洗，根據消毒時間的不同，篩選出最佳消毒時間為先進行酒精消毒2min然后升汞消毒6min(如表l所示)，成活率達到93.75%。通過對比消毒時間，余下的花苞均采用先酒精消毒2min然后升汞消毒6min的方式進行消毒，以獲得較高的花苞成活率。表l不同滅菌方式對子房離體培養的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>2.2不同授粉方式對雜交結實的影響與分析在離體培養條件下，為克服授精障礙采取的非常規授粉方法是很有效的，子房膨大率達到42.6%，且獲得有胚的種子。而作為對照組常規授粉的母本，在子房膨大之前就出現枯萎現象，12天便枯萎了，幾乎沒有出現膨大，不能得到正常發育的種子。由表2可以看出，切割子房的方法種子結實率相對較高。表2不同授粉方式的雜交結果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>2.3誘導培養基的蔗糖濃度和萘乙酸濃度對種子培養的影響與分析由表3可以看出，蔗糖濃度對種子培養的影響比較顯著，6%的培養基最適宜種子的培養，當萘乙酸濃度為0.02mg/l時，種子成活率比較高。本次實驗中，種子在蔗糖濃度為6%的培養基中成活率均在50%以上，比較適合種子的生長發育。經過100-120天的胚珠培養，可獲得少量胚，將胚剝出胚珠接種在培養基上，7-10天即可萌發成苗。表3不同濃度培養基對種子成活的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>三、結論與討論國外對AO、OT和LA曾經采用柱頭離體受精的方法進行過組間雜交，但未見LOT和OTL型雜交新種質。本發明對此進行研究，選取的材料麝香百合L"新鐵炮"具有生長周期較短、莖強度和花朵品質的維持較好、多數情況下對缺光不敏感的優點。而本身為雜交品種的OT"黃色風暴"花呈淡黃色且花朵大、生命力強、花型美麗、具芳香氣息。期望把兩者間的有益性狀結合在一起，培育出生長周期較短，莖強度和花朵品質好，對缺光的敏感性小，且花色、花型都比較豐富的新品種。通過實驗室條件下的花藥離體培養，對LX0T、0TXL及LX0進行雜交，獲得了雜種胚和植株。采用子房膨大率和種子成活率為種間雜交親和力的判定指標，篩選出最適宜的消毒方法和時間、最佳培養基和最佳授粉方式。經過篩選，采取先用酒精消毒2min然后升汞消毒6min的方法污染率最低。蔗糖濃度為6%，萘乙酸濃度為O.02mg/l的培養基為最佳培養基，最適合種子的培養。與現有技術相比，本發明采用非常規的授粉方式即將子房切割直接授粉在子房切割面上，花粉管不用通過柱頭和花柱，而是直接進入子房最后到達胚囊，釋放精子并分別與卵細胞及極核結合形成完整的胚及胚乳，通過此授粉方式可以得到有胚的種子，并能成功獲得雜交苗，證明該方法可以克服遠源雜交不親和的問題，能較好的提高種子結實率，具有很好的推廣應用價值。具體實施例方式本發明的優選實施方式取材從市場上購買麝香百合系L型"新鐵炮"和0T型百合"黃色風暴"及0型百合"蒂伯"切花材料，插入水中，選擇無病蟲害的花枝，采開花前l-2天的花蕾。滅菌在超凈工作臺上，選取花蕾種成熟但尚未開放的花苞，置于75%酒精浸泡1分鐘，無菌水清洗3次，再用O.P/。HgCl消毒5min，無菌水再清洗3次。無菌濾紙吸干水分，剝去花瓣，將子房和花藥分別接入MS培養基+0.02mg/l萘乙酸的培養基中培養，培養條件為25。C、光照強度15001ux、光照時間12小時。滅菌是關鍵之一，滅菌時間太長，花粉及子房易受到傷害，滅菌時間太短又會因污染而失敗，故操作應特別小心。離體授粉培養6天后，選擇無菌的子房和花藥，花藥最好選擇已完全開裂的，采用子房切斷的方式進行非常規授粉，即將"新鐵炮"的子房在距離頂端l2cm處切斷，采無菌的"黃色風暴"和"蒂伯"花粉分別直接授粉于不同的切斷后的子房上面，將授粉后的子房置于MS培養基+0.02mg/l萘乙酸的培養基中在常規組培條件下培養。胚珠培養授粉后15天左右可看出部分子房會開始膨大，大部分會漸漸變黃枯萎，培養45-50天后，少數子房膨大而開始變黃。此時取出膨大且變黃的子房，將胚珠剝出進行離體培養，接種于以下培養基中以MS為基本培養基，蔗糖濃度為6%，萘乙酸濃度為0.03mg/1，瓊脂7g/l，調節PH值為5.8。在25'C下暗培養21天，然后25'C、15001ux白熾燈條件下全天光照培養21天，此后晚上八點打開白熾燈、早上八點關閉進行培養，保持12小時光照。胚培養胚珠培養100-120天后，胚珠中可見少數明顯的正常胚或球形的胚。剝取其中的胚接種至MS培養基+0.02mg/l萘乙酸的培養基中，約7-10天后可成苗，即可獲得其雜種植株，該雜種植株即為LXO雜種苗和LXOT雜種苗。遠源雜種的鑒定采用核型分析、同工酶及RAPD分子標記技術可鑒定出遠源雜種的真假，具有親本核型特征的即為真雜種，同工酶及RAPD分析表明，真雜種除了具有父母本的帶型外，還會產生不同于親本的新帶型。遠源雜種百合的繁育按常規百合的繁育技術進行，組培快繁的配方為MS培養基附加6%的蔗糖，生根培養基為MS培養基附加6。/。的蔗糖和0.01mg/l萘乙酸。試管苗(或球)在2-4。C的低溫下處理37-50天，然后栽入腐葉土中，在海拔2000m左右種植。小籽球采收后，在2-5。C的低溫下處理70-90天可以打破休眠，然后在海拔2000-2400m左右，土壤pH值為5.5-6.5的地方種植，進行第二次繁球。有多數籽球可形成商品開花種球，開花后可用于新類型百合品種選育。權利要求權利要求1一種遠源百合雜交植株的培育方法，包括如下步驟(1)子房和花藥的離體培養將百合切花材料插入水中，采開花前1～2天的花蕾，分離花蕾中成熟但尚未開放的花苞，滅菌后剝去花瓣，將子房和花藥分別接入MS培養基+0.02mg/l萘乙酸的培養基中培養；(2)離體授粉4～7天后，將母本的子房切斷，直接授粉于子房的切斷面上，將授粉后的子房置于MS培養基+0.02mg/l萘乙酸的培養基中培養；(3)胚培養45～50天后，取出膨大而變黃的子房，剝出胚珠接種于誘導培養基中，培養100～120天后將胚珠中的胚剝取，接種至MS培養基+0.02mg/l萘乙酸的培養基中，7～10天后即得雜交植株；其中誘導培養基的組成為以MS為基本培養基，含6％蔗糖、0.01～0.05mg/l萘乙酸、7g/l瓊脂，PH值為5.8。2.按照權利要求l所述遠源百合雜交植株的培育方法，其特征在于步驟(2)中，將母本的子房在距離頂端l2cm處切斷。3.按照權利要求1或2所述遠源百合雜交植株的培育方法，其特征在于步驟(2)中，授粉后的子房的培養條件為25'C、光照強度15001ux、光照時間12小時。4.按照權利要求l所述遠源百合雜交植株的培育方法，其特征在于步驟(1)為將百合切花材料插入水中，采開花前12天的花蕾，分離花蕾中成熟但尚未開放的花苞，置于75%酒精中浸泡12分鐘，取出，無菌水清洗3次，0.1^HgCl消毒46分鐘，無菌水再清洗3次，用無菌濾紙吸干水份，剝去花瓣，將子房和花藥分別接入MS培養基+0.02mg/l萘乙酸的培養基中培養。5.按照權利要求l所述遠源百合雜交植株的培育方法，其特征在于步驟(3)為4550天后，取出膨大而變黃的子房，剝出胚珠接種于誘導培養基中，在25。C下暗培養21天，然后25。C、15001ux白熾燈條件下全天光照培養21天，此后晚上八點打開白熾燈、早上八點關閉進行培養，100120天后將胚珠中的胚剝取，接種至MS培養基十0.02mg/l萘乙酸的培養基中培養，710天后即得雜交植株。6.按照權利要求1一4任一所述遠源百合雜交植株的培育方法，其特征在于所述遠源百合的母本為L型百合，父本為0T型或0型百合。7.按照權利要求5所述遠源百合雜交植株的培育方法，其特征在于所述L型百合為新鐵炮。8.按照權利要求5所述遠源百合雜交植株的培育方法，其特征在于所述OT型百合為黃色風暴。9.按照權利要求5所述遠源百合雜交植株的培育方法，其特征在于所述0型百合為蒂伯。全文摘要本發明提供了一種遠源百合雜交植株的培育方法，克服了現有技術種遠源雜交不易親和的問題，本發明將子房和花藥的進行離體培養，然后采用將子房切斷的非常規授粉方式進行離體授粉，此后進行胚培養即可得雜交植株，采用本發明的方法得到了雜種苗，證明本發明方法成功的克服了遠源雜交不親和的問題，能較好的提高種子結實率，具有很好的推廣應用價值。文檔編號A01H4/00GK101411304SQ20081030166公開日2009年4月22日申請日期2008年5月19日優先權日2008年5月19日發明者妍劉,劉武林,劉飛虎,張朝君,王繼華,寧趙,鄭思鄉申請人:貴州省園藝研究所;云南大學;云南省農業科學院花卉研究所