檢測草甘膦及其代謝物的方法和組合物的制作方法

專利名稱：檢測草甘膦及其代謝物的方法和組合物的制作方法
專利說明檢測草甘膦及其代謝物的方法和組合物 發明領域 本發明涉及檢測草甘膦和/或它的代謝物在各種測試基質(matrices)中的存在或含量。

背景技術：
草甘膦(DPX-B2856)是廣泛用于農作物(crops)的非選擇性除草劑中的活性成分，其中所述農作物已經被進行遺傳修飾，以抵抗該除草劑活性。草甘膦抑制芳香族氨基酸在植物中的生物合成所需的EPSPS(烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶)酶。已經通過在植物中用微生物起源的EPSPS(烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶)、GOX(草甘膦氧化還原酶)和glyat(草甘膦N-乙酰轉移酶)酶變體對該植物進行遺傳修飾而實現農作物對草甘膦的耐藥性。EPSPS變體破壞草甘膦對EPSPS酶的活性，在植物中留下完整(intact)的草甘膦。GOX變體通過的脫羧成AMPA而解毒草甘膦。Glyat變體提供通過草甘膦分子的酶促乙酰化，而形成非植物毒性代謝物N-乙酰草甘膦進行草甘膦解毒的新模式。參見例如Castle等(2004)Science 3041151-1154。需要對草甘膦和草甘膦代謝物在各種測試基質——包括各種動植物基質——中的存在和含量進行調節性監視。
發明概述 本發明提供允許確定草甘膦及其代謝物、衍生物或降解殘余物在各種測試基質中的存在或含量的方法和組合物。包括在該分析方法內的有關的草甘膦代謝降解物是N-乙酰草甘膦、N-乙酰氨甲基膦酸(N-乙酰基AMPA)和氨甲基膦酸(AMPA)。N-乙酰草甘膦和N-乙酰AMPA是在包含glyat(草甘膦N-乙酰轉移酶)基因的基因修飾植物中發現的新的草甘膦代謝物。在一種方法中，確定N-乙酰草甘膦和/或N-乙酰AMPA在測試樣品中的存在或含量包括提供懷疑包含N-乙酰草甘膦和/或N-乙酰AMPA的測試樣品；從該測試樣品提取包含N-乙酰草甘膦和/或N-乙酰AMPA的組合物；和檢測所述組合物的N-乙酰草甘膦和/或N-乙酰AMPA。
在其它方法中，確定了測試樣品中草甘膦、N-乙酰草甘膦、N-乙酰AMPA和/或AMPA或者它們的代謝物的至少一種的存在或含量。這種方法包括提供懷疑包含N-乙酰草甘膦和/或N-乙酰AMPA或者它們的代謝物的至少一種的測試樣品；從該測試樣品提取包含草甘膦、N-乙酰草甘膦、N-乙酰AMPA或AMPA或者它們的代謝物的組合物；和檢測草甘膦、N-乙酰草甘膦、N-乙酰AMPA或AMPA或者它們的代謝物的至少一種。在具體實施方式
中，在，沒有衍生化草甘膦、N-乙酰草甘膦、N-乙酰AMPA或AMPA的情況下進行草甘膦、N-乙酰草甘膦、N-乙酰AMPA或AMPA的檢測。
附圖簡述


圖1提了代表性的草甘膦質譜。
圖2提了代表性的N-乙酰草甘膦質譜。
圖3提了代表性的AMPA質譜。
圖4提了代表性的N-乙酰AMPA質譜。
圖5提了代表性的校準曲線。
圖6A和B提了代表性的校準用標準色譜。
圖7提供了采用穩定同位素內標的代表性的5ng/ml草甘膦和AMPA色譜。草甘膦和草甘膦1，2-13C15N穩定同位素在5ng/ml下是等價的并且顯示出一致的峰面積響應(2074，1885)。由于AMPA與草甘膦等價是5ng/ml且AMPA13C15N是5ng/ml，所以同位素峰響應與AMPA/草甘膦的摩爾比(111/169＝0.66≈628/902)一致。
圖8提了代表性的玉米飼料色譜。
圖9提了代表性的玉米粒色譜。

圖10提了代表性的玉米稿稈(stover)色譜。

圖11提了代表性的玉米油色譜。

圖12提了代表性的玉米面粉色譜。

圖13提了代表性的玉米渣(grit)色譜。

圖14提了代表性的玉米淀粉色譜。

圖15提了代表性的玉米粗粉(meal)色譜。

圖16提了代表性的大豆飼料色譜。

圖17提了代表性的大豆種子色譜。

圖18提了代表性的大豆干草色譜。

圖19提了代表性的大豆油色譜。
圖20提了代表性的大豆粉色譜。
圖21提了代表性的大豆外皮色譜。
圖22A和B提了代表性的李子色譜。
圖23A和B提了代表性的酸橙色譜。
圖24提供了酸改性劑對草甘膦LC/MS/MS響應的影響。
圖25提供LC/MS/MS分析，其顯示了草甘膦1，2-13C215N和AMPA13C15N標準物的同位素純度評價。
圖26提供了大豆粉LOQ加標樣品(fortification sample)的信噪比和LOD測定。
圖27提供了0.050ppm草甘膦的玉米飼料加標樣品的代表性API4000LC/MS/MS色譜。
圖28提供了0.050ppm N-乙酰草甘膦的玉米飼料加標樣品的代表性API 4000LC/MS/MS色譜。
圖29提供了0.05ppm N-乙酰AMPA的玉米飼料加標樣品的代表性API 4000LC/MS/MS色譜。
圖30提供了0.05ppm AMPA的玉米飼料加標樣品的代表性API4000LC/MS/MS色譜。
圖31提供了第2組、試驗1、葡萄、草甘膦的校準曲線。
圖32提供了第2組、試驗1、葡萄、N-乙酰草甘膦的校準曲線。
圖33提供了第2組、試驗1、葡萄、AMPA的校準曲線。
圖34提供了第2組、試驗1、N-乙酰AMPA的校準曲線。
圖35提供了第2組、試驗1、葡萄、草甘膦、試劑空白試驗的代表性色譜。
圖36提供了第2組、試驗1、葡萄、草甘膦、0.500ng/ml校準用標準物的代表性色譜。
圖37提供了第2組、試驗1、草甘膦、100ng/ml校準用標準物的代表性色譜。
圖38提供了第2組、試驗1、葡萄、草甘膦、未經處理的對照樣品P1763S02-002的代表性色譜。
圖39提供了第2組、試驗1、葡萄、草甘膦、以LOQ加標的樣品P1763S02-004的代表性色譜。
圖40提供了第2組、試驗1、葡萄、草甘膦、以4×LOQ加標的樣品P1763S02-009的代表性色譜。
圖41提供了第2組、試驗1、葡萄、N-乙酰草甘膦、試劑空白試驗的代表性色譜。
圖42提供了第2組、試驗1、葡萄、N-乙酰草甘膦、0.500ng/ml校準用標準物的代表性色譜。
圖43提供了第2組、試驗1、葡萄、N-乙酰草甘膦、100ng/ml校準用標準物的代表性色譜。
圖44提供了第2組、試驗1、葡萄、N-乙酰草甘膦、未經處理的對照樣品P1763S02-002的代表性色譜。
圖45提供了第2組、試驗1、葡萄、N-乙酰草甘膦、以LOQ加標的樣品P1763S02-004的代表性色譜。
圖46提供了第2組、試驗1、葡萄、N-乙酰草甘膦、以4×LOQ加標的樣品P1763S02-009的代表性色譜。
圖47提供了第2組、試驗1、葡萄、AMPA、試劑空白試驗的代表性色譜。
圖48提供了第2組、試驗1、葡萄、AMPA、0.500ng/ml校準用標準物的代表性色譜。
圖49提供了第2組、試驗1、葡萄、AMPA、100ng/ml校準用標準物的代表性色譜。
圖50提供了第2組、試驗1、葡萄、AMPA、未經處理的對照樣品樣品P1763S02-002的代表性色譜。
圖51提供了第2組、試驗1、葡萄、AMPA、以LOQ加標的樣品P1763S02-004的代表性色譜。
圖52提供了第2組、試驗1、葡萄、AMPA、以4×LOQ加標的樣品P1763S02-009的代表性色譜。
圖53提供了第2組、試驗1、葡萄、N-乙酰AMPA、試劑空白試驗的代表性色譜。
圖54提供了第2組、試驗1、葡萄、N-乙酰AMPA、0.500ng/ml校準用標準物的代表性色譜。
圖55提供了第2組、試驗1、葡萄、N-乙酰AMPA、100ng/ml校準用標準物的代表性色譜。
圖56提供了第2組、試驗1、葡萄、N-乙酰AMPA、未經處理的對照樣品樣品P1763S02-002的代表性色譜。
圖57提供了第2組、試驗1、葡萄、N-乙酰AMPA、以LOQ加標的樣品P1763S02-004的代表性色譜。
圖58提供了第2組、試驗1、葡萄、N-乙酰AMPA、以4×LOQ加標的樣品P1763S02-009的代表性色譜。
圖59提供了代表性的N-乙酰草甘膦質譜。
圖60提供了代表性的草甘膦質譜。
圖61提供了代表性的AMPA質譜。
圖62提供了代表性的N-乙酰AMPA質譜。
圖63提供了代表性的校準曲線。
圖64提供了代表性的校準用標準色譜。
圖65提供了代表性的乳(milk)色譜。
圖66提供了代表性的蛋樣品色譜。
圖67A、B和C提供了代表性的小雞肌肉樣品色譜。
圖68提供了代表性的小雞肝臟樣品色譜。
圖69提供了代表性的小雞脂肪樣品色譜。
圖70提供了代表性的母牛肌肉樣品色譜。
圖71提供了代表性的母牛肝臟樣品色譜。
圖72提供了代表性的母牛腎臟樣品色譜。
圖73提供了代表性的母牛脂肪樣品色譜。
圖74顯示出草甘膦1，2-13C2 15N和AMPA 13C 15N標準物的同位素純度評價。對于草甘膦1，2-13C2 15N標準物觀察到的草甘膦雜質(面積70)表示70×100/200552＝0.03％的雜質。對于AMPA 13C 15N標準物觀察到的AMPA雜質(面積624)表示624×100/42461＝1.5％的雜質。
圖75提供乳基質的信噪比和LOD測定。
圖76提供蛋基質的信噪比和LOD測定。
圖77提供肝基質的信噪比和LOD測定。
圖78提供腎基質的信噪比和LOD測定。
圖79提供脂肪基質的信噪比和LOD測定。
圖80提供肌肉基質的信噪比和LOD測定。
發明詳述 現在，將參考附圖，對目前公開的主題在下文中進行更充分地描述，在這些附圖中，目前公開的主題的一些然而并非全部實施方式得以顯示。實際上，目前公開的主題可以以許多不同的形式實施，且不應該被理解為限于在本文中闡述的實施方式；相反，提供這些實施方式，以便本公開內容滿足適用的法律要求。在全文中，同樣的數字指同樣的要素。
在受益于上文描述和相關附圖中給出的教導的情況下，目前公開的主題所屬的領域的技術人員將想到本文闡述的目前公開的主題的許多改變及其他實施方式。因此，可以理解目前公開的主題不限于所公開的具體實施方式
，并且改變及其它實施方式意圖包括在所附權利要求的范圍內。盡管本文使用的具體的術語，但它們僅以一般性和描述性的意義加以使用而不為了限制的目的。
I.概述 本發明提供允許確定草甘膦及其代謝物和/或降解殘余物在各種測試基質中的存在或含量的方法和組合物。對于植物中的草甘膦和AMPA的分析而言存在分析方法。參見例如 Cowell et al.(1986)J.Agric.Food Chem.34955-960；Alferness et al.(April 3，1993)“TouchdownDetermination of Glyphosate and Aminomethylphosphonic Acid in Corn Grain，CornForage，and Corn Fodder by Gas Chromatography and Mass-Selective Detection.”Zeneca Ag Products Analytical Method RR 92-042B，可在U.S.EPA PesticidesAnalytical Methods & Procedures站點(www.epa.gov/oppbead1/methods/ram12b.htm)獲得；以及Method No.405in Manual of Pesticide Residue Analysis Volume I and II available fromBfR Federal Institure for Risk Assessment，official analytical methods forresidues of plant protection products and pesticides(L 00.00 16)(www.bfr.bund.de/cd/1652)。這樣的方法僅僅分析草甘膦和AMPA，而對于檢測則進一步要求衍生化分析物。本發明的方法和組合物允許檢測和/或定量新的glyat代謝物、N-乙酰草甘膦和N-乙酰AMPA，并且進一步提供了使用LC/MS/MS技術而無需衍生化分析物來定量和確證分析草甘膦和相應的代謝物的聯合、高度特異的殘余法(residuemethod)。進一步提供的是從各種代謝物例如從AMPA純化草甘膦的新方法。而且，本發明的方法和組合物通過使用弱的離子對試劑(例如磷酸)來制備用于LC/MS/MS技術的最終樣品和標準溶液，進一步提高檢測草甘膦和/或它的代謝物的總響應和線性。此外，所述方法可以使用提取法，其利用允許可接受的分析物提取效率的含水甲醇/稀酸溶液，并且所述方法可以進一步使用陽離子模式的質譜法。最終，用于草甘膦和AMPA的市售穩定同位素可被用于本發明的方法和組合物，作為用于基體效應歸一化LC/MS/MS響應的內標。從而，本發明的新的方法和組合物提供草甘膦、N-乙酰草甘膦、N-乙酰AMPA和AMPA的有效的定量分析而無基體效應。
如本文所使用，目標分析物包括草甘膦、N-乙酰草甘膦、AMPA和/或N-乙酰AMPA的至少一種。如本文所使用，術語“草甘膦”或“N-(膦酰甲基)甘氨酸”是指具有如下所述的式(I)的化合物。

術語“N-乙酰草甘膦”或“N-乙酰-N-(膦酰甲基)甘氨酸”是指具有如下所述的式(II)的化合物。


酸游離形式 術語“AMPA”或“氨甲基膦酸”或“1-氨甲基膦酸”是指具有如下所述的式(III)的化合物。

術語“N-乙酰AMPA”或“(乙酰氨基甲基)膦酸”或“N-乙酰氨基甲基膦酸”是指具有如下所述的式(IV)的化合物。


(游離酸) 從而，提供了檢測測試樣品中草甘膦、N-乙酰草甘膦、AMPA和/或N-乙酰AMPA的存在或含量的各種方法和組合物。本發明的方法和組合物可用于監測各種測試樣品中草甘膦、N-乙酰草甘膦、N-乙酰AMPA和/或AMPA的水平，其中所述測試樣品包括農作物、農作物粗農產品和農作物加工部分(process fraction)。
II.確定測試樣品中草甘膦、N-乙酰草甘膦、N-乙酰AMPA或AMPA的至少一種的存在或含量。
提供確定N-乙酰草甘膦和/或N-乙酰AMPA在測試樣品中的存在或含量的方法和組合物。所述方法包括提供懷疑包含N-乙酰草甘膦和/或N-乙酰AMPA的測試樣品，從該測試樣品提取包含N-乙酰草甘膦和/或N-乙酰AMPA的組合物；和檢測該提取物中的N-乙酰草甘膦和/或N-乙酰AMPA。
進一步提供了確定測試樣品中草甘膦、N-乙酰草甘膦、N-乙酰AMPA和/或AMPA或者它們的代謝物的至少一種的存在或含量的方法和組合物。所述方法包括提供懷疑包含草甘膦、N-乙酰草甘膦、N-乙酰AMPA和/或AMPA或者它們的代謝物的至少一種的測試樣品，從該測試樣品提取包含草甘膦、N-乙酰草甘膦、N-乙酰AMPA和/或AMPA或者它們的代謝物的至少一種的組合物；和檢測該提取物中的草甘膦、N-乙酰草甘膦、N-乙酰AMPA和/或AMPA或者它們的代謝物的至少一種，其中在具體實施方式
中，草甘膦、N-乙酰草甘膦、N-乙酰AMPA或AMPA的檢測在沒有衍生化草甘膦、N-乙酰草甘膦N-乙酰AMPA和/或AMPA的情況下進行。在各測試的基質中，這樣的方法具有0.050mg/kg(ppm)或0.025mg/kg(取決于樣品基質)的目標分析物的目標定量限(LOQ)并且在0.050mg/kgg和0.50mg/kg下確認。
如本文所使用，“測試樣品”可以包括可包含一種或多種感興趣的靶分析物的任何樣品。在一些實施方式中，測試樣品包括生物樣品或環境樣品。因此，測試樣品可以來自于動物(例如哺乳動物，包括但不限于農業動物、家畜、狗、貓、馬、人等等)。在其它實施方式中，測試樣品不是細菌，例如大腸桿菌(E.coli.)。在其它實施方式中，測試樣品來自于植物。
如本文所使用，術語“植物”包括植物細胞、植物原生質體、從其可以再生植物的植物細胞組織培養物、植物愈傷組織、植物塊、外植體、植物組織、飼料、稿稈、干草、外皮、粗渣、和在植物或植物部分中完整的植物細胞，其中所述植物部分例如胚、花粉、胚珠、種子、葉、花、枝、果實、核、穗、穗軸、殼、莖、根、根尖、花藥等等。谷粒意圖是指通過商業生長物產生的用于除了生長或繁殖該物種之外的目的的成熟種子。因此，來自植物的樣品可以源自于該植物的任何一個部分或多個部分。
來源于植物的測試樣品可以進一步包括粗農產品(RAC)或可包括在植物或其部分的制造期間獲得的樣品。示例性的玉米RAC包括例如飼料、谷粒和稿稈，而示例性的大豆RAC包括例如飼料、種子和外皮。在其它實施方式中，測試樣品包括農作物加工部分，其包括固體加工部分或粗粉加工部分。另外的測試樣品可以包括面粉、淀粉、粗渣、油、成品油、或從植物獲得的粗粉。示例性的玉米加工部分包括面粉、粗渣、粗粉和淀粉。示例性的大豆加工部分包括粗粉和外皮。在一個實施方式中，測試樣品源自于表達草甘膦乙酰轉移酶(GLYAT)多肽的植物。參見，例如WO 02/36782、WO 2005/012515、美國申請公布第2004/0082770號和美國申請第11/507,751號，它們都通過引用并入本文。
在具體實施方式
，測試樣品包括來自植物的固體基質部分。如本文所使用，術語“固體基質樣品”是指固態的任何基質，例如但不限于面粉、粗渣、粗粉、淀粉、組織等等。
測試樣品可以從任何植物種獲得，包括但不限于單子葉植物和雙子葉植物或者水性農作物(watery crops)或酸性農作物(acid crops)。感興趣的植物物種(species)的實例包括但是不限于玉米(corn)(玉蜀黍(Zeamays)，本文也稱為“玉米(maize)”)、蕓苔屬各種(Brassica spp.)(例如甘藍型油菜(B.napus)、(B.rapa)、芥菜型油菜(B.juncea))、尤其是可用作種子油來源(也稱為油菜)的蕓苔屬各種(Brassica)、亞麻(亞麻屬各種(Limum spp.))、紫花苜蓿(紫苜蓿(Medicago sativa))、稻(水稻(Oryza sativa))、黑麥(黑麥(Secale cereale))、高粱(雙色高粱(Sorghumbicolor)、高粱(Sorghum vulgare))、粟(例如，黑黍(紫御谷(Pennisetumglaucum))、黍子(黍(Panicum miliaceum))、粟(小米(Setaria italica))、穇子(finger millet)(穇子(Eleusine coracana))、向日葵(葵花(Helianthusannuus))、紅花(紅花(Carthamus tinctorius))、小麥(小麥(Triticumaestivum))、大豆(大豆(Glycine max))、煙草(煙草(Nicotiana tabacum))、馬鈴薯(馬鈴薯(Solanum tuberosum))、花生(花生(Arachis hypogaea))、棉(海島棉(Gossypium barbadense)、陸地棉(Gossypium hirsutum))、甘薯(甘薯(Ipomoea batatus))、木薯(木薯(Manihot esculenta))、咖啡(咖啡屬各種(Coffea spp.))、椰子(椰子(Cocos nucifera))、菠蘿(菠蘿(Ananascomosus))、檸檬樹(柑橘屬各種(Citrus spp.))、可可(可可樹屬(Theobromacacao))、茶(山茶(Camellia sinensis))、香蕉(芭蕉屬各種(Musa spp.))、鱷梨(鱷梨(Persea americana))、無花果(無花果(Ficus casica))、石榴(番石榴(Psidium guajava))、芒果(芒果(Mangifera indica))、橄欖(油橄欖(Olea europaea))、番木瓜(番木瓜(Carica papaya))、腰果(腰果(Anacardium occidentale))、堅果(堅果(Macadamia integrifolia))、杏仁(扁桃(Prunus amygdalus))、甜菜(甜菜(Beta vulgaris))、甘蔗(蔗屬各種(Saccharum spp.))、燕麥、大麥、蔬菜、水果、觀賞植物(花)、甘蔗、針葉樹、擬南芥屬(Arabidopsis)。
蔬菜包括番茄(番茄(Lycopersicon esculentum))、萵苣(例如山萵苣(Lactuca sativa))、青豆(菜豆(Phaseolus vulgaris))、利馬豆(利馬豆(Phaseolus limensis))、豌豆(山黧豆屬各種(Lathyrus spp.))和香瓜屬(Cucumis)的成員例如黃瓜(黃瓜(C.sativus))、羅馬甜瓜(硬皮甜瓜(C.cantalupensis))和香瓜(香瓜(C.melo))。觀賞植物包括杜鵑花(杜鵑花屬各種(Rhododendron spp.))、八仙花屬(八仙花(Macrophylla hydrangea))、芙蓉屬(芙蓉(Hibiscus rosasanensis))、玫瑰(薔薇屬各種(Rosa spp.))、郁金香(郁金香屬各種(Tulipa spp.))、水仙花(水仙屬各種(Narcissus spp.))、牽牛花(牽牛花(Petunia hybrida))、康乃馨(麝香石竹(Dianthuscaryophyllus))、一品紅(一品紅(Euphorbia pulcherrima))和菊花。
還可以使用任何樹木。可用于實施本發明的針葉樹包括例如松樹例如火炬松(火炬松(Pinus taeda))、濕地松(濕地松(Pinus elliotii))、西黃松(西黃松(Pinus ponderosa))、黑松(扭葉松(Pinus contorta))和輻射松(輻射松(Pinus radiata))；花旗松(Douglas fir)(花旗松(Pseudotsugamenziesii))；異葉鐵杉(加拿大鐵杉(Tsuga canadensis))；美國西加云杉(白云杉(Picea glauca))；紅杉(紅杉(Sequoia sempervirens))；真冷杉(truefirs)例如銀杉(太平洋冷杉(Abies amabilis))和香脂冷杉(香脂冷杉(Abiesbalsamea))；和雪松例如北美香柏(美國西部側柏(Thuja aplicata))和阿拉斯加黃色雪松(Chamaecyparis nootkatensis)。闊葉樹也可以被使用，其包括灰樹、白楊、山毛櫸、椴樹、樺樹、黑櫻桃、黑胡桃、七葉樹、美洲栗、三角葉楊、山茱萸、榆樹、樸樹、山核桃、冬青、洋槐、木蘭、楓樹、橡樹、白楊、紅榿木、紫荊、日本泡桐、檫樹、楓香、美國梧桐、藍果樹、柳樹、黃楊。
在具體實施方式
中，測試樣品來自于農作物植物(例如，玉米(也稱為“玉米(maize)”、紫花苜蓿、向日葵、蕓苔(Brassica)、大豆、棉、紅花、花生、高粱、小麥、粟、煙草等)。
測試樣品可源自其它感興趣的植物，包括提供感興趣的種子的谷物植物、含油種子植物和豆類植物。感興趣的種子包括谷物種子，例如玉米、小麥、大麥、稻、高粱、黑麥等。含油種子植物包括棉、大豆、紅花、向日葵、蕓苔(Brassica)、玉米、紫花苜蓿、棕櫚、椰子等。豆類植物包括豆類和豌豆。豆類包括瓜爾豆、槐豆、苦豆、大豆、四季豆、豇豆、綠豆、利馬豆、蠶豆、小扁豆、鷹嘴豆等等。
測試樣品還可以源自于其它感興趣的植物，包括草坪草，例如來自早熟禾屬(Poa)、剪股草屬(Agrotis)、羊茅屬(Festua)、黑麥草屬(Lolium)和結縷草屬(Zoysia)的草坪草。另外的草坪草可以來自黍亞科。草坪草可以進一步包括但不限于格蘭馬草(格蘭馬草(Boutelouagracilis(H.B.K.)Lag.Ex Griffiths))；野牛草屬(野牛草(Buchloedactyloids(Nutt.)Engelm.))；弱匍匐紫羊茅(弱匍匐紫羊茅(Festuca rubrassp.Litoralis))；紫羊茅(紫羊茅(Festuca rubra))；細弱剪股穎(細弱剪股穎(Agrostis tenuis Sibth.))；匍匐翦股穎(匍匐翦股穎(Agrostis palustrisHuds.))；扁穗冰草(扁穗冰草(Agropyron cristatum(L.)Gaertn.))；硬羊茅(硬羊茅(Festuca longifolia Thuill.))；草地早熟禾(草地早熟禾(Poapratensis L.))；黑麥草(黑麥草(Lolium perenne L.))；普通早熟禾(普通早熟禾(Poa trivialis L.))；垂穗草(垂穗草(Bouteloua curtipendula Michx.Torr.))；無芒雀麥草(無芒雀麥草(Bromus inermis Leyss.))；葦狀羊茅(葦狀羊茅(Festuca arundinacea Schreb.))；早熟禾(早熟禾(Poa annua L.))；意大利黑麥草(多花黑麥草(Lolium multiflorum Lam.))；小糠草(小糠草(Agrostis alba L.))；日本草坪草(日本結縷草(Zoysia japonica))；狗牙草(狗牙草(Cynodon dactylon)；百慕達草(Cynodon spp.L.C.Rich)；非洲狗牙根(Cynodon transvaalensis))；海濱雀稗(海濱雀稗(Paspalum vaginatumSwartz))；結縷草屬(細葉結縷草(Zoysia spp.Willd)；日本結縷草(Zoysiajaponica)和溝葉結縷草(Z.matrella var.matrella))；百喜草(百喜草(Paspalum notatum Flugge))；地毯草(近緣地毯草(Axonopus affinisChase))；假儉草(假儉草(Eremochloa ophiuroides Munro Hack.))；隱花狼尾草(東非狼尾草(Pennisetum clandesinum Hochst Ex Chiov))；匍伏翦股穎(Browntop bent)(細弱翦股穎(Agrostis tenuis)，又名茵陳蒿(A.capillaris))；絨毛翦股穎(絨毛翦股穎(Agrostis canina))；黑麥草(黑麥草(Lolium perenne))；和鈍葉草(鈍葉草(Stenotaphrum secundatum Walt.Kuntze))。另外的感興趣的草包括柳枝黍(柳枝黍(Panicum virgatum))。
在其它實施方式中，測試樣品可以來自于動物。可以使用任何動物，包括例如農用牲畜諸如cops、豬、家禽(雞、鴨等)、豬、羊等。這樣的樣品可源自于動物的任何部分，包括但不限于乳(全脂牛奶、脫脂乳、奶油)、蛋(整蛋、蛋黃、蛋白)、或任何肉類商品諸如肌肉、腎臟、肝臟、脂肪等等。
III.從測試樣品提取草甘膦、N-乙酰草甘膦、N-乙酰AMPA、AMPA及其它代謝物 “提取”意圖是允許將目標分析物從樣品基質或者從其來源的樣品移出的任何方法。如本文所使用，術語“提取”或其引申語不必須指從樣品基質或從其來源的樣品移出除了目標分析物(一種或多種)之外的所有材料或組分。相反，在一些實施方式中，術語“提取”是指相對于在樣品基質中或在從其來源的樣品中存在的一種或多種其它成分，富集一種或多種目標分析物的量的步驟。在一些實施方式中，“提取”步驟可用于除去可能干擾分析物檢測的一種或多種樣品成分，例如可能干擾通過質譜法檢測分析物的一種或多種成分。在其它實施方式中，提取步驟用來從測試樣品基質移出目標分析物，而在另外其它實施方式中，提取步驟用來將樣品中的第一目標分析物與第二目標分析物純化分離或者將目標分析物與干擾物質純化分離。
各種提取可以用于從樣品提取或純化至少一種目標分析物(即草甘膦、AMPA、N-乙酰AMPA和/或N-乙酰草甘膦)。可使用各種稀酸，包括例如包含稀甲酸溶液、稀鹽酸溶液或稀磷酸溶液的溶液。在具體實施方式
中，提取使用例如包含約96％含水的0.1％甲酸/4％甲醇或者約96％含水的0.025N鹽酸/4％甲醇或者在96％水/4％甲醇中的約0.1NHCL或者約0.02M磷酸的溶液。在另外其它實施方式中，提取溶液可以包括包含約0.01％至約10％甲酸、約0.01％至約1％甲酸、約0.1％至約1％甲酸、或約0.1％至約5％甲酸的稀甲酸溶液。在另外其它實施方式中，提取溶液可以包括包含約0.0025N至約0.25N鹽酸、約0.025N至約0.25N鹽酸、約0.0025N至約0.025N鹽酸的稀鹽酸溶液。在進一步的實施方式，稀磷酸溶液可以包含約0.002M至約0.2M磷酸、約0.002M至約0.02M磷酸或約2M至約0.02M磷酸。所使用的提取溶液可以根據測試樣品而改變。例如，可使用稀鹽酸代替甲酸來增加酸性，用于從各種基質例如玉米面粉和粗粉加工部分更有效提取N-乙酰草甘膦、草甘膦、AMPA和/或N-乙酰AMPA。可選地，稀磷酸可用于從油測試樣品有效提取N-乙酰草甘膦、草甘膦、N-乙酰AMPA和/或AMPA。
在具體的實施方式中，用含水的稀酸/甲醇溶液進行提取。在進一步的實施方式，所使用的提取法足以允許從基質提取分析物的效率達到至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％99％或100％。在具體的實施方式中，各種目標分析物的提取效率通過代謝作用研究而非通過表面應用研究來建立。
可以進行多重液-液提取來從測試樣品提取分析物(一種或多種)，包括1、2、3、4、5種或以上。如在實驗部分中進一步詳細概述的，進一步認識到，所使用的提取體積可以根據基質的含水量而改變。例如，具有較低含水量的測試樣品(即稿稈、干草、殼等)可需要較大的提取溶液體積和增加的提取次數。
在稀酸提取之后，可以使用另外的提取步驟來從各種保留在樣品中的污染物進一步純化目標分析物。例如，可以進行水-有機物萃取步驟，例如稀酸/二氯甲烷分配。在這樣的提取中，目標分析物保持在水相中，其接著可以施加于提取柱。在具體實施方式
中，如上所述，用于二氯甲烷提取的稀酸包括稀的甲酸溶液、稀鹽酸溶液或稀的磷酸溶液。
通過使用固相提取(SPE)柱，可以從測試樣品的其它成分提取或純化一種或多種目標分析物或者使一種或多種目標分析物互相提取或純化。如本文所使用，“提取柱”用來從非保持的材料提取保持的材料，從而允許獲得“純化”的樣品，用于進一步純化或分析。還可以使用多重提取柱，包括1、2、3、4、5種或以上。在具體的實施方式中，提取或純化步驟包括(a)將樣品布置在提取柱上；(b)在目標分析物(一種或多種)得以保持在提取柱上的條件下，洗滌提取柱；和，(c)從提取柱洗脫該保持的分析物(一種或多種)。在一些實施方式中，所使用的一種或多種提取柱是疏水性二氧化硅基鍵合相提取柱(hydrophobicsilica-based bonded phase extraction column)(即C-18柱)、陽離子交換提取柱(即間二乙烯基苯/N-乙烯基吡咯烷酮共聚物，具有磺酸取代基)或陰離子交換提取柱(即間二乙烯基苯/N-乙烯基吡咯烷酮共聚物，具有季胺取代基)或它們的組合物。在一個實施方案中，使用液-液提取、提取柱或它們的任何組合，從樣品基質提取一種或多種目標分析物。
取決于所使用的測試樣品和目標分析物，不同的提取柱可用于從該測試樣品基質提取該目標分析物(即草甘膦、AMPA、N-乙酰AMPA和/或N-乙酰草甘膦)。例如，對于固體基質樣品提取物的分析，在水-有機物液-液提取之后，如上所述，疏水性二氧化硅基鍵合相提取柱可用于純化草甘膦、AMPA、N-乙酰AMPA和N-乙酰草甘膦。在具體的實施方式中，疏水性二氧化硅基鍵合相提取柱包括C18提取柱。在疏水性二氧化硅基提取柱之后，可以使用另外的提取柱來進一步純化目標分析物。
對于一些樣品基質，固相提取步驟的應用可以與稀酸/甲醇提取步驟一起進行。例如，就肉商品基質而言，固相提取吸附劑(例如C18)可以被添加至勻化的組織樣品。該勻化組織與固相提取吸附劑混合，并添加稀酸/甲醇溶液。可以進行洗脫和收集被固相提取吸附劑結合的分析物。
在另外其它實施方式中，對于乳和蛋商品而言，測試樣品與含水0.1％甲酸/甲醇(96/4，v/v)混合。然后，在離心后添加己烷。然后，對水層進行二氯甲烷提取。然后進行兩次另外的0.1％甲酸/甲醇(96/4，v/v)提取。
在具體的實施方式中，在從提取的測試樣品色譜分離目標分析物之前，將足夠的濃度的弱離子配偶(pairing)試劑添加至提取物。弱離子配偶試劑的足夠濃度是允許草甘膦、N-乙酰草甘膦、N-乙酰AMPA和/或AMPA的響應和線性改善的濃度。在具體的實施方式中，弱離子配偶試劑是磷酸。在具體的實施方式中，最終提取物在含水0.02M磷酸中制備并在LC/MS/MS分析之前進行過濾。草甘膦和AMPA穩定同位素可以被添加至最終提取溶液，作為對于基體效應進行歸一化的內標。
i.從固體基質或動物商品提取AMPA 在具體實施方式
中，通過將疏水二氧化硅基提取柱洗脫物布置在陽離子交換提取柱上，處理來自疏水二氧化硅基提取柱的一部分洗脫物，用于AMPA的分析。在具體實施方式
中，陽離子交換提取柱具有包括具有磺酸取代基的間二乙烯基苯/N-乙烯基吡咯烷酮共聚物的表面官能度。可使用的陽離子交換提取柱的非限制性實例包括MCX SPE柱(Waters Oasis)。如本文別處進一步詳細概述的，可用各種方法將疏水二氧化硅基提取柱的洗脫物布置在陽離子交換提取柱上。
因此，從固體樣品基質提取或純化AMPA的方法可以包括(a)通過液-液提取從測試樣品提取包含AMPA的組合物；(b)將該包含步驟(a)的AMPA的組合物布置在疏水性二氧化硅基鍵合相提取柱上；(c)從步驟(b)的提取柱獲得包含AMPA的洗脫物；(d)將該包含步驟(c)的洗脫物布置在陽離子交換柱上；(e)在AMPA得以保持在該提取柱上的條件下，洗滌該提取柱；和，(f)從該陽離子交換提取柱洗脫保持的AMPA。在具體實施方式
中，從固體基質樣品提取AMPA包括在二氯甲烷分配之后進行稀酸提取。
在一個非限制性實施方式中，測試樣品提取如下進行。使用探針勻化器(probe homogenizer)，將AMPA從植物固體基質提取入稀含水酸(0.1％甲酸或0.025N鹽酸)/甲醇(96/4)中。對于目標分析物的定量回收，進行多次提取(1、2、3、4次或以上)。過濾的含水部分的一部分用二氯甲烷分配，而含水部分被回收并過濾除去微粒。然后，一部分提取物通過C18固相提取(SPE)柱體進行過濾。一部分從C18 SPE柱體收集的洗脫物被稀釋并施加于陽離子交換OasisTM MCX SPE柱體、稀釋并過濾。
在另一個非限制實施方式中，測試樣品包括肉組織商品，并且如下進行提取。如下從肉組織商品提取AMPA(a)勻化該組織；(b)將固相提取吸附劑例如C18添加到該勻化的組織；(c)添加在96％水/4％甲醇中的0.1N HCL；(d)離心樣品并且收集C18顆粒；(e)用水從該固相提取吸附劑洗脫分析物。然后，將一部分洗脫物施加于陽離子OasisTM MCXSPE柱體。
在另一個非限制實施方式中，測試樣品包括乳或蛋商品，并且如下進行提取。將含水0.1％甲酸/甲醇(96/4，v/v)溶液添加至該樣品。進行己烷提取。對水層進行二氯甲烷提取。對水層進行額外的甲酸/甲醇提取(至少1、2、3次或以上)。然后，將一部分洗脫物施加于陽離子OasisTM MCS SPE柱體。
ii.從固體基質或動物商品提取草甘膦、N-乙酰AMPA和/或N-乙酰草甘膦 在其它實施方式中，處理一部分來自疏水二氧化硅基提取柱的洗脫物，用于分析來自固體基質的草甘膦、N-乙酰AMPA和/或N-乙酰草甘膦。在具體實施方式
中，將一部分的該疏水二氧化硅基提取洗脫物布置在陰離子交換提取柱上。該陰離子交換提取柱可以包括表面官能度，所述表面官能度包括具有季胺取代基的間二乙烯基苯/N-乙烯基吡咯烷酮共聚物。這樣的陰離子交換提取柱的非限制性實例包括MAXSPE柱。如本文別處進一步詳細概述的，可用各種方法將疏水二氧化硅基提取柱的洗脫物布置在陰離子交換提取柱上。簡言之，對于玉米、大豆飼料和干草基質，在于甲醇中提取(調節至基本pH)之后，可以使用具有季胺取代基的間二乙烯基苯/N-乙烯基吡咯烷酮共聚物提取柱。在其它方法中，對于大豆種子、粗粉和殼基質的分析，在提取物于水中稀釋步驟之后，可以使用具有季胺取代基的間二乙烯基苯/N-乙烯基吡咯烷酮共聚物提取柱。
因此，從植物固體樣品基質提取或純化草甘膦、N-乙酰AMPA和/或N-乙酰草甘膦的方法可以包括(a)通過液-液提取從測試樣品提取包含草甘膦、N-乙酰AMPA和/或N-乙酰草甘膦的組合物；(b)將該包含步驟(a)的AMPA的組合物布置在疏水性二氧化硅基鍵合相提取柱上；(c)從步驟(b)的提取柱獲得包含草甘膦、N-乙酰AMPA和/或N-乙酰草甘膦的洗脫物；(d)將該包含步驟(c)的洗脫物布置在陰離子交換柱上；(e)在草甘膦、N-乙酰AMPA和/或N-乙酰草甘膦得以保持在該提取柱上的條件下，洗滌該提取柱；和，(f)從該提取柱洗脫保持的草甘膦、N-乙酰AMPA和/或N-乙酰草甘膦。在具體實施方式
中，在二氯甲烷分配之后從固體基質樣品進行草甘膦、N-乙酰AMPA和/或N-乙酰草甘膦的水提取。
在一個非限制性實施方式中，測試樣品提取如下進行。使用探針勻化器，將草甘膦、N-乙酰AMPA和/或N-乙酰草甘膦從植物固體基質或者乳或蛋商品提取入稀含水酸(0.1％甲酸或0.025N鹽酸)/甲醇(96/4)中。對于分析物的定量回收，進行多次提取(1、2、3、4次或以上)。當使用植物固體基質樣品提取物時，一部分提取物用二氯甲烷分配，而含水部分被回收并過濾除去微粒。當使用蛋或乳商品時，在二氯甲烷提取之前可以進行己烷提取。然后，一部分提取物通過C18固相提取(SPE)柱體進行過濾。一部分從C18SPE收集的洗脫物被稀釋并施加于陰離子交換OasisTM MAX SPE柱體。在幾次溶液漂洗后，用在甲醇水(9/1)溶液中的1％三氟乙酸從MAX柱體洗脫分析物。將MAX洗脫物蒸發至干燥并且再溶解于含水0.02M磷酸水溶液、過濾并分析草甘膦、N-乙酰AMPA和/或N-乙酰草甘膦。對于分配之后大豆樣品(即種子和粗粉)的分析，可在蒸汽浴中將提取物樣品加熱大約15分鐘，以在微粒過濾之前沉淀提取物中的其它物質。
在另一個非限制性實施方式中，測試樣品包括肉商品，并且如下進行樣品提取。通過勻化該組織以及隨后添加固相提取吸附劑例如C18，從肉商品提取草甘膦、N-乙酰AMPA和/或N-乙酰草甘膦。將在96％水/4％甲醇中的0.1N HCL添加至該樣品。離心該樣品，并除去上清液。通過將水添加到顆粒，從固相提取吸附劑洗脫分析物。將TEA添加至該樣品，之后進行乙腈提取。然后，將樣品載荷在OasisTM MAXSPE柱體上。洗滌該柱，并且使用在甲醇水(90/10)中的1％TFA從該柱洗脫分析物。將MAX洗脫物蒸發至干燥并再溶解于含水0.02M磷酸水溶液。
iii.從油樣品提取草甘膦、N-乙酰草甘膦、N-乙酰AMPA和/或AMPA 在另外其它實施方式中，當測試樣品包括油樣品時，可用單一步驟提取和純化所有的目標分析物(草甘膦、N-乙酰草甘膦、N-乙酰AMPA和AMPA)。在這樣的實施方式中，不需要使用提取柱。例如，測試樣品可以經歷一系列水-有機物萃取，例如采用稀酸或弱離子對試劑(例如0.02M磷酸)和二氯甲烷。在足夠次數的提取之后，含水部分可用于目標分析物的檢測。對于分析物的定量轉移，可以重復提取2、3、4、5次或以上。在每次分配之后，離心可用于界定相分離。
因此，提供了從油樣品基質提取或純化草甘膦、N-乙酰草甘膦、N-乙酰AMPA和/或AMPA的方法，其包括(a)進行測試樣品的水-有機物提取，包括將足夠濃度的弱離子對試劑或稀酸例如磷酸添加至該測試樣品，其中該足夠濃度的弱離子對試劑或稀酸允許改善草甘膦、N-乙酰草甘膦、N-乙酰AMPA或AMPA的響應和線性；和，(ii)添加有機溶劑；(b)從該水-有機物分配的水相提取目標分析物；和，(c)重復步驟(a)和/或步驟(b)的任何一個足夠的次數，以允許分析物的定量轉移。在具體的實施方式中，水-有機物提取包括磷酸/二氯甲烷分配。
IV.確定草甘膦、N-乙酰草甘膦、N-乙酰AMPA、AMPA及其他在測試樣品中的存在或含量。
在從測試樣品提取一種或多種目標分析物之后，可以使用允許檢測一種或多種所述目標分析物的任何方法。在一個實施方案中，檢測一種或多種目標分析物包括從提取的測試樣品分離(在具體實施方式
中，色譜法分離)至少一種目標分析物并研究色譜法分離的分析物的至少一種以確定草甘膦、N-乙酰草甘膦、N-乙酰AMPA和/或AMPA的至少一種在測試樣品中的存在或含量。
i.從提取的測試樣品分離草甘膦、N-乙酰草甘膦、N-乙酰AMPA和/或AMPA的至少一種 如本文所使用，“色譜法分離”使用“分析柱”或“色譜柱”，其具有足以實現測試樣品基質成分的分離的色譜板。優選地，從分析柱洗脫的成分以這樣的方式進行分離，其使得目標分析物(一種或多種)的存在或含量得以確定。“分析柱”可與“提取柱”不同，其中“提取柱”一般用來從非保持的材料純化或提取保持的材料，從而獲得“純化”的樣品，用于進一步純化或分析。
在具體實施方式
中，目標分析物(即草甘膦、AMPA、N-乙酰AMPA或N-乙酰草甘膦)的每一種可在檢測之前彼此進行色譜法分離。然而，認識到，取決于所使用的檢測方法，可以不必須分離通過色譜法彼此分離每一目標分析物。當作為混合物存在時，這樣的檢測方法允許每一目標分析物得到檢測。
在具體實施方式
中，在上文的進一步詳細描述的提取步驟之后，色譜法分離目標分析物包括(a)將包含提取的分析物(一種或多種)的組合物布置在分析柱上；和(b)從分析柱洗脫分析物(一種或多種)。在一個實施方案中，對目標分析物彼此或測試樣品的其它組分進行色譜法分離，包括使用高效液相色譜(HPLC)柱。可以使用可充分解析目標分析物并允許它們的檢測和/或定量的任何HPLC柱。在具體實施方式
中，HPLC柱包括使用己基烷基連接體(hexyle alkyl linker)的苯相(phenyl phase)。
ii.檢測草甘膦、N-乙酰草甘膦、AMPA、N-乙酰AMPA及其它代謝物 “檢測”意圖確定目標分析物(即草甘膦、N-乙酰草甘膦、N-乙酰AMPA和/或AMPA)在測試樣品中的存在或含量。所述檢測方法不被限制并可以是定性或定量的。在一個實施方案中，檢測草甘膦、N-乙酰草甘膦、N-乙酰AMPA和/或AMPA包括通過質譜儀分析色譜法分離的分析物。在一些非限制性實施方式中，分離和/或檢測并不需要衍生化所述目標分析物。在具體實施方式
中，進行正離子質譜法來檢測目標分析物。
本文中所用的術語“質譜法”或“MS”通常指基于離子的質荷比或“m/z”過濾、檢測和測量離子的方法。在MS技術中，一種或多種目標分子被離子化，并且離子接著被引入質譜儀，在那里，由于磁場和電場的組合，離子沿著空間中取決于質量(“m”)和電荷(“z”)的路徑行走。見例如美國專利第6,107,623號，名稱為“Methods and Apparatusfor Tandem Mass Spectrometry”，通過引用由此并入其全部內容。
在“四極”或“四極離子阱”質譜儀中，振蕩射頻(RF)場中的離子經歷與在電極之間施加的直流(DC)電勢、射頻信號的振幅和m/z成比例的力。可以選擇電壓和振幅，以便僅具有特定m/z的離子移動四極的長度，而全部其它離子偏轉。因此，四極儀器可以作為注入到所述儀器的離子的“濾質器”和“質量檢測器″。
進一步地，MS技術的分辨率可以通過使用“串聯質譜”或“MS/MS”加以提高。串聯質譜法(MS/MS)是給予一組質譜法的名稱，其中從樣品產生的“母(parent)”離子被裂解而產生“子”離子，接著“子(daughter)”離子通過第二MS步驟進行質量分析。MS/MS方法可用于復雜混合物的分析，尤其是生物樣品，部分是因為MS/MS的特異性可以最小化在質譜分析之前對大規模樣品凈化的需要。在MS/MS方法的實例中，母離子從樣品產生并通過第一濾質器(mass fiter)，以選擇具有特定質荷比的那些離子。然后，這些離子被斷裂，一般通過在適當的離子碰撞單元中用中性氣體分子碰撞進行，以產生子離子，其質譜通過第二質量分析器記錄。如此生成的子離子光譜指示母離子的結構，并且該兩個階段的質量過濾可以從存在于復雜混合物的傳統質譜中的干擾物質除去離子。
最常見類型的MS/MS儀器是三重四極型(triple quadrupole)(參見，例如Yost，Enke in Ch.8of Tandem Mass Spectrometry，Ed.McLafferty，pub.John Wiley and Sons，1983)。三重四極MS/MS儀器一般由通過斷裂元件(即碰撞單元)分開的兩個四極濾質器組成，(通常四極濾質器在僅RF模式(RF only mode)下作為離子容納裝置進行操作并含有壓力在1和10毫托之間的碰撞氣體)。許多其它類型“混合”串聯質譜儀是已知的，盡管，包括扇形磁場分析器和四極過濾器的各種組合。這些混合儀器經常包括高分辨率扇形磁場分析器(即，包括以雙聚焦組合排列的磁性和靜電扇形兩者的分析器)作為任一個或兩個濾質器。高分辨率濾質器的使用在將化學噪音降低至極低水平方面卓有成效。
如本文所使用，術語“電子電離”是指其中在氣相或蒸氣相中的一種或多種目標分析物與電子流相互作用的方法。電子與分析物(一種或多種)的撞擊產生分析物離子，其然后經受質譜法技術。
如本文所使用，術語“化學電離”是指其中試劑氣體(例如氨)經受電子撞擊并且通過試劑氣體離子和分析物分子的相互作用形成分析物離子的方法。
如本文所使用，術語“快原子轟擊”是指其中高能原子(通常為Xe或Ar)束撞擊非揮發性測試樣品而釋放出并電離包含于樣品中的分子。樣品溶于粘性液體基質，例如甘油、硫代甘油、間硝基芐醇、18-冠-6冠醚、2-硝基苯基辛基醚、環丁砜、二乙醇胺和三乙醇胺。化合物或樣品的適當基質的選擇是一種經驗過程。
如本文所使用，術語“場致解吸(field desorption)”是指其中非揮發性測試樣品被置于電離表面并且強電場被用于產生分析物離子的方法。
如本文所使用，術語“基質輔助激光解吸離子化”或“MALDI”是指其中非揮發性樣品暴露于激光輻照的方法，其通過各種電離通道，包括光致電離、質子化作用、去質子化作用和簇衰變(cluster decay)，解吸出并電離樣品中的分析物。對于MALDI，樣品與能量吸收基質混合，所述能量吸收基質促進分析物分子的解吸。
如本文所使用，術語“表面增強激光解吸離子化”或“SELDI”是指其中非揮發性樣品暴露于激光輻照的另一種方法，其通過各種電離通道，包括光致電離、質子化作用、去質子化作用和簇衰變，解吸出并電離樣品中的分析物。對于SELDI，樣品一般結合于優先保持一種或多種目標分析物的表面。當在MALDI中，該過程也可使用能量吸收材料來促進離子化。
如本文所使用，術語“電噴射離子化作用”或“ESI”是指其中溶液沿著短長度的毛細管通過的方法，向該毛細管的末端施加高的正或負電勢。到達該管末端的溶液被汽化(使成霧狀)成在溶劑蒸汽中具有微細小滴的射流或噴霧。該小滴的霧流經蒸發室，該蒸發室被稍微加熱，以防止冷凝和汽化溶劑。當小滴變得更小時，電表面電荷密度增加，直到同性電荷之間的自然排斥使得離子以及中性分子得以釋放的時侯。
如本文所使用，術語“大氣壓化學電離”或“APCI”是指類似于ESI的質譜法；然而，APCI通過在大氣壓下發生于等離子區中的離子-分子反應而產生離子。等離子區通過在噴霧毛細管和反電極之間的放電而得以保持。然后，通常利用一組差動泵撇取器站(differentiallypumped skimmer stages)將離子提取入質量分析器。干燥和預熱的N2氣體逆流可用來改善溶劑的去除。對于分析極性較低的種類，APCI中的氣-相離子化可以比ESI更有效。
如本文所使用，術語“大氣壓光致電離”(“APPI”)是指質譜法的形式，其中分子M的光致電離的機理是光子吸收和電子發射，形成分子M+。因為光子能量通常恰在電離電勢之上，所以該分子離子較不易于解離。在很多情況下，在不需要色譜法的情況下分析樣品可以是可能的，因此節約大量的時間和費用。在存在水汽或質子溶劑的情況下，該分子離子可以提取H以形成MH+。如果M具有高質子親和力，這易于發生。這并未影響定量準確性，這是因為M+和MH+的和是常數。在質子溶劑中的藥物化合物通常作為MH+被觀察到，而非極性化合物例如萘或睪酮通常形成M+。Robb，D.B.，Covey，T.R.和Bruins，A.P(2000)參見，例如Robb等，Atmospheric pressurephotoionizationAn ionization method for liquid chromatography-massspectrometry.Anal.Chem.72(15)3653-3659。
如本文所使用，術語“感應耦合等離子體”是指其中樣品在足以和離子化大多數元素的高溫下，與部分電離的氣體相互作用的方法。
如本文所使用，術語“離子化”和“電離”是指產生凈電荷等于一個或多個電子單位的分析物離子的過程。負離子是具有一個或多個電子單位的凈負電荷的那些離子，而正離子是具有一個或多個電子單位的凈正電荷的那些離子。
如本文所使用，術語“解吸”是指從表面和/或分析物進入氣相的入口處分析物的去除。
在其中先驅離子被分離以進一步裂解的那些實施方式中，例如MS/MS，碰撞誘導解離(“CID”)經常被用于產生碎片離子，用于進一步檢測。在CID中，先驅離子通過與惰性氣體碰撞獲得能量，接著通過稱為“單分子分解”的過程而裂解。必須在先驅離子中存儲足夠的能量，以便該離子內的某些鍵可以由于振動能增加而斷裂。
在一些實施方式中，純化或分離步驟的一個或多個“流線(online)”進行。如本文所使用，術語“流線”是指純化或分離步驟以這樣的方式進行，測試樣品被布置入(例如注入)這樣的系統中，其中該系統的各個部件在操作上連接，并且在一些實施方式中，彼此流體連通。這樣的流線系統的代表性部件包括但不限于自動進樣器；一個或多個注射口；一個或多個柱，包括但不限于提取柱，包括提取柱，并且在一些實施方式中，包括分析柱；檢測系統，例如質譜儀系統；一個或多個泵；一個或多個閥；和必要的鉛錘。在這樣的“流線”系統中，測試樣品和/或目標分析物可以從該系統的一個部件通過到達另一個部件，而不需要退出該系統，例如，不需要必須進行收集然后布置入該系統的另一個部件。
在一些實施方式中，流線純化或分離方法可以被自動化。在這樣的實施方式中，一旦過程被被建立并開始，則所述步驟可以在不需要操作員干預的情況下進行。本領域普通技術人員還將理解，流線自動化步驟可以包括利用控制所述系統各個部件——包括泵、閥、自動進樣器等等——的軟件。這樣的軟件可用于通過樣品溶質添加和流速的精確計時來優化提取工藝。
相比之下，術語“離線(offline)”是指純化、分離或提取步驟與隨后的純化或分離步驟和/或分析步驟分開進行。在這樣的離線步驟中，目標分析物通常例如在提取柱上或通過液-液提取法與樣品基質中的其它成分分離，然后進行收集，以接著引入另一個色譜系統或檢測器系統。就操作員而言，離線步驟通常需要人工干預。
V.本發明的
具體實施例方式 在非限制性實施方式中，確定N-乙酰草甘膦在測試樣品中的存在或含量包括(a)提供懷疑包含N-乙酰草甘膦的測試樣品；(b)通過液-液提取法從所述測試樣品提取包含N-乙酰草甘膦的組合物；(c)將步驟(b)的包含N-乙酰草甘膦的組合物布置在C18提取柱上，并從那里洗脫N-乙酰草甘膦；(d)將從步驟(c)洗脫的N-乙酰草甘膦布置在陰離子交換柱上，并從那里洗脫N-乙酰草甘膦，其中所述陰離子交換柱具有這樣的官能表面，其具有含季銨的間二乙烯基苯和N-乙烯基吡咯烷酮共聚物；(e)添加足夠濃度的磷酸至步驟(d)所述的洗脫的N-乙酰草甘膦，其中所述足夠濃度允許在檢測期間改善N-乙酰草甘膦的響應和線性或者其中所述足夠濃度包括約0.02M磷酸的最終濃度；(f)使用苯基-己基高效液相色譜(HPLC)分析柱，色譜法分離N-乙酰草甘膦與步驟(e)的組合物中的其它組分；和(g)通過以正離子模式操作的串聯四極質譜儀分析步驟(f)的色譜法分離的樣品，以確定N-乙酰草甘膦在所述測試樣品中的存在或含量。在具體實施方式
中，液-液提取法包括稀酸和二氯甲烷提取。在進一步的實施方式中，測試樣品包括來自植物的固體基質樣品或者是乳或蛋商品。
在非限制性實施方式中，確定N-乙酰草甘膦在測試樣品中的存在或含量包括(a)提供懷疑包含N-乙酰草甘膦的測試樣品；(b)將所述測試樣品與固相提取吸附劑在允許所述固相提取吸附劑結合N-乙酰草甘膦的條件下混合；(c)通過液-液提取法，提取所述固相提取吸附劑和來自所述樣品的結合的N-乙酰草甘膦；(d)從所述固相提取吸附劑洗脫所述N-乙酰草甘膦；(e)通過液-液提取法從步驟(d)的洗脫物提取包含N-乙酰草甘膦的組合物；(f)將從步驟(e)洗脫的N-乙酰草甘膦布置在陰離子交換柱上，并從那里洗脫N-乙酰草甘膦，其中所述陰離子交換柱具有這樣的官能表面，其具有含季銨的間二乙烯基苯和N-乙烯基吡咯烷酮共聚物；(g)添加足夠濃度的磷酸至步驟(f)所述的洗脫的N-乙酰草甘膦，其中所述足夠濃度允許在檢測期間改善N-乙酰草甘膦的響應和線性或者其中所述足夠濃度包括約0.02M磷酸的最終濃度；(h)使用苯基-己基高效液相色譜法(HPLC)分析柱，色譜法分離N-乙酰草甘膦與步驟(g)的組合物中的其它組分；和(i)通過以正離子模式操作的串聯四極質譜儀分析步驟(h)的色譜法分離的樣品，以確定N-乙酰草甘膦在所述測試樣品中的存在或含量。在具體實施方式
中，步驟(c)的液-液提取法包括稀酸和甲醇提取。在進一步的實施方式，測試樣品包含肉組織商品。
在其它非限制性實施方式中，確定草甘膦在測試樣品中的存在或含量的方法包括(a)提供懷疑包含草甘膦的測試樣品；(b)通過液-液提取法從所述測試樣品提取包含草甘膦的組合物；(c)將步驟(b)的包含草甘膦的組合物布置在C18提取柱上，并從那里洗脫草甘膦；(d)將從步驟(c)洗脫的草甘膦布置在陰離子交換柱上，并從那里洗脫草甘膦，其中所述陰離子交換柱具有這樣的官能表面，其具有含季銨的間二乙烯基苯和N-乙烯基吡咯烷酮共聚物；(e)添加足夠濃度的磷酸至步驟(d)所述的洗脫的草甘膦，其中所述足夠濃度允許在檢測期間改善草甘膦的響應和線性或者其中所述足夠濃度包括約0.02M磷酸的最終濃度；(f)使用苯基-己基高效液相色譜法(HPLC)柱，色譜法分離草甘膦與步驟(e)的其它組分；和(g)通過以正離子模式操作的串聯四極質譜儀分析步驟(f)的色譜法分離的樣品，以確定草甘膦在所述測試樣品中的存在或含量；其中所述草甘膦的檢測在沒有衍生化所述草甘膦的情況下進行。在具體實施方式
中，液-液提取法包括稀含水酸/甲醇溶液和/或稀酸和二氯甲烷提取。在進一步的實施方式中，測試樣品包括來自植物或者蛋或乳商品的固體基質樣品。
在非限制性實施方式中，確定草甘膦在測試樣品中的存在或含量包括(a)提供懷疑包含草甘膦的測試樣品；(b)將所述測試樣品與固相提取吸附劑在允許所述固相提取吸附劑結合草甘膦的條件下混合；(c)通過液-液提取法，提取所述固相提取吸附劑和來自所述樣品的結合的草甘膦；(d)從所述固相提取吸附劑洗脫所述草甘膦；(e)通過液-液提取法從步驟(d)的洗脫物提取包含草甘膦的組合物；(f)將從步驟(e)洗脫的草甘膦布置在陰離子交換柱上，并從那里洗脫草甘膦，其中所述陰離子交換柱具有這樣的官能表面，其具有含季銨的間二乙烯基苯和N-乙烯基吡咯烷酮共聚物；(g)添加足夠濃度的磷酸至步驟(f)所述的洗脫的草甘膦，其中所述足夠濃度允許在檢測期間改善草甘膦的響應和線性或者其中所述足夠濃度包括約0.02M磷酸的最終濃度；(h)使用苯基-己基高效液相色譜法(HPLC)分析柱，色譜法分離草甘膦與步驟(g)的組合物中的其它組分；和(i)通過以正離子模式操作的串聯四極質譜儀分析步驟(h)的色譜法分離的樣品，以確定草甘膦在所述測試樣品中的存在或含量。在具體實施方式
中，步驟(c)的液-液提取法包括稀酸和甲醇提取。在進一步的實施方式，測試樣品包含肉組織商品。
在其它非限制性實施方式中，確定氨甲基膦酸在測試樣品中的存在或含量的方法包括(a)提供懷疑包含AMPA的測試樣品；(b)通過液-液提取法從所述測試樣品提取包含AMPA的組合物；(c)將步驟(b)的包含AMPA的組合物布置在C18提取柱上，并從那里洗脫AMPA；(d)將從步驟(c)洗脫的AMPA布置在陽離子交換柱上，并從那里洗脫AMPA，其中所述陽離子交換柱具有這樣的官能表面，其具有含磺酸取代基的間二乙烯基苯和N-乙烯基吡咯烷酮共聚物；(e)添加足夠濃度的磷酸至步驟(d)所述的洗脫物AMPA，其中所述足夠濃度允許在檢測期間AMPA的響應和線性改善或者其中所述足夠濃度包括約0.02M磷酸的最終濃度；(f)使用苯基-己基高效液相色譜法(HPLC)分析柱，色譜法分離AMPA與步驟(e)的其它組分；和(g)通過以正離子模式操作的串聯四極質譜儀分析步驟(f)的色譜法分離的樣品，以確定AMPA在所述測試樣品中的存在或含量；其中所述AMPA的檢測在沒有衍生化所述AMPA的情況下進行。在具體實施方式
中，液-液提取法包括稀含水酸/甲醇溶液和/或稀酸和二氯甲烷提取。在進一步的實施方式中，測試樣品包括來自植物或者乳或蛋商品的固體基質樣品。
在另一個非限制性實施方式中，確定氨甲基膦酸(AMPA)在測試樣品中的存在或含量的方法包括(a)提供懷疑包含AMPA的測試樣品；(b)將所述測試樣品與固相提取吸附劑在允許所述固相提取吸附劑結合AMPA的條件下混合；(c)通過液-液提取法，提取所述固相提取吸附劑和來自所述樣品的結合的AMPA；(d)從所述固相提取吸附劑洗脫所述AMPA；(e)將從步驟(d)洗脫的AMPA布置在陽離子交換柱上，并從那里洗脫AMPA，其中所述陽離子交換柱包括這樣的官能表面，其具有含磺酸取代基的間二乙烯基苯和N-乙烯基吡咯烷酮共聚物；(f)添加足夠濃度的磷酸至步驟(d)所述的洗脫的AMPA，其中所述足夠濃度允許在檢測期間AMPA的響應和線性改善；(g)使用苯基-己基高效液相色譜法(HPLC)分析柱，色譜法分離AMPA與步驟(f)的洗脫物中的其它組分；和(h)通過以正離子模式操作的串聯四極質譜儀分析步驟(g)的色譜法分離的樣品，以確定AMPA在所述測試樣品中的存在或含量。在進一步的實施方式，測試樣品包含肉組織商品。
在其它非限制性實施方式中，確定N-乙酰AMPA在測試樣品中的存在或含量的方法包括(a)提供懷疑包含N-乙酰AMPA的測試樣品；(b)通過液-液提取法從所述測試樣品提取包含N-乙酰AMPA的組合物；(c)將步驟(b)的包含N-乙酰AMPA的組合物布置在C18提取柱上，并從那里洗脫N-乙酰AMPA；(d)將從步驟(c)洗脫的N-乙酰AMPA布置在陰離子交換柱上，并從那里洗脫N-乙酰AMPA，其中所述陰離子交換柱具有這樣的官能表面，其具有含季胺的間二乙烯基苯和N-乙烯基吡咯烷酮共聚物；(e)添加足夠濃度的磷酸至步驟(d)所述的洗脫的N-乙酰AMPA，其中所述足夠濃度允許在檢測期間改善N-乙酰AMPA的響應和線性或者其中所述足夠濃度包括約0.02M磷酸的最終濃度；(f)使用苯基-己基高效液相色譜法(HPLC)分析柱，色譜法分離N-乙酰AMPA與步驟(e)的其它組分；和(g)通過以正離子模式操作的串聯四極質譜儀分析步驟(f)的色譜法分離的樣品，以確定N-乙酰AMPA在所述測試樣品中的存在或含量。在具體實施方式
中，液-液提取法包括稀含水酸/甲醇溶液和/或稀酸和二氯甲烷提取。在進一步的實施方式中，測試樣品包括來自植物或者乳或蛋商品的固體基質樣品。
在非限制性實施方式中，確定N-乙酰AMPA在測試樣品中的存在或含量包括(a)提供懷疑包含N-乙酰AMPA的測試樣品；(b)將所述測試樣品與固相提取吸附劑在允許所述固相提取吸附劑結合N-乙酰AMPA的條件下混合；(c)通過液-液提取法，提取所述固相提取吸附劑和來自所述樣品的結合的N-乙酰AMPA；(d)從所述固相提取吸附劑洗脫所述N-乙酰AMPA；(e)通過液-液提取法從步驟(d)的包含N-乙酰AMPA的組合物提取包含N-乙酰AMPA的組合物；(f)將從步驟(e)洗脫的N-乙酰AMPA布置在陰離子交換柱上，并從那里洗脫N-乙酰AMPA，其中所述陰離子交換柱具有這樣的官能表面，其具有含季銨的間二乙烯基苯和N-乙烯基吡咯烷酮共聚物；(g)添加足夠濃度的磷酸至步驟(f)所述的洗脫的N-乙酰AMPA，其中所述足夠濃度允許在檢測期間改善N-乙酰AMPA的響應和線性或者其中所述足夠濃度包括約0.02M磷酸的最終濃度；(h)使用苯基-己基高效液相色譜法(HPLC)分析柱，色譜法分離N-乙酰AMPA與步驟(g)的組合物中的其它組分；和(i)通過以正離子模式操作的串聯四極質譜儀分析步驟(h)的色譜法分離的樣品，以確定N-乙酰AMPA在所述測試樣品中的存在或含量。在具體實施方式
中，液-液提取法包括稀酸和二氯甲烷提取。在進一步的實施方式，測試樣品包含肉組織商品。
在其它非限制性實施方式中，確定草甘膦、N-乙酰草甘膦、N-乙酰AMPA或AMPA的至少一種在測試樣品中的存在或含量的方法包括(a)提供懷疑包含草甘膦、N-乙酰草甘膦、N-乙酰AMPA或AMPA的至少一種的測試樣品；(b)添加足夠濃度的磷酸至(a)的測試樣品，其中所述足夠濃度允許在檢測期間改善N-乙酰草甘膦、AMPA、草甘膦或N-乙酰AMPA的響應和線性或者其中所述足夠濃度包括約0.02M磷酸的最終濃度；(c)通過水-有機物萃取從所述測試樣品提取包含AMPA、N-乙酰草甘膦、N-乙酰AMPA或草甘膦的至少一種的組合物；(d)使用高效液相色譜法(HPLC)柱，包括苯基-己基分析柱，色譜法分離步驟(c)的AMPA、N-乙酰草甘膦、N-乙酰AMPA或草甘膦的至少一種；和(e)通過以電噴射離子化作用模式操作的串聯四極質譜儀分析AMPA、草甘膦、N-乙酰AMPA或N-乙酰草甘膦的至少一種在所述測試樣品中的存在或含量。
在其它非限制實施方式，提供了從AMPA純化草甘膦、N-乙酰AMPA或N-乙酰草甘膦的方法。所述方法包括(a)提供懷疑包含草甘膦、N-乙酰AMPA、N-乙酰草甘膦或AMPA的至少一種的測試樣品；(b)從所述測試樣品提取包含N-乙酰草甘膦、草甘膦、N-乙酰AMPA或AMPA的組合物；(c)將步驟(b)的組合物布置在陰離子交換提取柱上并從那里洗脫N-乙酰草甘膦、N-乙酰AMPA和草甘膦的至少一種，從而從AMPA純化草甘膦、N-乙酰AMPA和N-乙酰草甘膦；或者，將步驟(b)的組合物布置在陽離子交換提取柱上并從那里洗脫AMPA，從而從AMPA純化草甘膦、N-乙酰AMPA和N-乙酰草甘膦。
實驗 實施例1 在一個實施方案中，開發出測定轉基因農作物和農作物部分(fraction)基質中草甘膦和相關代謝物或降解殘余物的分析法。草甘膦代謝物或分析物是N-乙酰草甘膦、氨甲基膦酸(AMPA)和N-乙酰AMPA。N-乙酰草甘膦是與包含草甘膦N-乙酰轉移酶(glyat)的轉基因農作物有關的代謝物。在每種檢驗的基質中方法目標定量限(LOQ)是0.050mg/kg(ppm)。在正離子模式檢測中，使用電霧化接口(ESI)操作的LC/MS/MS系統，在0.050mg/kg和0.50mg/kg下驗證所述方法。該分析法被開發來支持基因改造農作物的注冊所需的殘余物數據收集。
來源于表達GLYAT的植物的粗農產品和固體加工部分產品在酸性(0.1％甲酸或0.025N鹽酸)水/甲醇(96/4)溶液中提取3次。一部分提取物用二氯甲烷分配，而含水部分被回收并過濾。一部分含水部分通過C18SPE柱體進行過濾。一部分來自C18SPE的洗脫物被稀釋并施加于MAX SPE柱體。在幾次溶液漂洗后，在1％TFA的甲醇/水(9/1)溶液中，從MAX吸附劑洗脫分析物。將MAX洗脫物蒸發至干燥并且再溶解于0.02M磷酸水溶液、過濾并分析草甘膦、N-乙酰草甘膦和/或N-乙酰AMPA。來自C18SPE的單獨的一部分洗脫物在MCX SPE柱體上處理、稀釋、過濾并對于AMPA進行分析。
加工油商品用二氯甲烷和0.02M磷酸水溶液分配。離心所述溶液以分辨有機部分和含水部分，并收集含水部分。剩余的基質和二氯甲烷部分再次用0.02M磷酸水溶液分配，且含水部分被收集并與第一含水部分合并，用于所述的定量回收。稀釋、過濾所合并的含水提取物并對于草甘膦、N-乙酰草甘膦、N-乙酰AMPA和/或AMPA進行分析。
以正離子LC/MS/MS(液相色譜/質譜/質譜)模式操作，使用采用反相色譜的HPLC和具有電霧化源的三重四極質譜儀，分析最終的提取物。當需要內標來對基體效應進行響應歸一化時，就在LC/MS/MS分析之前，加入草甘膦(1，2-13C215N)和AMPA(13C15N)的穩定同位素標準物。
從0.050mg/kg(LOQ)和0.50mg/kg(10×LOQ)的各種加標玉米和大豆基質的樣品的回收支持了該方法的令人滿意的表現。表17A、B和C、18A和B、19、20和21總結了在樣品基質中各種分析物的平均回收率結果。
表17A.玉米基質
表17B.玉米基質
表17C.玉米基質
表18A.大豆基質
表18B.大豆基質
表19.油基質(僅N-乙酰AMPA)
表20.李子基質
表21.酸橙基質
材料 表22.設備

表23.
表24.試劑
參考分析標準物 草甘膦的參考分析標準物(DPX-B2856-011，96％純)和N-乙酰草甘膦、鈉鹽的參考分析標準物(IN-MCX20-000，67.4％純，為游離酸)從Sigma Aldrich獲得。AMPA的參考分析標準物(IN-YB726-001，99.53％純)獲自Alfa Aesar。N-乙酰AMPA的參考分析標準物在E.I.du Pont deNemours and Company，DuPont Agricultural Products，Wilmington，DE獲得。表征數據由DuPont Agricultural Products，E.I.du Pont de Nemoursand Company，Wilmington，Del歸檔。
內標 草甘膦1，2-13C215N和氨甲基膦酸13C15N(AMPA)穩定同位素標準物獲自GmbH，用作內標。結構和具體信息如下。

草甘膦1，2-13C215N
氨甲基膦酸13C15N 實施例2-分析方法的原理 使用探針勻化器，將草甘膦、N-乙酰草甘膦、AMPA和N-乙酰AMPA從植物組織和各種農作物的固體加工部分基質提取入稀含水酸(0.1％甲酸或0.025N鹽酸)/甲醇(96/4)中。用稀鹽酸代替甲酸來增加酸性，以更有效地從玉米面粉和玉米粗粉加工部分提取N-乙酰草甘膦。進行多次(3)提取來定量回收分析物和消除作為回收因素的基質含水量。額外的提取溶液體積對于稿稈、干草和殼是必需的，原因在于在這些基質中含水量較低。
純化固體基質樣品提取物中的草甘膦、N-乙酰草甘膦和N-乙酰AMPA 一部分的提取物用二氯甲烷分配，而含水部分被回收并過濾(0.2-1.0μm)，以除去微粒。在通過C18SPE柱體過濾后進行收集大約10ml的含水部分。一部分從C18SPE收集的洗脫物被稀釋并施加于MAXSPE柱體。在幾次溶液漂洗后，在1％TFA的甲醇/水(9/1)溶液中，從MAX吸附劑洗脫分析物。將MAX洗脫物蒸發至干燥并且再溶解于含水0.02M磷酸水溶液、過濾并分析草甘膦和N-乙酰草甘膦。對于大豆樣品的分析，對該步驟進行小的改進。對于大豆種子和粗粉，分配之后，可在蒸汽浴中將提取物樣品加熱大約15分鐘，以在微粒過濾之前沉淀提取物中的其它物質。
在固體基質樣品提取物中的AMPA的純化 從上面描述的C18SPE收集的第二部分洗脫物通過MCX SPE柱體處理、稀釋、過濾并對于AMPA進行分析。對于AMPA，需要單獨的分析物純化步驟，因為使用MAX SPE純化的回收率低。
分析油樣品中的草甘膦、N-乙酰草甘膦、AMPA和N-乙酰AMPA 用二氯甲烷稀釋一部分的樣品，并且分析物被液-液分配入0.02M磷酸水溶液。對于分析物的定量轉移，樣品被分配兩次。在每次分配中，離心可用于界定相分離。
在LC/MS/MS分析之前，過濾(0.2μm)全部最終提取物，以除去微粒，作為HPLC系統的預防性維護手段。磷酸在最終樣品溶液中的使用，顯示草甘膦的總響應和線性得到改善。需要在最終的提取溶液中使用草甘膦和AMPA穩定同位素作為內標以在大豆基質的分析中對于基體效應進行歸一化，并且被推薦作改善方法重現性的一般用途。穩定同位素內標就在LC/MS/MS分析之前被最初添加到最終的提取物，但是該步驟被修改成就在SPE純化之前添加，以對于SPE性能和基體效應進行歸一化。用作內標的草甘膦和AMPA的穩定同位素形式與草甘膦和AMPA的表現相同。通過使用苯基-己基分析柱的HPLC反相色譜，聯接正離子模式的電噴射離子化作用，連同MS/MS檢測一起，解析分析物。相同的色譜條件用于草甘膦、N-乙酰草甘膦、AMPA和N-乙酰AMPA分析。對于每種分析物，獲得兩個分子離子躍遷，除了AMPA(在正離子模式中僅可獲得1個分子離子躍遷)。對于每種分析物，使用單一分子離子躍遷進行定量分析。除AMPA之外，2種檢測的MS/MS碎片離子的相對豐度為各分析物提供了確認證據。
分析步驟 試劑溶液 提取溶液A96％的0.1％甲酸水溶液/4％的甲醇。
提取溶液B96％的0.025N鹽酸水溶液/4％的甲醇。
80％或95％甲醇水溶液 在80％甲醇/水溶液中的0.1M乙酸 在95％甲醇/5％水中的0.25％氫氧化銨 0.25％氫氧化銨水溶液每升體積，10ml氫氧化銨溶液(最低25％)被加入小體積的HPLC級凈化水，然后用HPLC級凈化水稀釋至最終體積。這是MAX SPE的調節溶液(12ml/樣品，水稀釋法)。注1ml 25％氫氧化銨稀釋至100ml≈0.25％NH4OH。
洗脫溶液，在90％甲醇/10％水中的1％TFA。
1.0M磷酸溶液每10ml體積，0.67ml濃磷酸(最小85％)被添加到在15-ml聚丙烯離心管中的HPLC級凈化水，并用HPLC級凈化水采用管上梯度稀釋至最終體積。
樣品和標準物終溶液，0.02M磷酸水溶液 0.2M甲酸水溶液，含水流動相 儲備標準物的制備和穩定性 使用純度大于95％的標準物。在分析天平上稱最少大約10mg的標準物，該分析天平提供精確到三位有效數字的重量，或者標準物的量被增加至滿足該條件。
因為以草甘膦游離酸當量確定殘留容限，所以以草甘膦游離酸當量制備各種分析物的儲備標準物溶液，以便能夠母體游離酸當量確定加標和回收率。需要時，通過添加適當量的標準物至100-ml容量瓶并用水稀釋到最終體積(水是指HPLC級水或等效水)，制備草甘膦、N-乙酰草甘膦、AMPA或N-乙酰AMPA的各個游離酸當量儲備標準物溶液。下列計算和表25提供了100ml以各種分析物的草甘膦游離酸當量計100μg/ml(ppm)進行制備的指導。

表25 對每種分析物稱重的量為至少10mg，因此各分析物儲備溶液濃度以母體釋放酸當量計可超過100μg/ml。儲備標準物溶液可以以更高的濃度制備(不超過1mg/ml)。觀察到大約10mg的最低標準物重量和至少10ml的最終標準物體積。這些溶液在等于或低于4℃下儲存并且穩定至少9個月。
內標的制備和穩定性 草甘膦1，2-13C215N和氨甲基膦酸13C 15N(AMPA)穩定同位素標準物被提供于包含1.1ml標稱濃度為100mg/L(μg/ml)的水溶液的琥珀色安瓿瓶中。各標準溶液被轉入單獨的琥珀色瓶，并在20℃或以下在黑暗中儲存。通過按照下文概述的方案分析大約500ng/ml的溶液，驗證各標準物的同位素純度。
通過以在100ml的0.02M磷酸水溶液或HPLC級凈化水中0.1ml的比率稀釋100μg/ml儲備溶液，制備含有草甘膦和AMPA同位素的中間100ng/ml內標溶液。內標以在最終溶液體積中50μL/ml或5ng/ml的比率被包括在最終提取物和校準用標準溶液中。當250μL的內標被施加于5ml的最終提取物時，每100ml的100ng/ml標準物溶液可被用于最高達到400個樣品。
使用玻璃移液管，將100μg/ml標準物(草甘膦1，2-13C215N、100μg/ml×1.1ml和氨甲基膦酸13C 15N(AMPA)、100μg/ml×1.1ml)各自轉移入螺旋蓋琥珀色自動進樣器小瓶。0.025ml試樣的100μg/ml標準物被轉入15ml聚丙烯離心管并用5ml 0.02M H3PO4稀釋，以制備單獨的500ng/ml溶液。0.10ml試樣的每種100μg/ml標準物被合并入一個100ml容量瓶中并用0.02M H3PO4稀釋至容量，以制備100ng/ml的混合溶液。該溶液被分入2×50ml聚丙烯離心管。全部標準物被儲存在致冷器中。該500ng/ml溶液的分析被示于圖25。
中間和加標標準物的制備和穩定性 通過各儲備溶液的稀釋，以草甘膦游離酸當量濃度制備加標溶液。如果要求草甘膦、N-乙酰草甘膦、AMPA或N-乙酰AMPA加標在大于0.5mg/kg(10×LOQ)的水平，則各儲備標準物溶液應該被用于加標樣品。對于10×LOQ和LOQ的樣品加標，分別制備10.0μg/ml和1.0μg/ml加標溶液。對于其它加標水平，當需要時，可以配制可供選擇的濃度。
10.0μg/ml加標溶液每種分析物的儲備溶液被適當地擴大入共同的容量瓶中、用HPLC級凈化水稀釋至容量、蓋上蓋并充分混合。例如，對于每種要求的分析物，1.00ml的100μg/ml儲備溶液每種分析物的儲備溶液被合并入10ml容量瓶中并用水稀釋至最終容積、蓋上蓋并充分混合。
儲備溶液濃度將改變并且調整用于制備加標溶液的每種分析物儲備溶液的所需體積，以校正使用下列計算確定的最終濃度。

例如，為從分別以草甘膦游離酸當量濃度計算115μg/ml、186μg/ml和206μg/ml的草甘膦、N-乙酰草甘膦和AMPA儲備溶液制備50ml的10μg/ml加標溶液，下列儲備溶液體積被添加至50ml容量瓶。
草甘膦＝10μg/ml×50ml/115μg/ml＝4.35ml儲備溶液 N-乙酰草甘膦＝10μg/ml×50ml/186μg/ml＝2.69ml儲備溶液 AMPA＝10μg/ml×50ml/206μg/ml＝2.42ml儲備溶液 10ml加標溶液用HPLC級凈化水適當地稀釋每種分析物的10.0μg/ml加標溶液(優選的)或儲備溶液入共同的容量瓶中。例如，1.0ml的10.0μg/ml加標溶液被轉入10ml容量瓶中并用水稀釋至容積、蓋上蓋并充分混合。在等于或低于4℃儲存并且每月更換。
色譜標準物的制備和穩定性 通過各儲備標準物的稀釋，以草甘膦游離酸當量濃度制備校準標準物。草甘膦和AMPA穩定同位素可以作為內標被用于校準標準物和最終提取物溶液，以對于基體效應進行回收率歸一化，用于樣品分析。推薦最少5種以上在大約50％的LOQ當量最終濃度至≥120％的最高期望最終樣品濃度的范圍內的校準標準物用于定量。AMPA分析被單獨進行，并具有2.0ng/ml的LOQ當量終濃度。草甘膦、N-乙酰草甘膦和N-乙酰AMPA的LOQ當量終濃度是1.0ng/ml。
例如，通過將250μL試樣稀釋至最終體積25.0ml的標準物制備溶液(0.02M磷酸水溶液)，從1.0和10.0μg/ml加標溶液，制備10.0ng/ml和100ng/ml的中間標準物溶液。添加在下文中表26所示的內標，通過這些中間標準物的系列稀釋，制備校準標準物。
表26 濃度以草甘膦游離酸當量計。
將校準標準物保持在4℃或以下，并且每兩周更換一次。如果得到穩定性試驗數據的支持，校準標準物使用可以被延長。
樣品的來源(和表征) 從包含草甘膦乙酰轉移酶基因(glyat)的轉基因雜合玉米收集玉米飼料、顆粒和稿稈基質測試樣品。加工玉米面粉、淀粉、硬渣、精煉油(濕磨)、粗粉(干磨)和精煉油(干磨)樣品，且也進行收集。大豆飼料、種子和干草來自于包含glyat的大豆品系并從溫室植物收集。加工大豆外皮，并且還制備來自含有glyat的大豆品系的大豆粉。在當地超市購買李子和酸橙。
樣品的儲存和制備 在樣品預加工、提取和分析之前，全部樣品都在-20±5℃下儲存。為分析作準備，對于飼料和稿稈，采用

食品處理器(型號#84145)，而對于谷粒，采用Quaker研磨機(型號4E)，從冷凍保藏和采用干冰的地面存儲移出RAC樣品。在研磨加工期間，充分混合樣品，確保均一性。使大多數干冰升華，然后樣品返回冷凍器儲存，直到提取和分析。當收到時，加工部分樣品是均勻的，并且不需要進一步預加工。
樣品加標方法 在提取容器(250ml瓶或50ml離心管)中，根據需要，以草甘膦游離酸當量濃度對未處理的對照樣品進行加標。包含測試分析物混合物的10.0和1.0μg/ml加標標準物被用來加標測試樣品。表27提供適合用于目前公開的方法的示例性加標。
表27
濃度以草甘膦游離酸當量計。
*在應用之前，加標試樣在5ml水稀釋，以獲得在極干基質上的更好的分析物分布。
對于每種固體基質樣品，稱出適當量到清潔的250ml PPCO離心瓶中。對于每種油樣品，稱出2.0±0.02g的樣品到清潔的50ml玻璃或聚丙烯離心管中。對于干燥商品(例如，稿稈、干草外皮)，加標試樣應該在加標之前在小瓶或管中稀釋在5ml HPLC級凈化水中，以便分析物更好地分散在基質中。在加標之后，使固體基質樣品在通風櫥中靜置大約15分鐘，以允許加標溶液擴散。
實施例3-分析物提取方法 提供了固體基質的分析物提取方法，固體基質包括玉米RAC(飼料、谷粒、稿稈)、玉米加工部分(面粉、硬渣、粗粉、淀粉)、大豆RAC(飼料、種子、外皮)和大豆加工部分(粗粉、外皮)。樣品量、提取溶液和提取溶液體積隨商品改變。稿稈、干草和外皮要求2×樣品量(10.0g)和提取物體積(200ml)來補償干燥商品。在本文別處提供玉米和大豆油加工部分方法。
固體基質樣品 第一次提取 1.0 將正確量的樣品稱入適當的容器，如上所示。
2.0 如上所示，對樣品進行加標，并使固體基質在通風廚中風干15分鐘。
3.1 對于飼料、谷粒、種子、硬渣、淀粉或大豆粉樣品，將50ml提取溶液A(96％0.1％甲酸水溶液/4％甲醇)添加至樣品。該步驟被應用于水性(例如李子)和酸性(例如酸橙)農作物類型。
對于稿稈、干草或外外皮，將100ml提取溶液A(96％0.1％甲酸水溶液/4％甲醇)添加至樣品。對于干為基質樣品，用于稀釋加標溶液5ml的管或小瓶用該提取溶液漂洗，以在該步驟期間將分析物定量轉移至樣品。
3.2 對于玉米面粉或玉米粗粉，將50ml提取溶液B(96％0.025N鹽酸水溶液/4％甲醇)添加至樣品。
4.0 樣品被蓋上蓋并使之靜置15分鐘，如此提取溶液可滲透入基質。
5.0 樣品被打開蓋，并在40-50％的總電動機轉速或在有效勻化樣品而無過熱或起泡的速度下，使用Tissumizer勻化2分鐘。
6.0 樣品被蓋上蓋并以13,000rpm離心15分鐘，以實現上清液的充分澄清。
7.0 將上清液傾析入干凈的刻度量筒(根據最終容量的需要為100ml或250ml)。可通過過濾紙傾析上清液，以凈化提取物溶液。當傾析時，用湯匙或抹刀按壓外皮，以回收額外的提取溶液(30-40ml可能保持在顆粒中)。
第二次提取 8.1 對于飼料、谷粒、種子、硬渣、淀粉、粗粉或面粉樣品，將25ml提取溶液A(96％0.1％甲酸水溶液/4％甲醇)添加至樣品。應用該步驟于水性(例如李子)和酸性(例如酸橙)農作物類型。注粗粉和面粉基質的第二次和第三次提取使用提取溶液A。
8.2 對于稿稈、干草或外皮樣品，將50ml提取溶液A(96％0.1％甲酸水溶液/4％甲醇)添加至樣品。
9.0 在40-50％的總電動機轉速或在有效勻化樣品而無過熱或起泡的速度下，使用

勻化樣品2分鐘。
10.0 樣品被蓋上蓋并以13,000rpm離心15分鐘，以實現上清液的充分澄清。通過過濾紙傾析上清液，以凈化提取物溶液。
11.0 傾析上清液并合并成至各自的刻度量筒。
第三次提取 12.0 重復步驟8.1至11.0 13.1 對于飼料、谷粒、種子、硬渣、淀粉、粗粉或面粉樣品，用HPLC級水將最終提取物體積調節至100ml或確定超過100ml的精確體積。應用該步驟于水性(例如李子)和酸性(例如酸橙)農作物類型。
13.2 對于稿稈、谷粒或外皮樣品，用HPLC級水將最終提取物體積調節至200ml或確定超過200ml的精確體積。
14.0 將上清液轉入干凈的聚丙烯瓶。將樣品從刻度量筒倒回瓶中，以混合溶液。將裝滿的瓶蓋上蓋。粗提取物可在等于或低于4℃儲存。
實施例4-分析物純化方法 對于固體基質樣品提取物的分析，二氯甲烷分配和C18SPE過濾方法(如下所概述)被最初用于全部分析物的純化。處理一部分C18SPE洗脫物，用于通過強陽離子交換MCX SPE(如下所概述)進行AMPA的分析。處理單獨的一部分C18SPE洗脫物，用于通過強陰離子交換MCX SPE(如下所概述)進行草甘膦和N-乙酰草甘膦和N-乙酰AMPA的分析。由于分析物在所選擇的SPE固定相上的特征和行為，需要單獨的方法。對于油加工部分的分析，單一方法被用于所有分析物的提取和純化(見下文)。
A.固體基質樣品中草甘膦、N-乙酰草甘膦、以及AMPA和N-乙酰AMPA的初始純化方法 二氯甲烷分配 1.0 將30ml樣品提取物轉入50-ml聚丙烯離心管，并將10ml的二氯甲烷加入樣品部分，將樣品部分蓋上蓋，并搖動或渦旋至少30秒(使用管上梯度，用于容積計量)。對于大豆種子或粗粉，使用20ml的二氯甲烷。樣品在足夠的rpm(例如3000rpm)離心10分鐘，以形成明顯的層(上文的含水蛋白質和二氯甲烷)。較少的提取物試樣可用于調節各分析物純化方法(例如，當不需要AMPA分析或為分開2種純化方法時，可使用15ml的提取物和5ml的二氯甲烷)。
2.1 對于除了大豆種子和粗粉之外的所有固體基質，在不干擾沉淀或二氯甲烷層的情況下盡可能多的含水部分被回收，并通過1.0μm或以下的親水性過濾器過濾到干凈的50ml聚丙烯離心管中。(倒空最初的離心管并節省來收集在C18SPE過濾步驟4.0中的廢棄提取物)。至少15ml的含水部分被回收并過濾，以采用14ml進行接下來的C18SPE純化。如果過濾困難，處理較小體積的提取物可能是有幫助的。過濾對于離子交換SPE性能是一個重要的前提。
2.2 對于大豆種子和粗粉樣品，在不干擾沉淀或二氯甲烷層的情況下盡可能多地回收含水部分，并將其添加至干凈的玻璃管。(倒空最初的離心管并節省來收集在C18SPE過濾步驟4.0中的廢棄提取物)。將含水提取物樣品置于蒸汽浴至少15分鐘，以進一步沉淀基質，然后經1.0-μm或以下的親水性過濾器(尼龍或玻璃微纖維)過濾入干凈的50ml聚丙烯離心管中。
C18SPE過濾 1.0 廢料收集管被安裝在真空歧管中，以收集初始的樣品載荷容量。注廢料收集管用來防止步驟3.0期間的交叉污染。
2.0 C18SPE(6cc/500mg，Varian#_12102052)柱體用1ml甲醇、繼之以2CV(CV＝6ml)的提取溶液A(96％的0.1％HCOOH水溶液/4％的甲醇)進行調節。對于慢滴注速率(1-2ml/min)，在需要時施加真空或正壓。注意可用0.2M甲酸水溶液代替提取溶液A，用于C18SPE調節。
3.0 當最后的的調節溶液進入吸附劑時，來自二氯甲烷分配純化步驟2.0的4.0ml含水樣品提取物被添加在SPE柱上。
4.0 在滴注停止之后，移動廢料收集管并安裝干凈的15ml離心管。加入來自步驟2.0的10.0ml含水樣品提取物、洗脫并收集洗脫物。提取物溶液可在4℃或以下儲存。
B.固體基質樣品的AMPA純化方法 兩種方法被用于AMPA的MCX SPE純化。MCX SPE過濾純化方法最初被開發用于玉米基質，以從提取物過濾基質而不保留AMPA。后來，MCX SPE純化方法被開發來降低大豆基質的基質抑制。MCXSPE純化方法適合用于全部固體基質樣品。純化方法還被用于水性(例如李子)和酸性(例如酸橙)作物類型。
AMPA MCXSPE過濾純化 1.0 Oasis MCX SPE柱體用1CV(CV＝6ml)甲醇和1CV提取溶液A(96％的0.1％HCOOH水溶液/4％的甲醇)進行依次調節。輕微真空可被用于控制慢滴注(1-2ml/min)下的洗脫。輕微真空被施加或持續，直到滴注停止。
2.0 15ml離心管被安裝在SPE柱體之下在真空歧管之中，而0.25ml的100ng/ml內標被施加于各SPF柱體中的吸附劑床頂端。
3.0 4.0ml的C18過濾提取物被施加于MCX SPE柱體。在滴注停止之后，4.0ml的甲醇被施加于MCX SPE柱體。如果需要，可施加輕微真空。正壓或真空可被施加，以回收在SPE柱體上殘余的甲醇。
4.0 從 真空歧管回收樣品，并使其在N-Evap上在45-50℃下蒸發至4ml以下。
5.0 然后，0.1ml1M磷酸水溶液用水稀釋至5.0ml的最終體積。蓋上蓋并渦旋最終提取物。
6.0 用于LC/MS/MS分析的一部分最終提取物被過濾(0.2μm尼龍)。最終溶液可在4℃或以下儲存。
AMPA MCXSPE過濾 1.0 用甲醇在含有0.25ml的100ng/ml內標的50ml離心管中，將4ml的C18過濾提取物稀釋至20ml，并將其施加于MCX SPE柱體。
如果需要，可施加輕微真空。注意在一些基質的稀的甲醇/提取物水溶液中可觀察到沉淀。
2.0 Oasis MCX SPE柱體用1CV(CV＝6ml)的甲醇和1CV的提取溶液A(96％的0.1％HCOOH水溶液/4％甲醇)∶甲醇(1∶4，v∶v)溶液依次調節。輕微真空可被施加來控制在慢滴注(1-2ml/min)下洗脫。輕微真空被施加或持續，直到滴注停止。
3.0 稀提取樣品(步驟1.0)被施加于MCX SPE柱體。如果需要，可施加輕微真空。
4.0 2ml甲醇被添加至樣品管、混合并添加到SPE柱體，用于定量轉移和吸附劑漂洗。施加真空或正壓，直到滴注停止。
5.0 15ml離心管被安裝在SPE柱體之下在真空歧管之中。
6.0 4.0ml的HPLC級水被施加于MCX SPE柱體。在滴注停止之后，4.0ml的甲醇被施加于MCX SPE柱體。如果需要，可施加輕微真空。正壓或真空可被施加，以回收在SPE柱體上殘余的甲醇。
7.0 從真空歧管回收樣品，并使樣品在N-Evap上在45-50℃下蒸發至4ml以下。
8.0 0.1ml 1M磷酸水溶液+0.25ml的100ng/ml內標被添加至樣品，然后用水稀釋至5.0ml的最終體積。蓋上蓋并渦旋最終提取物。
9.0 一部分最終提取物被過濾(0.2μm尼龍)，用于LC/MS/MS分析。最終溶液可在4℃或以下儲存。
C.在固體基質樣品中草甘膦和N-乙酰草甘膦和N-乙酰AMPA分析物純化方法 兩種方法被應用于MAX SPE提取物純化，進行草甘膦和N-乙酰草甘膦和N-乙酰AMPA分析。在提取物(調節至基本pH)在甲醇中稀釋這一步驟之后進行MAX SPE純化通常被用于玉米基質和大豆飼料和干草基質。MAX SPE純化與甲醇稀釋一起可用于酸性(例如酸橙)作物類型。在提取物在水中稀釋這一步驟之后進行MAX SPE純化被用于大豆種子、粗粉和外殼基質的分析。MAX SPE純化與水稀釋步驟一起被用于水性(例如李子)作物類型。
MAX SPE純化(提取物在甲醇中稀釋步驟) 1.0a 除了酸性農作物，2.0ml的C18純化提取物被轉移(來自步驟4.0，SPE過濾)至包含80μL氫氧化銨溶液(最低25％)和0.25ml 100ng/ml內標的50ml刻度離心管，然后用甲醇稀釋至大約20ml。
1.0b 對于酸性農作物，2.0ml的C18純化提取物(來自步驟4.0，SPE過濾)被轉移至包含0.1ml三乙胺(TEA)和0.25ml 100ng/ml內標的50ml刻度離心管，然后用甲醇稀釋到大約20ml。注意施加于MAX SPE柱體的提取物體積可在1.0至4.0ml的范圍內改變。添加的堿(氫氧化銨或TEA)的量應該適當調節，而100ng/ml內標的量應該對于步驟8.0中的最終提取物體積的任何變化進行調節(0.05ml內標/ml最終提取物體積)，但是用甲醇稀釋至20ml，漂洗體積和8ml洗脫不應該變化。
2.0a 除了酸性農作物，MAX SPE(6cc/500mg)柱體用1CV(CV＝6ml)的甲醇、繼之以2CV 0.25％氫氧化銨在95％甲醇/水中的溶液調節。需要時施加真空，以控制流動至2-5ml/min。
2.0b 除了酸性農作物，MAX SPE(6cc/500mg)柱體用1CV(CV＝6ml)的甲醇、繼之以2CV 0.1％TEA在80％甲醇/水的溶液調節。需要時施加真空，以控制流動至2-5ml/min。
3.0 當最后的調節溶液進入吸附劑，裝載堿調節的樣品提取物溶液(步驟1.0)。對于顆粒樣品，可能需要施加輕微真空，但是保持滴注速率緩慢。
4.0 在最后的樣品溶液進入吸附劑之后，15ml的80％甲醇/水、10ml在80％甲醇/水中的0.1M乙酸和10ml的95％甲醇水被順序添加，以漂洗SPE柱體。注15ml的80％甲醇/水和10ml的0.1M乙酸被順序添加并從各自倒空的樣品提取物管分配，進行樣品提取物到SPE柱體的定量轉移。最終10ml的95％甲醇/水漂洗液以2×5ml等分部分直接施加于SPE柱體。
5.0 在滴注停止之后，真空被略微增加，以從SPE吸附劑除去過量的溶液，并且收集小瓶或管被安裝在真空歧管中。注50ml玻璃離心管(重復使用)或20ml玻璃閃爍瓶(在使用之后丟棄)用于樣品收集。為了最快蒸發，使用具有平面、圓的或稍微傾斜的底部的收集容器。
6.0 分析物以2×4ml等分部分的洗脫溶液(1％TFA，在甲醇/水(90/10)中)洗脫。通過重力注入進行洗脫。在添加第二部分之前，第一部分通過SPE柱體之后等待至少5分鐘。正壓或真空可被施加，以回收在SPE柱體上殘余的甲醇。
7.0 從SPE槽移出樣品，并使其在N-Evap上在45-50℃下蒸發至完全干燥。注允許額外的15分鐘干燥，以確保TFA完全蒸發。
8.0 5.0ml的0.02M磷酸水溶液被添加至樣品。樣品被蓋上蓋、渦旋混合、超聲處理至少5min并渦旋。注如果使用其它體積的C18提取物(步驟1.0)，則最終的提取物體積和組成應該被調整，如此分析物濃度是一致的(例如，如果通過該純化方法處理1.0ml來自C18SPE的提取物，則在步驟1.0中，最終的提取物樣品應該以2.5ml重構，其中添加0.125ml的100ng/ml內標)。
9.0 一部分最終提取物被過濾(0.2μm尼龍)入自動進樣器小瓶，用于LC/MS/MS分析。
MAX SPE純化(提取物水中稀釋步驟) 1.0 2.0ml的C18純化提取物被轉入包含0.25ml的100ng/ml內標的50ml刻度離心管并用HPLC級水稀釋至大約20ml。注意施加于MAX SPE柱體的提取物體積可在1.0至4.0ml的范圍內改變。100ng/ml內標的量應該對于步驟8.0中的最終提取物體積的任何變化進行調節(0.05ml內標/ml最終提取物體積)，但是用水稀釋至20ml，漂洗體積和8ml洗脫不應該變化。
2.0 MAX SPE (6cc/500mg)柱體用1CV(CV＝6ml)的甲醇、繼之以2CV 0.25％氫氧化銨在HPLC級水中的溶液來調節。需要時施加真空，以控制流動至2-5ml/min。
3.0 當最后的調節溶液進入吸附劑，裝載樣品提取物溶液。對于顆粒樣品，可能需要施加輕微真空，但是保持滴注速率緩慢。
4.0 在最后的樣品溶液進入吸附劑之后，15ml的80％甲醇/水、10ml在80％甲醇/水中的0.1M乙酸和10ml的95％甲醇水被添加，以漂洗SPE 柱體。注15ml的80％甲醇/水和10ml的0.1M乙酸應該順序添加到各自倒空的樣品提取物管并從那里分配，進行樣品提取物到SPE柱體的定量轉移。最終10ml的95％甲醇/水漂洗液以2×5ml等分部分直接施加于SPE柱體。
5.0 在滴注停止之后，真空被略微增加，以從SPE吸附劑除去過量的溶液，然后且收集小瓶或管被安裝在真空歧管中。注50ml玻璃離心管(重復使用)或20ml玻璃閃爍瓶(在使用之后丟棄)用于樣品收集。為了最快蒸發，使用具有平面、圓的或稍微傾斜的底部的收集容器。
6.0 分析物以2×4ml等分部分的洗脫溶液(1％TFA，在甲醇/水(90/10)中)洗脫。洗脫通過重力給料。在第一部分通過SPE柱體之后，在添加第二部分之前，過去至少5分鐘。正壓或真空可被施加，以回收在SPE柱體上殘余的甲醇。
7.0 從SPE槽移出樣品，并使其在N-Evap上在45-50℃下蒸發至完全干燥。注允許額外的15分鐘干燥，以確保TFA完全蒸發。
8.0 5ml的0.02M磷酸水溶液被添加至樣品。樣品被蓋上蓋、渦旋混合、超聲處理至少5min并渦旋。注如果使用其它體積的C18提取物(步驟1.0)，則最終的提取物體積和組成應該被調整，如此分析物濃度是一致的(例如，如果通過該純化方法處理1.0ml來自C18SPE的提取物，則最終的提取物樣品應該以2.5ml重構，其中添加1.25ml的100ng/ml內標)。
9.0 一部分最終提取物溶液被過濾(0.2μm尼龍)入自動進樣器小瓶，用于LC/MS/MS分析。
D.在油基質樣品中草甘膦、N-乙酰草甘膦、以及AMPA和N-乙酰AMPA提取和純化方法 1.0 對于每一樣品，將2.0±0.02g的樣品稱入干凈的50ml玻璃或聚丙烯離心管。
2.0 對于加標樣品，樣品被如上所示進行適當加標。
3.0 15.0ml的0.02M磷酸水溶液被添加至樣品。
4.0 15.0ml的二氯甲烷被添加至樣品，然后該樣品被蓋上蓋、渦旋混合至少30秒。
5.0 樣品在3000rpm下離心大約10分鐘。
6.0 含水部分被轉入干凈的50ml量筒。盡可能多的該部分被回收而不干擾有機層。) 7.0 另外15.0ml的0.02m磷酸水溶液被添加至樣品，然后該樣品被蓋上蓋、渦旋混合至少30秒。
8.0 樣品在3000rpm下離心大約10分鐘。
9.0 含水部分在各自的50ml量筒中與第一分配合并。(盡可能多的該部分被回收而不干擾有機層。) 10.0 用0.02M磷酸水溶液將含水樣品稀釋至40ml最終體積。
11.0 最終樣品提取物被轉入干凈的瓶子。(將樣品在量筒和瓶子之間來回倒，以確保均一性。) 12.0 如果使用穩定同位素草甘膦和AMPA內標，最終樣品通過合并4ml提取物+0.25ml的100ng/mlIS+0.75ml的0.02M磷酸水溶液而制備，并且在LC/MS/MS分析之前過濾(0.2μm)樣品。如果不使用穩定同位素內標，則用1ml的0.02M磷酸水溶液稀釋4ml的該提取物并在LC/MS/MS分析之前過濾(0.2μm)。
實施例5-分析物的檢測 Agilent HP 1100HPLC和Waters Quattro Premier三重四極質譜儀被用于LC/MS/MS分析。典型的設備部件和操作條件如下 Agilent HP1100 G1322A真空脫氣器，G1311A四聯泵，G1367A冷凍自動 HPLC 進樣器，G1330A冷凍器，G1316A柱室 注射體積25μL(可以改變以校正MS靈敏度) 保護柱Waters Nova-Pak C18 (任選，優選)(3.9mm i.d.×20mm，4μm直徑顆粒) HPLC柱Phenomenex Luna Phenyl-Hexyl(15.0cm×4.6mm i.d.，3μm直徑顆粒) 柱溫40℃ 流動相A＝0.2M甲酸水溶液 B＝甲醇 Waters QuattroESI接口，MassLynx版本4SP4軟件 Premier 接口電霧化(ESI) 極性正離子 模式MRM 表28 HPLC條件
示于表28的大約的分析物保留時間(通過保留時間排序)如下 AMPA＝4.6min 草甘膦＝5.3min N-乙酰AMPA＝7.1min N-乙酰草甘膦＝7.4min 注根據HPLC柱和甲酸流動相的條件，分析物保留時間可能變化。預期保留時間隨柱退化而縮短。流動相中較低的甲酸濃度延長了保留時間并使分析物的峰形變寬。
表29 質譜條件
在其它儀器上的質量賦值可能變化±0.5個原子質量單位(amu)。可調節停留時間來優化響應。
校準方法 使用標準質譜儀調諧并校準技術。如果需要建立對質量校準的信心(在數字控制之下的現代質譜儀通常不需要頻繁的質量校準，尤其對于定量模式，使用供應商推薦的校準溶液。可通過注入一種或多種測試分析物來進行MS系統的優化調諧。該方法采用如上所述制備的內部和外部校準標準物。
使用

函數AVERAGE、STDEV(標準偏差)和RSD(相對標準偏差StDev/平均值)，基于外部校準標準物的平均響應因子(分析物峰面積響應/分析物濃度)進行儀器校準。對于平均響應因子校準，應該觀察到小于或等于20％的％RSD。監測使用

函數SLOPE、INTERCEPT和RSQ(r-平方；使用

函數RSQ確定的Pearson積矩相關系數的平方)獲得的外部校準標準物的線性回歸響應，以建立校準曲線線性。有效定量的接受準則是(1)對于校準曲線，RSQ值＞0.99；和(2)對于各校準標準物響應因子，％RSD≤20％。可以使用包括有或者沒有進行加權(例如1/X)的線性回歸在內的可選方法，如果它們對校準標準物響應提供一當量以上一致性擬合的樣品響應的話。
草甘膦和N-乙酰草甘膦和N-乙酰AMPA的標稱LC/MS/MS校準范圍是0.5-20.0ng/ml，而AMPA的標稱LC/MS/MS校準范圍是1.0-50.0ng/ml。草甘膦和N-乙酰草甘膦分析的LOQ當量最終提取物濃度是1.0ng/ml。AMPA分析的LOQ當量最終提取物濃度是2.0ng/ml。通常，對于定量LC/MS/MS分析，分析5個校準溶液(需要最少4個校準溶液)。
凈回收率可以僅對于加標樣品進行計算(對于現場樣品則不可接受)。凈回收率可以僅當對照樣品中的殘余可積分并＜LOQ的50％時進行計算并報告。當對照殘余＞LOQ的50％時，使用該對照以LOQ制備的回收樣品無效。當對照殘余＜LOQ的50％時，在加標樣品中得到的校正ppm(mg/kg)通過從在加標樣品中得到的面積數減去在對照中得到的面積數加以計算。如果計算了凈回收率，則那些結果必須被唯一地識別或存在于校正ppm(mg/kg)的單獨的電子數據表列標題。
樣品分析 常規進行至少2個校準標準物的初步運轉，以證明適當的儀器響應并確保LC/MS/MS系統得到平衡。如果分析多組，則在所述組的最后一次和第一次注射之間進行溶劑空白注射，以最小化組間攜帶的風險。校準標準物分析在第一個樣品分析之前并且在最后一次樣品分析之后進行，如此樣品分析處于外標校準之間。通常，注射順序從最低到最高預期分析物濃度加以組織。校準標準物試驗與測試樣品摻雜進行，并且在各分析組中可在每1-3個樣品前后進行分析。如果儲存的話，提取物和校準標準物被冷藏。通常，在分析組中，對于可接受的定量結果，需要加標樣品回收率(70-120％)。
計算 方法 在農作物基質中，草甘膦、N-乙酰草甘膦、AMPA和N-乙酰AMPA殘余被測量為以mg/kg(ppm)計的草甘膦游離酸當量。定量基于平均響應因子，平均響應因子根據與樣品提取物同時分析的多個校準標準物進行確定。使用以兩位有效數字報告的不舍入的值，進行全部計算。加標樣品回收率以四舍五入的整數百分比(％)報告。
確定通過平均響應因子分析在殘余樣品中發現的mg/kg的計算如下 無內標校準
有內標校準
其中， PA 是分析物峰面積， FV 是最終提取物體積(ml)， XV 是總提取物體積(ml)， ARF 是平均響應因子
IS 是樣品提取物中內標的峰面積， ARFIS 是采用內標的平均響應因子
AF 是等分試樣因子(XV稀釋至FV的ml)， SW 是提取的樣品部分的樣品重量(5.0g)，和 UC 單位換算 μg/1000ng×mg/1000μg×1000g/kg＝mg·g/1000ng·kg 來自加標樣品的回收率百分比(以四舍五入整數報告)如下計算
無內標的實例 在玉米顆粒樣品中的N-乙酰草甘膦顆粒10X062905-1 (參考表2、圖8、表30-40)
注從加標樣品面積減去對照樣品面積39
在玉米顆粒樣品中的AMPA顆粒-LOQ052905-3 (參考表2、圖8、表30-40)

采用內標的實例 在大豆種子樣品中的草甘膦大豆種子AX 10X1 1004 (參考表10、
圖16、表30-40)

在大豆種子樣品中的AMPA大豆種子CX L1 1004 (參考表10、
圖16、表30-40)

表30.玉米粒-草甘膦和N-乙酰草甘膦
表31.玉米粒-AMPA
表32.玉米油-草甘膦、N-乙酰草甘膦和AMPA
表33.大豆種子-草甘膦和N-乙酰草甘膦
表34.大豆種子-AMPA
表35.大豆粗粉-草甘膦和N-乙酰草甘膦
表36.大豆粗粉--AMPA
表37.李子-草甘膦、N-乙酰草甘膦和N-乙酰AMPA
注釋

在70-110％之外的％Rec，下劃線從樣品中檢測的面積減去對照中檢測的面積.類型(B空白，IS內標，C對照樣品，F加標對照樣品，T處理過的樣品，FS加標標準物).SW樣品重量，XV提取物體積，AF等分試樣因子，FV最終體積，RFIS對IS進行歸一化的響應因子(分析物面積/IS面積/分析物ppb)，RF響應因子(分析物面積/分析物ppb).發現的mg/kg＝(面積/平均RF)×(FV×XV)/(AF×SW×1000)；發現的mg/kg(IS)＝(面積/IS面積/平均RFIS)×(FV×XV)/(AF×SW×1000). 表38.李子-AMPA
注釋

在70-110％之外的％Rec，下劃線從樣品中檢測的面積減去對照中檢測的面積.類型(B空白，S標準物，IS內標，C對照樣品，F加標對照樣品，T處理過的樣品，FS加標標準物).SW樣品重量，XV提取物體積，AF等分試樣因子，FV最終體積，RFIS對IS進行歸一化的響應因子(分析物面積/IS面積/分析物ppb)，RF響應因子(分析物面積/分析物ppb).發現的mg/kg＝(面積/平均RF)×(FV×XV)/(AF×SW×1000)；發現的mg/kg(IS)＝(面積/IS面積/平均RFIS)×(FV×XV)/(AF×SW×1000). 表39.酸橙-草甘膦、N-乙酰草甘膦、N-乙酰AMPA
注釋

在70-110％之外的％Rec，下劃線從樣品中檢測的面積減去對照中檢測的面積.類型(B空白，S標準物，IS內標，C對照樣品，F加標對照樣品，T處理過的樣品，FS加標標準物).SW樣品重量，XV提取物體積，AF等分試樣因子，FV最終體積，RFIS對IS進行歸一化的響應因子(分析物面積/IS面積/分析物ppb)，RF響應因子(分析物面積/分析物ppb).發現的mg/kg＝(面積/平均RF)×(FV×XV)/(AF×SW×1000)；發現的mg/kg(IS)＝(面積/IS面積/平均RFIS)×(FV×XV)/(AF×SW×1000)。
表40.酸橙--AMPA
注釋

在70-110％之外的％Rec，下劃線從樣品中檢測的面積減去對照中檢測的面積.類型(B空白，S標準物，IS內標，C對照樣品，F加標對照樣品，T處理過的樣品，FS加標標準物).SW樣品重量，XV提取物體積，AF等分試樣因子，FV最終體積，RFIS對IS進行歸一化的響應因子(分析物面積/IS面積/分析物ppb)，RF響應因子(分析物面積/分析物ppb).發現的mg/kg＝(面積/平均RF)×(FV×XV)/(AF×SW×1000)；發現的mg/kg(IS)＝(面積/IS面積/平均RFIS)×(FV×XV)/(AF×SW×1000)。
結果 檢測器響應 采用正離子ESI和串聯質譜法檢測的三重四極質譜儀用于樣品提取物分析。通過標準物溶液的分析，草甘膦、N-乙酰草甘膦以及AMPA和N-乙酰AMPA的全掃描總離子和MRM譜分別提供于
圖1-圖3。
對于草甘膦和N-乙酰草甘膦在0.5-20ng/ml的范圍內或者對于AMPA在1.0-50ng/ml的范圍內，校準標準物一般產生校準標準物響應因子(峰面積/濃度)的％RSD＜20％的線性響應(r2＞0.99)。每種分析物的典型校準曲線使用校準標準物從包括0.5-100ng/ml的擴展范圍的確認組進行繪制，并在圖4中給出。校準標準物的典型離子色譜提供于圖6。穩定同位素草甘膦和AMPA標準物的典型離子色譜提供于圖25。
對于玉米和大豆基質，來自未處理的對照樣品、0.050ppm(LOQ)加標樣品和0.50ppm加標樣品的提取物的典型色譜提供于圖8-圖21。對照 在玉米和大豆基質的對照提取物的色譜中，在草甘膦、AMPA或N-乙酰草甘膦洗脫的色譜保留時間下，沒有觀察到顯著的基質干擾。因為基因改造植物和包含草甘膦的除草劑在美國廣泛用于大豆農作物種植，所以市售樣品(包括有機樣品)通常包含草甘膦和AMPA殘留。用于本研究的大豆對照樣品是來自認證研究中的田間地塊的未處理的對照。
回收率(準確度與精度) 玉米基質的回收率結果提供于表1-表8(分別為飼料、谷粒、稿稈、油、面粉、硬渣、淀粉和粗粉)。大豆基質的回收率結果提供于表9-表14(分別為飼料、種子、干草、油、粗粉和外殼)。在玉米和大豆基質中在0.050mg/kg(LOQ)和0.50mg/kg加標水平下的平均結果以及總結果提供于概要部分的表格中。來自玉米粒、玉米油、大豆種子和大豆粉的各樣品組分析的典型回收率結果提供于表30-40。

表1B玉米飼料驗證結果(續表)

表2B玉米粒驗證結果(續表)

表3B玉米稿稈驗證結果(續表)
表4A玉米油驗證結果
表4B玉米油驗證結果(續表)
對于N-乙酰AMPA，合并玉米和大豆油驗證回收率 表5玉米面粉驗證結果
用作內標的草甘膦和AMPA穩定同位素. 表6玉米硬渣驗證結果
用作內標的草甘膦和AMPA穩定同位素. 表7玉米淀粉驗證結果
用作內標的草甘膦和AMPA穩定同位素。
*結果是同一提取物的2次注射(25μL和50μL注射體積)的平均值 表8玉米粗粉驗證結果
作內標的草甘膦和AMPA穩定同位素. 表9A大豆飼料驗證結果
下劃線表示從樣品峰面積減去對照樣品峰面積，以確定最終結果。
*用作內標的草甘膦和AMPA穩定同位素。草甘膦和N-乙酰草甘膦是處理2次的同一最終提取物的分析的平均值。
表9B大豆飼料驗證結果(續表)
表10A大豆種子驗證結果
用作內標的草甘膦和AMPA穩定同位素。
表10A大豆種子驗證結果(續表)
表11A大豆甘草驗證結果
用作內標的草甘膦和AMPA穩定同位素。
*同一提取物(再純化)的2次分析的平均值。
表11B大豆甘草驗證結果(續表)
表12大豆油驗證結果
用作內標的草甘膦和AMPA穩定同位素。
對于N-乙酰AMPA回收率數據，見表4 表13大豆粗粉驗證結果
用作內標的草甘膦和AMPA穩定同位素。
*對于AMPA分析，樣品組不同 表14大豆外皮驗證結果
用作內標的草甘膦和AMPA穩定同位素。
*對于AMPA，同一提取物的2次分析的平均值。
表15李子驗證結果
表16酸橙驗證結果
提取效率 在代謝研究中，使用tissumizer均化和手動(Wrist-action)振蕩器，在0.1％甲酸/甲醇(96/4，v∶v)中提取玉米飼料、谷粒或稿稈樣品3次。在該方法中應用的最大的提取物與樣品比是6比1(150ml比25g)，盡管該比率隨商品和提取重復而變化。
在該殘留物分析法中，樣品大小被降低至5.0g并且各商品和重復的溶劑與樣品比為至少5比1。表41對比了對于每種基質用于代謝和殘留物方法的樣品量和比率。
表41
在該殘留物分析法中提取步驟與應用于從農作物定量提取草甘膦相關殘留物的提取步驟一致。
通過在原始研究中的后置柱衍生化熒光(PCD-熒光)方法(Cowell等(1986)J.Agric.Food Chem.34955-960)和通過該LC/MS/MS方法，分析來自認證現場研究的遭受殘留的樣品的草甘膦和AMPA殘留物。在這些研究中的玉米包含EPSPS酶變體遺傳修飾，因此N-乙酰草甘膦代謝物不形成。表42概括了從2個試驗區收集的未處理的(對照)和處理的玉米粒樣品的以mg/kg(ppm)草甘膦游離酸當量計的結果。
表42
S00227147(對照)、S00227149和S00227154樣品從相同的試驗區收集并且使用后置柱衍生熒光檢測，觀察到增加AMPA殘余的干擾。
表43概括了從現場研究的2個試驗區收集的未處理的(對照)和處理的玉米粒、飼料和稿稈樣品的以mg/kg(ppm)草甘膦游離酸當量計的結果。
表43
來自兩個方法的分析結果顯示出玉米中草甘膦和AMPA的一致結果，并證實該分析法的提取效率。
定量限(LOQ) 對于在玉米和大豆基質中的草甘膦、N-乙酰草甘膦和AMPA，在該方法中驗證的LOQ是0.050ppm(mg/kg)。LOQ被定義為最低加標水平，在該水平下，達到70-120％的平均回收率和RSD＜20％。另外，在該加標水平，對于最小響應的分析物AMPA，分析物峰一致地表現出約5-20比1的信噪比。
背景評價 串聯質譜分析存在的背景水平最小。通常，樣品提取物溶液和校準標準物溶液的色譜圖顯得相同。檢測的每種基質的對照樣品色譜提供于圖9-圖21。
檢測限(LOD) LOD定義為在基質中響應相當于大約3比1的信噪比(s/n)的分析物濃度。對于各分析物，使用下列方程式，通過在LOQ加標樣品中確定的sn響應，估計LOD。

對于草甘膦，估計的LOD為0.004mg/kg，對于N-乙酰草甘膦為0.006mg/kg，而對于AMPA為0.007mg/kg；對于N-乙酰AMPA為0.006mg/kg。顯示出各分析物的s/n測定值和計算的估計值的各個色譜提供于圖26。觀察到LOD偏差，并且使用該方法的每一實驗室應該估計LOD值。
對于草甘膦和N-乙酰草甘膦，監測分子離子的兩個獨立的MS/MS躍遷。從校準標準物響應，確定兩個碎片離子的相對響應值比(基礎峰/二級峰)，用于證實基質樣品中的分析物。可接受的證實標準是相比于在校準標準物中觀察到的平均響應共洗脫峰(±5％)和當量離子比(±30％)在與樣品同時分析的LOQ當量濃度以上。在分析組中測定的各分析物的計算的響應比和保留時間示于表43-48。使用現有規范方法，可以確定草甘膦和AMPA的證實。參見，例如Cowell等(1986)J.Agric.Food Chem.34955-960；Alferness等(April 3，1993)“TouchdownDetermination of Glyphosate and Aminomethylphosphonic Acid in CornGrain，Corn Forage，and Corn Fodder by Gas Chromatography andMass-Selective Detection”；Zeneca Ag Products Analytical Method RR92-042B，可從U.S.EPA PesticidesAnalytical Methods & Procedures網站(www.epa.gov/oppbead1/methods/ram12b.htm)獲得；以及可從BfRFederal Institure for Risk Assessment獲得的Manual of Pesticide ResidueAnalysis卷I和II中的第405個方法，植物保護產品和除草劑的殘留的官方分析方法(L 00.0016)(www.bfr.bund.de/cd/1652)。
表43.玉米飼料典型的草甘膦和N-乙酰草甘膦確認結果。

比值下限＝0.7′平均比值，上限＝1.3′平均比值 保留時間(RT)上限＝平均值×0.95，上限＝平均值×1.05 表44.玉米粒典型的草甘膦和N-乙酰草甘膦確認結果
比值下限＝0.7′平均比值，上限＝1.3′平均比值 保留時間(RT)上限＝平均值×0.95，上限＝平均值×1.05 表45玉米稿稈典型的草甘膦和N-乙酰草甘膦確認結果
比值下限＝0.7′平均比值，上限＝1.3′平均比值 保留時間(RT)上限＝平均值×0.95，上限＝平均值×1.05 表46大豆飼料典型的草甘膦和N-乙酰草甘膦確認結果
比值下限＝0.7′平均比值，上限＝1.3′平均比值 保留時間(RT)上限＝平均值×0.95，上限＝平均值×1.05 表47.大豆種子典型的草甘膦和N-乙酰草甘膦確認結果
比值下限＝0.7′平均比值，上限＝1.3′平均比值 保留時間(RT)上限＝平均值×0.95，上限＝平均值×1.05 表48.大豆甘草典型的草甘膦和N-乙酰草甘膦確認結果
比值下限＝0.7′平均比值，上限＝1.3′平均比值 保留時間(RT)上限＝平均值×0.95，上限＝平均值×1.05 進行該方法的其它確認試驗。在玉米(飼料、顆粒和稿稈)和大豆(飼料、種子和干草)基質中，以0.050和0.50ppm水平對草甘膦、N-乙酰草甘膦和AMPA進行加標。使用VirTishearTM(Virtis Company Inc.，Gardiner，NY)勻化器，代替TissumizerTM勻化器，來在提取期間浸軟組織。使用Applied Biosystems/MDS SCIEX API 4000質譜儀代替QuattroPremier。注射體積被增加，以補償質譜儀靈敏度的下降。發現可接受的結果。數據未示出。API 4000 LC-MS/MS系統的儀器條件提供于表49和圖27-30。
表49API 4000LC/MS/MS條件和色譜
調節期間(min)值，使其與在第4.3.2節報道的、使用保護柱的HPLC的時間一致。
總之，目前公開的分析法適于在玉米和大豆基質中草甘膦、N-乙酰草甘膦以及AMPA和N-乙酰AMPA殘余的定量。結果證實了0.050mg/kg(ppm)的LOQ，其中對于草甘膦的LOD估計值為0.004mg/kg，對于N-乙酰草甘膦為0.006mg/kg，而對于AMPA為0.007mg/kg。
該分析法步驟被成功地應用于李子和酸橙，證明分別在水性和酸性農作物基質的適用性，即使這些作物類型不包含gat特性和N-乙酰草甘膦。
在驗證試驗中各分析物和基質的總平均回收率的范圍從75％(大豆皮中的草甘膦)到109％(大豆油中的AMPA)，其中最大RSD為19％(玉米油中的AMPA)。
基于保留時間和在樣品分析期間檢測的兩個MS/MS母體-至-碎片離子躍遷的相對比，在0.050mg/kg(LOQ)和0.50mg/kg加標水平，證明草甘膦和N-乙酰草甘膦的殘余證實。
實施例6 概述 檢測N-乙酰草甘膦、氨甲基膦酸(AMPA)和N-乙酰氨甲基膦酸(N-乙酰AMPA)。該研究被設計來證明本方法的實用性、重現性和效率。本方法被設計來測量植物基質中的草甘膦和代謝物，其中定量限(LOQ)為0.05ppm。在葡萄和大豆種子中，對于以0.05ppm加標五次的對照，通過獲得各個在70至120％的可接受范圍內的回收率，證實草甘膦和代謝物兩者以草甘膦當量計為0.05ppm的該方法的報告LOQ。
對于在該方法LOQ和每種基質的各自的容許水平下葡萄和大豆種子中的草甘膦和代謝物的定量，成功地驗證了本方法的性能。在葡萄中，用一個試驗成功驗證了該方法。對于大豆種子的成功驗證，需要兩個試驗。結果概述提供于下表中。
表54.回收率概述
在該方法期間進行的微小方法修改是在LC/MS/MS分析之前將20ppm加標樣品的最終大豆種子提取物稀釋100倍，以調節校準曲線內的殘余濃度。調節儀表參數來增加靈敏度。
具有多個反應監控(MRM)檢測的LC/MS/MS在與未加標的樣品中草甘膦和代謝物相當的保留時間下免于受到干擾。在葡萄和大豆種子中，對于以連個水平加標的對照樣品的五次重復分析，實現了可接受的回收率(70至120％)。在大豆種子中N-乙酰AMPA的一個126％的回收率被接受，這是基于大豆種子的回收率相一致并且在各加標水平下的該代謝物的平均回收率在70至120％的可接受范圍之內。
對于全部基質，未加標的對照樣品顯示出無可檢測的草甘膦或代謝物殘余。
在該研究中，加標水平被選擇來提供在該方法LOQ和在提出的容許水平下的方法性能數據。在所有基質中，對于所有分析物，以草甘膦當量計，LOQ為0.050ppm。對于所有分析物，葡萄以草甘膦當量計0.20ppm的所提出的容許水平加標，而大豆種子以草甘膦當量計20.0ppm的所提出的容許水平加標。在該概述表中給出的結果反映了各化合物的實際濃度；而不是草甘膦當量。
在沒有任何重大修改的情況下進行該分析法。對于大豆種子，在第二次嘗試，實現成功的確認組，而對于葡萄，在第一次嘗試，實現成功的確認組。該獨立的實驗室研究證明了該分析法適用于大豆種子和葡萄中的草甘膦和代謝物的定量。
測試系統 本方法適用于在各種農作物基質中草甘膦和草甘膦代謝物的定量。葡萄和大豆種子被選擇來驗證該分析法。葡萄對照基質從外面來源(有機食品店)購買。樣品被冷凍保藏并在被分析以證實該對照在適當的保留時間無干擾物之前進行處理。大豆種子對照基質由ABCLaboratories，Inc.，7200E.ABC Lane，Columbia，MO提供。
設備 下列設備細目用于進行該獨立的實驗室確認。
儀器/色譜法 MDS Sciex API 4000LC-MS/MS系統，包括 MDS Sciex API 4000MS/MS，系列號V04560403(AppliedBiosystems Group，Foster City，CA)，配備有TurboIonSpray接口和Analyst軟件版本1.4 HPLC柱4.6mm i.d.×150mm，Phenomenex Luna Phenyl Hexyl，系列號208752-1，3-μm直徑填充部件編號00F-4256-E0(Phenomenex，Torrance，CA) 十孔電動閥，系列號EM2M06183 (ValcoInstruments Co.Inc.，Houston，TX) Shimadzu LC-10ADVP HPLC泵，系列號C20964153748US和C20964153747US(Shimadzu US Manufacturing Inc.，Columbia，MD) Shimadzu SiL-HTC自動進樣器，系列號L20024250137US (Shimadzu US Manufacturing Inc.，Columbia，MD) Shimadzu CTO-10AVP Colurnn Oven，系列號C2102 41 50408 (Shimadzu US Manufacturing Inc.，Columbia，MD) Shimadzu DGU-14A脫氣器，系列號SS132668 (Shimadzu US Manufacturing Inc.，Columbia，MD) Phenomenex C18保護柱，4×3mm，部件編號AJO-4287 固相提取設備/供應商 24-孔SPE真空歧管(Burdick and Jackson，Muskegon，MI) Bond Elut SPE柱體C18，500mg/6cc，Cat No.12102052，Lot No.0723704(Varian，Inc.Palo Alto，CA) Oasis MAX SPE柱體，500mg/6ml，目錄號1860000865，Lot No.001336341A(Waters Corporation，Millford，MA) Oasis MCX SPE柱體，500mg/6ml，目錄號1860000776，Lot No.002236322A(Waters Corporation，Millford，MA) 實驗室器皿 15ml聚丙烯離心管，部件編號20171-024 (VWR，West Chester，PA 19380) 50ml聚丙烯離心管，部件編號89004-367 (VWR，West Chester，PA 19380) 帶蓋硼硅酸鹽玻璃閃爍瓶，20ml部件編號986546 (Wheaton，Millville NJ 08332) HPLC瓶，2ml，部件編號5182-0716 (Agilent Technologies，Palo Alto，CA 94306) HPLC瓶蓋，部件編號5182-0717 (Agilent Technologies，Palo Alto，CA 94306) 一次性移液管，3ml，部件編號16001-176 (VWR，West Chester，PA 19380) Pyrex量筒，100ml，帶塞，部件編號CLS2982250和CLS3022250 (Sigma-Aldrich，St.Louis，MO 63103) HDPE廣口聚丙烯瓶，250ml，帶無襯墊蓋，部件編號209548SP (Wheaton，Millville，NJ 08332) 注射過濾器，尼龍0.45μm，30-mm直徑過濾器單元，部件編號F2500-1 (National Scientific，Rockwood，TN37854) 注射過濾器，尼龍0.20μm，17-mm直徑過濾器單元，部件編號F2513-2 (National Scientific，Rockwood，TN 37854) 試劑 丙酮-HPLC-級，目錄號AX0115-1，EMD (Chemicals，Gibbstown，NJ) 冰醋酸，目錄號9515-03(J.T.Baker，Philipsburg，NJ) 乙腈-HPLC-級，目錄號AX0145-1(僅用于LC/MS/MS針漂洗)(EMD Chemicals，Gibbstown，NJ) 氫氧化銨-28％NH3水溶液，99.99+％純(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO 63103) 二氯甲烷-HPLC-級，目錄號DXO838-1(EMD chemicals，Gibbstown，NJ) 甲酸，99.0％純，Fluka，目錄號06440(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO 63103) 甲醇-HPLC-級，目錄號MX0475-1(EMD Chemicals，Gibbstown，NJ) 磷酸-Baker Analyzed 86.0％純，目錄號7664-38-2(J.T.Baker，Philipsburg，NJ) 三氟乙酸，99.0％純，Fluka，目錄號91703(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO 63103) 水-超高純度，獲自Purelab Classic UV UHP水系統 分析法原理 使用探針勻化器，將草甘膦、N-乙酰草甘膦、AMPA和N-乙酰AMPA從葡萄和大豆種子樣品提取入稀含水酸/甲醇(96/4，v/v)。進行三次提取，用于分析物的定量回收，然后繼續純化和分析。
草甘膦和N-乙酰草甘膦的純化一部分提取物用二氯甲烷分配，而含水部分被回收并過濾，以除去微粒。大約10ml的含水部分在通過C18SPE柱體過濾后進行收集。一部分從C18SPE收集的洗脫物被稀釋并施加于MAX SPE柱體。在幾次溶液漂洗后，在1％TFA的甲醇/水(90/10)溶液中，從MAX吸附劑洗脫分析物。將MAX洗脫物蒸發至干燥并且再溶解于0.02M磷酸水溶液、過濾并分析草甘膦和N-乙酰草甘膦。分配之后，使大豆種子樣品經受蒸汽浴大約15分鐘，以在微粒過濾之前沉淀提取物中的其它物質。
AMPA和N-乙酰AMPA的純化從上面描述的C18SPE收集的第二部分洗脫物通過MCX SPE柱體處理。將樣品施加于柱體，然后用水和甲醇洗脫。N-Evap用來吹凈溶劑；添加濃縮的磷酸水溶液，以便最終溶液等于0.02M磷酸水溶液。然后，分析樣品的AMPA和N-乙酰AMPA。在施加到柱體之前，大豆種子樣品在甲醇中稀釋。
修改、解釋和關鍵步驟 對于大豆種子中草甘膦的確認，進行微小的方法修改。在LC/MS/MS分析之前，最終提取物被稀釋100倍，以在校準曲線的范圍內并入殘留物。
修改一些API 4000LC/MS/MS儀器參數，以優化靈敏度。該修改包括增加源溫、調節碰撞能電勢和調節氣流設置。
在該方法的實施例4A的步驟2.2中，蒸汽浴溫度不被指定。在與贊助者的通信過程中，85℃的溫度被推薦來更有效地從基質沉淀蛋白質。
在實施例4C的步驟5.0中，推薦使用具有平面底部或稍微斜率底部的50ml或20ml收集容器。由此，假定15-ml離心管將是適當的。然而，基于在第3組大豆種子試驗1中獲得的低回收率，由此確定具有更扁平底部和更大表面積的20ml閃爍管為有效蒸發所需。
儀器 色譜法反相液相色譜用來從共提取劑分離草甘膦和它的代謝物。選擇Phenomenex Luna Phenyl Hexyl柱。
表55.HPLC條件
LC/MS/MS分析 使用MDS Sciex API 4000LC/MS/MS——其配備有TurboIonSpray源并在MRM、正離子模式下操作，進行草甘膦和它的代謝物的分析。在Analyst軟件版本1.4上，使用具有1/x加權的線性回歸，基于每種分析物的單離子躍遷的積分面積，進行定量。典型實驗條件的概要提供于表56。
表56.MDS Sciex API 4000MS/MS質譜儀條件
表56.
校準步驟 在每組中用樣品包埋校準標準物，并且通常從低到高濃度進展。通過將每一標準物的分析物峰面積除以對于該標準物的分析物濃度，計算每一校準標準物的響應因子。對于每一組注入的校準標準物，計算平均響應。
結果和討論 檢測器響應 在0.5到100ng/ml的范圍內分析校準標準物。MS/MS檢測器響應在分析的標準物的范圍內與1/x加權成線性關系。檢測器響應在每一分析試驗的整個過程中是穩定的，如通過標準物準確度值所證明。
對照樣品 在與每一確認試驗同時分析的一式兩份未加標對照樣品中，在草甘膦或它的代謝物的保留時間下，沒有檢測到干擾峰。
試驗1，大豆種子 大豆種子的第一個試驗(第3組)失敗，原因在于對于草甘膦和每種代謝物觀察到的低回收率。試驗1的結果總結在表57中。
表57.失敗的大豆種子的回收率總結試驗1
根據該分析法中給出的步驟，分析大豆種子的第一個試驗，只是草甘膦和AMPA穩定同位素不用作內標，并且MAX SPE的收集器與該方法中推薦的較大體積和尺寸不一致。
在大豆種子的第一個試驗的分析之后，由此確定草甘膦的低回收率可能由于樣品沒有完全通過吹凈干燥以及缺乏內標。未檢出N-乙酰AMPA可能與最終溶液中由于樣品通過吹凈沒有干燥造成的殘留TFA導致的保留時間變化有關系。進一步，所有的方法展開和確認工作已經在蒸汽浴步驟期間在至少80℃的溫度下進行。在大豆種子的第一次試驗中蒸汽浴的溫度為45℃。這可能并沒有促進基質內的蛋白質沉淀出，其可能在LCMS/MS分析期間抑制分析物。在LCMS/MS分析期間，草甘膦和AMPA內標的添加還將對于抑制和漂移進行調整。
試驗2，大豆種子 在第一個試驗失敗后，根據在通信中闡明的分析法中給出的步驟，分析第二個大豆種子試驗(第4組)。制備一組新的校準標準物與所摻入的內標，用于第二個試驗的分析。草甘膦提取物在20ml玻璃閃爍管中吹凈，以確保完全干燥。在分析之前，將內標添加至全部樣品。
草甘膦、AMPA和N-乙酰草甘膦的回收率在70到120％的可接受范圍之內。N-乙酰AMPA具有一個126％的回收率，其在70到120％的可接受范圍之上。然而，這些結果基于它們的一致性而被接受，并且對于每一加標水平的平均回收率值在70到120％的可接受之內，因此對于大豆種子中草甘膦和代謝物的分析建立了成功的方法確認。校準數據和示例性色譜未示出。草甘膦和代謝物的回收率數據在表58中給出。
表58.成功的大豆種子的草甘膦回收率總結試驗2
試驗1，葡萄 對于葡萄，在第一個試驗(第2組)中獲得成功的回收率數據。對于校準數據圖，參考圖31至圖34，以及參考圖35至圖58，例如葡萄試驗1的色譜。這些確認試驗的回收率數據在表59中給出。
表59.成功的葡萄試驗的回收率總結
結論 本研究證明了該分析法適用于大豆種子和葡萄中的草甘膦和代謝物的定量。該方法所述的0.05ppm的LOQ通過來自在兩種基質中以該水平加標的對照的可接受的回收率值加以證明。在葡萄(0.2ppm)和大豆種子(20ppm)中所提出的草甘膦的容許限下可接受的方法性能通過在每一基質中以這些水平加標的對照樣品所獲得的可接受回收率加以證明。數據總結在表50-67中給出。
表50.在葡萄中草甘膦和N-乙酰草甘膦加標(回收率)數據總結
達到過多個有效數字的殘余物值被用于計算回收率％。
在計算后，回收率％的值被四舍五入為最接近的整數并報告。
表51.在葡萄中AMPA和N-乙酰AMPA加標(回收率)數據總結
達到過多個有效數字的殘余物值被用于計算回收率％。
在計算后，回收率％的值被四舍五入為最接近的整數并報告。
表52在大豆種子中草甘膦和N-乙酰草甘膦加標(回收率)數據總結
達到過多個有效數字的殘余物值被用于計算回收率％。
在計算后，回收率％的值被四舍五入為最接近的整數并報告。
表53在大豆種子中AMPA和N-乙酰AMPA加標(回收率)數據總結
達到過多個有效數字的殘余物值被用于計算回收率％。
在計算后，回收率％的值被四舍五入為最接近的整數并報告。








實施例5.使用LC/MS/MS測定各種基質中N-乙酰草甘膦及其它分析物的分析法 概述 開發出測定動物基質(包括乳、蛋、肌肉、腎臟、肝臟和脂肪)中N-乙酰草甘膦、草甘膦AMPA和N-乙酰AMPA的分析法。每一分析物以草甘膦當量計的方法目標定量限(LOQ)在蛋、乳和肌肉基質中為0.025mg/kg，而在腎臟、肝臟和脂肪基質中為0.050mg/kg。該方法分別以LOQ和10×LOQ水平驗證。乳和蛋基質在0.025mg/kg(LOQ)、0.050mg/kg(2×LOQ)和0.5mg/kg(20×LOQ)驗證。對于每一基質，使用LC/MS/MS系統，該系統采用電噴霧接口(ESI)以正或負離子模式檢測進行操作。該分析法被開發來支持基因改造農作物注冊所需的飼料研究中的殘留物數據收集。
對于乳和蛋基質而言，基質樣品在含水0.1％甲酸/甲醇(96/4，v/v)中稀釋并搖動以在含水介質中稀釋樣品。樣品可冷凍保藏或立即提取而沒有冷凍。該稀釋樣品用己烷(如果冷凍的話在融化之后)和己烷分配并丟棄己烷層。剩余含水部分用二氯甲烷分配，并收集水層。二氯甲烷部分用另外的0.1％甲酸/甲醇(96/4，v/v)回提，用于分析物的定量回收。合并含水部分并稀釋至最終體積50mL。一部分含水部分通過C18SPE柱體進行過濾。取決于待檢測的基質和分析物，使用高分子陰離子交換(MAX)SPE柱體和/或高分子陽離子交換(MCX)SPE柱體，通過固相提取來進一步純化C18過濾的提取物。在離子交換SPE純化之前，用作內標的草甘膦和/或AMPA穩定同位素標準物被添加至提取物。在LC/MS/MS分析之前，過濾最終提取物。
對于動物組織基質，在0.1N HCl溶液(96％水/4％甲醇)繼之以水中提取之前，基質樣品最初與C18吸附劑材料混和(基質固相分散)，得到50mL的最終提取物體積。一部分提取物在乙腈和甲醇中稀釋，以沉淀蛋白質，然后取決于待檢測的基質和分析物，使用高分子陰離子交換(MAX)SPE柱體和/或高分子陽離子交換(MCX)SPE柱體，通過固相提取來進一步純化。在離子交換SPE純化之前，用作內標的草甘膦和/或AMPA穩定同位素標準物被添加至提取物。在LC/MS/MS分析之前，過濾最終提取物。
最終提取物和校準標準物溶液被調節至0.02M磷酸。以正離子LC/MS/MS模式操作，使用采用反相色譜的HPLC和具有電霧化源的三重四極質譜儀，分析樣品和標準物。
分別以LOQ和更高水平加標的基質樣品的回收率支持了該方法的令人滿意的性能。表68-71總結了樣品基質中N-乙酰草甘膦、草甘膦、N-乙酰AMPA和AMPA的平均回收率結果。肝臟、脂肪和肌肉包括來自母牛和小雞的樣品。母牛是腎臟樣品的來源。
表68
表69
表70
表71
材料 表72.設備
表73. HPLC/MS系統
試劑和標準物 表74.試劑
參考分析標準物 參考標準物由DuPont Crop Protection，E.I.du Pont de Nemours andCompany，Wilmington，DE供應。與參考標準物的表征和穩定性連同化學留樣有關的信息由E.I.du Pont de Nemours and Company，DuPontCropProtection，Newark，Delaware歸檔。固體形式的參考標準物在室溫下儲存在通常存在干燥劑的干燥器中。用于內標的草甘膦和AMPA的穩定同位素標準物獲自Dr.Ehrenstorfer GmbH(Atlanta，Georgia)。
分析法原理 對于乳和蛋商品而言，基質樣品(2g)在含水0.1％甲酸/甲醇(96/4，v/v)中稀釋并搖動以在含水介質中稀釋樣品。該稀釋樣品用己烷分配并丟棄己烷層。剩余含水部分用二氯甲烷分配，并收集水層。二氯甲烷部分用另外的0.1％甲酸/甲醇(96/4，v/v)回提，用于分析物的定量回收。合并含水部分并稀釋至最終體積50mL。一部分含水部分通過C18SPE柱體進行過濾。取決于待檢測的基質和分析物，使用高分子陰離子交換(MAX)SPE柱體和/或高分子陽離子交換(MCX)SPE柱體，通過固相提取來進一步純化C18純化的提取物。對于MAX SPE，一部分的C18洗脫物和內標用水稀釋至20mL并施加于調節的SPE柱體。用甲醇/水(80/20)、在甲醇/水(80/20)中的0.1M乙酸和甲醇/水(95/5)順序漂洗。在混合和過濾之后，該分析物在1％TFA在90％甲醇/10％水中的溶液中洗脫并且洗脫物被蒸發至干燥，然后在用于LC/MS/MS的最終溶液中恢復，用于草甘膦和N-乙酰草甘膦和/或N-乙酰AMPA的分析。對于MCX SPE，一部分的C18洗脫物和內標通過調節的SPE柱體繼之以甲醇漂洗進行洗脫。從MCX SPE柱體收集負載和甲醇漂洗液，并蒸發甲醇，然后提取物稀釋到含有0.02M磷酸的最終體積、混合并過濾，用于進行N-乙酰草甘膦、AMPA和/或N-乙酰AMPA的LC/MS/MS，取決于樣品基質。
對于動物組織商品，樣品(2g)與C18吸附劑(4g)混和，直到組織被浸軟和勻化(基質固相分散)。使用渦旋和機械搖動，在25mL 0.1N HCl溶液(96％水/4％甲醇)中提取預備的樣品。在離心之后將提取溶液從樣品傾析，然后樣品用水再提取，用于分析物的定量轉移，達到50mL的最終提取物體積。取決于待檢測的基質和分析物，使用高分子陰離子交換(MAX)SPE柱體和/或高分子陽離子交換(MCX)SPE柱體，通過固相提取來進一步純化提取物的等分試樣。對于MAX SPE純化，一部分的提取物在存在三乙胺的情況下在乙腈和甲醇中稀釋(調節pH為堿性，以促進蛋白質沉淀和預備分析物，以加載在陰離子交換介質上)。在離心分離顆粒沉淀物之后，提取物溶液用甲醇稀釋至大約20mL并加載在調節過的MAX SPE柱體上。用甲醇/水(80/20)、在甲醇/水(80/20)中的0.1M乙酸和甲醇/水(95/5)順序漂洗。在混合和過濾之后，該分析物在1％TFA在90％甲醇/10％水中的溶液中洗脫并且洗脫物被蒸發至干燥，然后在用于LC/MS/MS的最終溶液中恢復，用于草甘膦和N-乙酰草甘膦和/或N-乙酰AMPA的分析。對于MCX SPE，一部分的提取物在乙腈和甲醇中稀釋，以促進蛋白質沉淀。在離心分離顆粒沉淀物之后，提取物溶液用甲醇稀釋至大約20mL并加載在調節過的MCXSPE柱體上。MCX吸附劑用甲醇漂洗，然后分析物在水中(4mL)繼之以甲醇(4mL)中洗脫，用于定量回收。使在收集的洗脫物中的甲醇蒸發，并溶液被調節至包含0.02M磷酸的最終體積、混合并過濾，用于LC/MS/MS，進行AMPA分析。
在離子交換SPE純化之前，用作內標的草甘膦和/或AMPA穩定同位素標準物被添加至提取物。最終提取物在0.02M磷酸水溶液中制備并在LC/MS/MS分析之前過濾(0.2μm)，以除去微粒，作為HPLC系統的預防性維護措施。磷酸在HPLC高分子固定相上作為弱離子配對劑，并用作最終溶液，以改善草甘膦LC/MS/MS性能(響應和線性)。通過使用苯基-己基分析柱的HPLC反相色譜，聯接電噴射離子化作用，連同MS/MS檢測一起，以獲得2個分子離子躍遷(在正離子模式下，對于AMPA，僅監測1個離子躍遷)，解析分析物。使用單一分子離子躍遷進行定量分析。2個MS/MS碎片離子的相對豐度提供了草甘膦、N-乙酰草甘膦、N-乙酰AMPA和AMPA的確認證據(負模式)。
分析步驟 試劑溶液的制備和穩定性 下列步驟可被調整，以制備不同的體積。
含水0.1％甲酸/甲醇(96/4，v/v)提取溶液每升體積，添加40mL的甲醇，繼之以0.96mL的甲酸至1-L刻度量筒并用HPLC級凈化水稀釋至最終體積。轉移溶液至干凈的瓶子并蓋上蓋。溶液可在室溫下儲存并應該至少每月制備一次。
在水/甲醇(96/4，v/v)中的0.1 NHCl提取溶液每升體積，在1L量筒中添加水到至少一半體積，繼之以8.3mL的濃HCl。添加40mL甲醇并用HPLC級凈化水稀釋至1L的最終體積。轉移溶液至干凈的瓶子并蓋上蓋。溶液可在室溫下儲存并應該至少每周制備一次。
80％或95％甲醇水溶液每升體積，分別添加800mL或950mL的甲醇至1L量筒并用HPLC級凈化水稀釋至最終體積。轉移溶液至干凈的瓶子并蓋上蓋。溶液可在室溫下儲存并應該至少每月制備一次。
0.1m乙酸在80％甲醇/水中的溶液每升體積，添加5.73mL乙酸至在1L量筒中的200mL HPLC級凈化水并用甲醇稀釋至最終體積。轉移溶液至干凈的瓶子并蓋上蓋。溶液可在室溫下儲存并應該至少每月制備一次。
0.25％氫氧化銨水溶液每升體積、添加10ml氫氧化銨溶液(最低25％)至小體積的HPLC級凈化水，然后用HPLC級凈化水稀釋至最終體積。這是蛋和乳MAX SPE的調節溶液(12mL/樣品，水稀釋法)。溶液可在室溫下儲存并應該至少每月制備一次。注1ml25％氫氧化銨稀釋至100ml≈0.25％NH4OH。
0.1％三乙胺(TEA)在甲醇/乙腈(75/25，v/v)中的溶液每升體積，添加1.0mL TEA至在1L量筒中的750mL甲醇并用乙腈稀釋至最終體積。這是組織MAX SPE的調節溶液(12ml/樣品，甲醇稀釋法)。溶液可在室溫下儲存并應該至少每月制備一次。
洗脫溶液，在90％甲醇/10％水中的1％TFA制備分析所需的足夠體積。對于100mL體積，在100mL量筒中將1mL的三氟乙酸添加至約10mL的HPLC級凈化水，然后用甲醇稀釋至最終體積。轉移溶液至干凈的瓶子并蓋上蓋。對于每一樣品，需要8ml的洗脫溶液(100mL制備液與要求96mL的12個樣品相一致)。按需制備，不儲存。
1.0M磷酸溶液每10ml體積，0.67ml濃磷酸(最小85％)被添加到在15-ml聚丙烯離心管中的HPLC級凈化水中并用HPLC級凈化水、采用管上梯度稀釋至最終體積。溶液可在室溫下儲存并應該至少每月制備一次。
樣品和標準物最終溶液，0.02M磷酸水溶液每升體積，1.34ml濃磷酸(最小85％)被添加到在1L量筒中的HPLC級凈化水中并用HPLC級凈化水稀釋至1000ml的最終體積。轉移溶液至干凈的瓶子并蓋上蓋。溶液可在室溫下儲存并應該至少每月制備一次。
0.2M甲酸水溶液，含水流動相每升體積，8.3ml濃甲酸(98％)被添加到在1L量筒中的HPLC級凈化水中并用HPLC級凈化水稀釋至1000ml的最終體積。轉移溶液至干凈的瓶子并蓋上蓋。溶液可在室溫下儲存并應該至少每月制備一次。
儲備標準物制備和穩定性 如果可能，使用純度大于95％的標準物。在分析天平上稱最少大約10mg的標準物，該分析天平提供精確到三位有效數字的重量，或者標準物的量應該增加至滿足該條件。
因為以草甘膦游離酸當量計確定殘留物容許量，所以以草甘膦游離酸當量制備各種分析物的儲備標準物溶液，以便以母體游離酸當量確定強化和回收率。需要時，通過添加適當量的標準物至100-ml容量瓶并用水稀釋到最終體積，制備N-乙酰草甘膦、草甘膦、N-乙酰AMPA或AMPA的各個游離酸當量儲備標準物溶液。水是指HPLC級水或等效水。下列計算和實例提供了制備100mL的以草甘膦當量計的100μg/ml每一分析物儲備溶液的指導。

N-乙酰草甘膦實例
對于每一分析物所稱量的量應該為至少10mg。各分析物儲備溶液濃度以草甘膦當量計可以超過100μg/ml。儲備標準物溶液可以以較高的濃度(不超過1mg/mL)制備。應該觀察到最低大約10mg的標準物重量和至少10ml的最終標準物體積。
內標制備和穩定性 草甘膦1，2-13C215N和氨甲基膦酸13C15N(AMPA)穩定同位素標準物被提供于包含1.1ml標稱濃度為100mg/L(μg/ml)的水溶液的琥珀色安瓿瓶中。將每一標準物溶液轉入15mL聚丙烯離心管并用最初容器的HPLC級水稀釋水漂洗液稀釋至5mL體積，用于標準物的定量轉移。儲備標準物溶液的最終濃度為大約20μg/ml。通過分析大約500ng/ml的溶液，驗證各標準物的同位素純度。見圖74。
通過以在100mL的0.02M磷酸水溶液或HPLC級凈化水中0.1mL的比率稀釋100μg/ml儲備溶液，制備含有草甘膦和AMPA同位素的中間100ng/ml內標溶液。內標以50μL/mL包括在最終提取物和校準標準物溶液中。當250μL的內標被施加于5mL最終提取物中時，每100ml的100ng/ml標準物溶液可被用于高達400個樣品。
具體地說，單獨將100μg/ml標準物轉移到15mL聚丙烯離心管并用最初容器的HPLC級水稀釋水漂洗液稀釋至5mL體積，用于標準物的定量轉移。儲備標準物溶液的最終濃度為大約20μg/ml。對于每一儲備溶液，0.025mL的20μg/ml標準物溶液被轉入自動進樣器小瓶并用0.975mL的0.02M H3PO4稀釋至1mL體積，以制備大約500ng/ml的單獨溶液，用于純度評價。
接下來，各20μg/ml標準物儲備溶液的1.00mL試樣被合并入單個250mL量筒并用0.02M H3PO4稀釋至最終體積，以制備100ng/ml的混合溶液。100ng/ml IS溶液被轉入250mL瓶。溶液被冷藏。(～4℃)。
中間體和加標標準物制備和穩定性 每一分析物的儲備溶液被適當稀釋入共同的容量瓶、用HPLC級凈化水稀釋至容量、蓋上蓋并充分混合。例如，將每種需要的分析物的1.00ml的100μg/ml儲備溶液合并在10mL容量瓶中，并用水稀釋至最終體積、蓋上蓋并充分混合。它在4℃或以下儲存并每月更換。
儲備溶液濃度將變化并且用于制備加標溶液所需的每一分析物儲備溶液體積被調整，以獲得如使用下列計算確定的正確的最終濃度。

例如，為從分別以草甘膦游離酸當量濃度計115μg/ml、186μg/ml、143和206μg/ml制備的草甘膦、N-乙酰草甘膦、N-乙酰AMPA和AMPA儲備溶液制備50mL的10μg/ml加標溶液，下列儲備溶液體積被添加至50mL容量瓶。
草甘膦＝10μg/mL×50mL/115μg/mL＝4.35mL儲備溶液 N-乙酰草甘膦＝10μg/mL×50mL/186μg/mL＝2.69mL儲備溶液 N-乙酰AMPA＝10μg/mL×50mL/143μg/mL＝3.50mL儲備溶液 AMPA＝10μg/mL×50mL/206μg/mL＝2.42mL儲備溶液 10.0μg/mL加標溶液 每一儲備溶液被適當用水稀釋入容量瓶、蓋上蓋并充分混合。例如，將1.00ml的100μg/ml儲備溶液合并在10mL容量瓶中，并用水稀釋至最終體積、蓋上蓋并充分混合。它在4或以下儲存并每月更換。1.0μg/mL加標溶液 10.0μg/ml加標溶液(優選的)或每一分析物的儲備溶液用水適當稀釋入容量瓶中。例如，將1.0ml的10.0μg/ml加標溶液轉入10mL容量瓶，并用水稀釋至容量、蓋上蓋并充分混合。它在4℃或以下儲存并每月更換。
色譜標準物制備和穩定性 通過加標標準物或各儲備標準物的稀釋，制備校準標準物。在從大約50％的LOQ當量最終濃度至≥120％的最高預期最終樣品濃度的范圍內，最少5個校準標準物被推薦用于定量。N-乙酰草甘膦的LOQ當量最終濃度為1.0ng/ml。
例如，通過在0.02M磷酸水溶液中稀釋100μL分別等分試樣至10.0mL的最終體積，分別從1.0和10.0μg/ml加標溶液制備10.0ng/ml和100ng/ml的校準標準物(這模擬樣品加標)。使用該方法，與樣品加標同時制備校準標準物。
樣品的來源(與表征) 全脂牛乳獲自University of Delaware Agricultural Farm。乳品(全脂奶、脫脂乳和高脂奶油(heavy cream))和蛋獲自當地超市。牛肝、腎、脂肪和肌肉獲自牛飼養研究。家禽肝臟、脂肪和肌肉獲自產蛋母雞飼養研究。
樣品的儲存與制備 在二次取樣之前，攪打整蛋。在二次取樣之前，蛋白和蛋黃被分開并攪打。蛋品子樣品(2g)被稱入去皮重的50mL聚丙烯離心管。如果不立即分析子樣品，則25mL的含水0.1％甲酸/甲醇(96/4，v/v)被添加、蓋上蓋、混合并冷凍樣品。
全脂牛奶、全脂奶、脫脂乳或高脂奶油(heavy cream)子樣品(2g)被稱入去皮重的50mL聚丙烯離心管。如果不立即分析子樣品，則25mlmL的含水0.1％甲酸/甲醇(96/4，v/v)被添加、蓋上蓋、混合并冷凍樣品。
在冷凍器儲藏之前，使用Waring商業食品處理機(Lab MicronizerModel 31FP93)，將動物組織樣品與干冰一起磨碎。在研磨處理期間，樣品被充分混合，以確保優良的浸軟和均一性。在二次取樣和冷凍器儲藏之前，使干冰在通風櫥升華或在冷凍機中過夜升華。
在樣品提取和分析之前，全部冷凍的樣品被儲存在-20±5℃。樣品加標方法 在提取容器(50mL離心管)中的未處理的基質對照樣品根據需要被加標。10.0和1.0μg/ml加標標準物(參見上文)用來加標測試樣品。表75被提供作為該研究中進行的加標實例。
表75
對于基質樣品，將2.0±0.1g的樣品稱入干凈的50ml離心管。對于乳和蛋品，在加標之后樣品被溫和地打漩或渦旋，以在樣品中分散分析物。對于動物組織商品，使樣品在通風櫥中放置大約15分鐘，以使加標溶液擴散。在加標之后，在提取和分析之前，乳和蛋樣品在25mL的含水0.1％甲酸/甲醇(96/4，v/v)中稀釋、冷凍并儲存。
分析物提取方法 對于乳/蛋和動物組織商品，提供了單獨的分析物提取方法。
乳和蛋商品 1.0 對于新制備的樣品，樣品被酌情加標并且在加標之后被溫和地打漩或渦旋，以在樣品中分散分析物。
2.0 對于新制備的樣品，25mL的含水0.1％甲酸/甲醇(96/4，v/v)被添加至每一樣品、蓋上蓋、渦旋混合大約5秒。樣品可以被儲存，用于過后冷凍。
3.0 如果樣品冷凍儲存，則樣品在超聲波浴中融化(大約15min)。注可以在樣品架中，通過在管的上部適當保持覆蓋，一起搖動樣品。
4.0 20ml的己烷被添加至樣品，蓋上蓋并溫和地搖動至少30秒。
5.0 在足以分辨分配(上層的己烷、含水部分和形成的沉淀)的速度下離心樣品10分鐘。
6.0 在不干擾下層的水層的情況下，盡可能多的上層的己烷部分被移液管吸去，并且丟棄(剩余的己烷將并入下一步的二氯甲烷部分)。
7.0 20ml的二氯甲烷被添加至樣品，蓋上蓋并溫和地搖動至少30秒。
8.0 在足以分辨分配(上層的己烷、形成的沉淀和下層的二氯甲烷)的速度下離心樣品10分鐘。
9.0 在不干擾下層的沉淀和二氯甲烷部分的情況下，盡可能多的上層的含水部分被轉入干凈的50mL量筒(TC)。
10.0 20ml的含水0.1％甲酸/甲醇(96/4，v/v)被添加至每一樣品，蓋上蓋并溫和地搖動至少30秒。
11.0 重復步驟8.0和9.0且提取物與50mL量筒中的第一提取物合并。
12.0 該合并的提取物在量筒中用含水0.1％甲酸/甲醇(96/4，v/v)稀釋至50mL或者如果提取物體積超過50mL，則該體積被調節至mL讀數并記錄最終體積。
13.0 通過來回倒提取物，將含水轉入干凈的50mL管或瓶，并最終轉入干凈的容器以混合。
肉組織商品 1.0 將2.0±0.1g的勻化組織在去皮重的50ml聚丙烯離心管中稱重。
2.0 大約4g的C18吸附劑被添加至樣品管(4g吸附劑相當于在15mL離心管中裝滿7mL)。
3.0 樣品和C18吸附劑用抹刀充分混合，用于基質的固相分散。
4.0 25mL在96％水/4％甲醇中的0.1N HCl被添加、渦旋并在手動振蕩器上搖動15min。
5.0 進行10min(最低3500rpm)的離心并通過配備有聚乙烯孔(frit)的容器將上清液傾析入50mL聚丙烯離心管。在全部提取物已經被添加之后短暫施加真空以開始過濾，然后破壞真空。
6.0 20mL的水被添加至樣品顆粒，渦旋樣品以重懸樣品，離心，然后樣品溶液通過具有紙孔(paper frit)的容器傾析入各自的50mL聚丙烯離心管。如果需要，在全部提取物已經被添加之后短暫施加真空以開始過濾，然后破壞真空。
7.0 共同的水體積被添加至每一樣品顆粒以對于所有提取物實現最終提取物接近但小于50mL(通常8-10ml)。渦旋樣品并倒入容器，施加真空以收集最終漂洗液。樣品收集管被除去，而最終體積用水調節至50mL。樣品提取物可以進行離心，并在渦旋之后傾析入容器以防止孔堵塞。該選擇被推薦用于肌肉提取物。
分析物純化方法 C18SPE過濾、MAX SPE和MCX SPE過濾方法被應用于乳(除了脫脂乳)和蛋商品樣品提取物。
C18SPE過濾(全脂牛奶、奶油和蛋商品) 1.0 廢料接收管被安裝在真空歧管處，以收集調節溶液和初始的樣品負載體積(廢料接收管用來容納含分析物的洗脫物和防止交叉污染)。
2.0 C18SPE(6cc/500mg，Varian#_12102052)柱體用～1mL甲醇、繼之以2CV(CV≈6mL)的含水0.1％甲酸/甲醇(96/4，v/v)來調節。對于慢滴注速率(1-2mL/min)，在需要時施加真空或正壓。
3.0 當最后的調節溶液進入吸附劑時，來自分析物提取方法步驟13.0的4.0mL含水樣品提取物被添加在SPE柱上。
4.0 在滴注停止之后，移去廢料接收管并安裝干凈的15mL離心管。添加來自分析物提取方法步驟13.0的10mL含水樣品提取物、洗脫并收集洗脫物。將提取物蓋上蓋并渦旋混合。樣品可以進行離心，以部分凈化該溶液(細微粒需要較高的離心速度，例如7000rpm)。
MAX SPE 純化(乳和蛋商品) 在蛋基質和脫脂乳中的草甘膦、N-乙酰草甘膦和N-乙酰AMPA的分析。在全脂牛奶或奶油中僅分析草甘膦。
1.0 0.25mL內標+2.5ml的C18純化提取物被轉入50mL刻度離心管并用HPLC級水稀釋至大約20ml。
2.0 MAX SPE(6cc/500mg)柱體用1CV(柱體積，～6ml)的甲醇、繼之以2CV 0.25％氫氧化銨在HPLC級水中的溶液來調節。
3.0 當最后的調節溶液進入吸附劑，裝載樣品提取物溶液。可能需要施加微小真空，但滴注速率保持緩慢。
4.0 在最后的樣品溶液進入吸附劑之后，10mL的80％甲醇/水、10ml在80％甲醇/水中的0.1M乙酸和10ml的95％甲醇水被順序添加，以漂洗SPE柱體。注10ml的80％甲醇/水和10ml的0.1M乙酸被順序添加到各自的倒空樣品提取物管并從那里分配，進行樣品提取物到SPE柱體的定量轉移。最終10ml的95％甲醇/水漂洗以2×5ml等分部分直接施加于SPE柱體。
5.0 在滴注停止之后，真空被略微增加，以從SPE吸附劑除去過量的溶液，然后收集小瓶或管被安裝在真空歧管中。
6.0 分析物以2×4ml等分部分的洗脫溶液(1％TFA，在甲醇/水(90/10)中)通過重力給料而洗脫。在添加第二部分之前，在第一部分通過SPE柱體之后等待至少5分鐘。正壓或真空可被施加，以回收在SPE柱體上殘余的甲醇。
7.0 樣品從SPE槽除去，并使其在N-Evap上在45-50蒸發至完全干燥。注允許另外干燥15分鐘，以確保TFA完全蒸發。
8.0 5.0ml的0.02M磷酸水溶液被添加至樣品。蓋上蓋、渦旋混合、超聲處理至少5min并渦旋混合。
9.0 一部分最終提取物溶液被添加入自動進樣器小瓶，用于LC/MS/MS分析。
MAX SPE純化(肉組織商品) 在肝和腎樣品提取物中分析草甘膦、N-乙酰草甘膦和N-乙酰AMPA的。在肌肉樣品提取物中分析草甘膦和N-乙酰草甘膦。
1.0 1.25mL(脂肪、腎或肝)或2.5mL(肌肉)提取物被轉移到15mL聚丙烯離心管并且0.1mL三乙胺(TEA)被添加至樣品。注對于脂肪和腎樣品，步驟1.0-3.0可以被合并，且所有稀釋在50mL管中進行(步驟3.0)，因為對于這些基質幾乎沒有或沒有沉淀形成。
2.0 5mL乙腈被添加至提取物等分試樣、蓋上蓋并渦旋溶液。5mL的甲醇被添加至樣品溶液，蓋上蓋、渦旋并使樣品靜置10min。
3.0 在足以形成樣品顆粒得到速度下離心樣品10min，并傾析入干凈的50mL聚丙烯離心管，該離心管包含0.125mL內標。用7-8mL甲醇漂洗原來的管并與在50mL管中的提取物合并，達到大約20ml的最終體積。
4.0 MAX SPE(6cc/500mg)柱體用1CV(柱體積，～6ml)的甲醇、繼之以2CV 0.1％TEA在甲醇/乙腈(75/25)中的溶液來調節。注需要大約12mL/樣品的TEA溶液。
5.0 當最后的調節溶液進入吸附劑時，開始裝載樣品提取物溶液。優選重力洗脫，但對于緩慢滴注，可能需要微小真空。
6.0 在最后的樣品溶液進入吸附劑之后，10mL的80％甲醇/水、10ml在80％甲醇/水中的0.1M乙酸和10ml的95％甲醇水被順序添加，以漂洗SPE柱體。注10ml的80％甲醇/水和10ml的0.1M乙酸應該被順序添加到各自的倒空樣品提取物管并從那里分配，進行樣品提取物到SPE柱體的定量轉移。最終10ml的95％甲醇/水漂洗以2×5ml等分部分直接施加于SPE柱體。
7.0 在滴注停止之后，真空被略微增加，以從SPE吸附劑除去過量的溶液，然后收集小瓶或管被安裝在真空歧管中。為了最快蒸發，可以使用平面、圓的或稍微傾斜的底部。
8.0 分析物以2×4ml等分部分的洗脫溶液(1％TFA，在甲醇/水(90/10)中)通過重力送料而洗脫。在添加第二部分之前，在第一部分通過SPE柱體之后等待至少5分鐘。正壓或真空可被施加，以回收在SPE柱體上殘余的甲醇。
9.0 來自SPE槽的樣品被除去，并使其在N-Evap上在45-50℃蒸發至完全干燥。注允許額外的15分鐘干燥，以確保TFA完全蒸發。
10.0 2.5ml的0.02M磷酸水溶液被添加至樣品。樣品被蓋上蓋、渦旋混合、超聲處理至少5min并渦旋混合。
11.0 一部分最終提取物溶液被過濾(0.2μm尼龍)入自動進樣器小瓶，用于LC/MS/MS分析。
MCX SPE過濾純化 分析蛋和脫脂乳中的AMPA。分析全脂牛奶或奶油中的AMPA、N-乙酰草甘膦和N-乙酰AMPA。
1.0 Oasis MCX SPE柱體(6cc/500mg，Waters#_186000776)用1CV(CV≈6mL)的甲醇和1CV含水0.1％甲酸/甲醇(96/4，v/v)來順序調節。輕微真空可以被施加來控制在慢滴注(1-2ml/min)下洗脫。真空被施加或持續，直到滴注停止。
2.0 15m l刻度離心管被安裝在SPE柱體之下在真空歧管之中。
3.0 0.25mL的內標(僅對于AMPA分析)+4.0mL C18過濾的提取物被施加于MCX SPE柱體。在滴注停止之后，4.0mL的甲醇被施加于MCX SPE柱體。如果需要，可以施加輕微真空。正壓或真空可被施加，以回收在SPE柱體上殘余的甲醇。
4.0 從真空歧管回收樣品，并使樣品在N-Evap上在45-50℃蒸發至4mL以下。
5.0 0.1mL的1.0M磷酸水溶液被添加并用5mL水稀釋至最終體積。將最終提取物蓋上蓋并渦旋。最終體積可以被調節，以符合儀器的靈敏度要求，例如4mL的最終體積，包括0.08mL 1.0M磷酸水溶液，其中在先添加0.20mL的100ng/ml內標，將在LOQ下的最終濃度調節至2.0ng/mL。
6.0 用于LC/MS/MS分析的一部分最終提取物被過濾(0.2μm尼龍)。最終溶液可在4或以下儲存。
MCX SPE純化(肉組織商品) 分析肌肉、肝臟、腎臟或脂肪商品中的AMPA。
1.0 2.5提取物被轉入50mL聚丙烯離心管。5mL乙腈被添加至提取物等分試樣，將樣品蓋上蓋并渦旋。樣品被離心10min。注在該溶液中可能沒有觀察到顯著的沉淀，因為該溶液未被調節至堿性pH。
2.0 對于肌肉0.125ml內標(僅對于AMPA分析)被添加并且用甲醇稀釋至大約20mL。
對于肝臟、腎臟、或脂肪0.25ml內標(僅對于AMPA分析)被添加并且用甲醇稀釋至大約20mL。
3.0 Oasis MCX SPE柱體(6cc/500mg，Waters#_186000776)用1CV(CV≈6mL)的甲醇和1CV含水0.1N HCl在96％水/4％甲醇來順序調節。輕微真空可被施加來控制在慢滴注(1-2ml/min)下洗脫。輕微真空可以被施加或持續，直到滴注停止。
4.0 稀釋樣品被施加于MCX SPE柱體。如果需要，可施加真空。
5.0 2ml甲醇被添加至樣品管、混合并添加到SPE柱體，用于定量轉移和吸附劑漂洗。施加真空或正壓，直到滴注停止。
6.0 15ml離心管被安裝在SPE柱體之下在真空歧管之中。
7.0 4.0ml的HPLC級水被施加于MCX SPE柱體。在滴注停止之后，4.0ml的甲醇被施加于MCX SPE柱體。如果需要，可施加輕微真空。正壓或真空可被施加，以回收在SPE柱體上殘余的甲醇。
8.0 對于肌肉從真空歧管回收樣品，并使樣品在N-Evap上在45-50℃蒸發至2.5mL以下。
對于肝臟、腎臟、或脂肪從真空歧管回收樣品，并使樣品在N-Evap上在45-50℃蒸發至4mL以下。
9.0 對于肌肉0.05mL的1M磷酸水溶液被添加并且用水稀釋樣品至2.5mL的最終體積。將最終提取物蓋上蓋并渦旋。對于肝臟、腎臟、或脂肪0.1mL的1M磷酸水溶液被添加并且用水稀釋樣品至5.0ml的最終體積。將最終提取物蓋上蓋并渦旋。
10.0 用于LC/MS/MS分析的一部分最終提取物被過濾(0.2μm尼龍)。最終溶液可在4或以下儲存。
儀器 Agilent HP 1100HPLC和Waters Quattro Premier或AB Sciex API5000三重四極質譜儀被用于LC/MS/MS分析。
典型的設備部件和操作條件如下 AgilentHP1100G1322A真空脫氣器，G1311A四聯泵，G1367A冷凍 HPLC 自動進樣器，G1330A冷凍器，G1316A柱室 注射體積 25μL(可以改變以校正MS靈敏度)HPLC柱 Phenomenex Luna Phenyl-Hexyl (15.0cm×4.6mm i.d.，3μm直徑顆粒) 柱溫40℃ 流動相A＝0.2M甲酸水溶液(正離子)或 0.05％甲酸(負離子) B＝甲醇 WatersQuattro ESI接口，MassLynx版本4SP4軟件 Premier AB Sciex API 5000 ESI接口，Analyst版本1.42軟件 接口電霧化(ESI) 極性正或負離子 模式MRM 表76.HPLC條件 大約的分析物保留時間(通過保留時間排序)如下 0.2M甲酸 0.05％甲酸 AMPA＝4.4min 4.4min 草甘膦＝ 4.9min 7.0min N-乙酰AMPA6.5min 10.0min N-乙酰草甘膦＝6.7min 11.0min 表77.Waters Quattro Premier質譜儀條件
在其它儀器上的質量賦值可能變化±0.5個原子質量單位。可調節停留時間來優化響應。
表78.Applied Biosystems/MDS Sciex API 5000質譜儀條件
校準步驟 使用標準質譜儀調諧并校準技術。如果需要建立對質量校準的信心(在數字控制之下的現代質譜儀通常不需要頻繁的質量校準，尤其對于定量模式)，使用供應商推薦的校準溶液。可通過注入測試分析物來進行MS系統的優化調諧。該方法采用如上所述制備的外部標準物。
使用

函數AVERAGE、STDEV和RSD，基于外部校準標準物的平均響應因子(分析物峰面積響應/分析物濃度)進行儀器校準。對于平均響應因子校準，應該觀察到小于或等于20％的％RSD。使用Excel函數SLOPE、INTERCEPT和RSQ得到的外部校準標準物的線性回歸響應被監測，以建立校準曲線線性。有效定量的接受準則是(1)對于校準曲線，RSQ值＞0.99；和(2)對于各校準標準物響應因子，％RSD≤20％。可以使用包括有或者沒有進行加權(例如1/X)的線性回歸在內的可選方法，如果它們對校準標準物響應提供一當量以上一致性擬合的樣品響應的話。
對于N-乙酰草甘膦、草甘膦和N-乙酰AMPA，LC/MS/MS校準范圍是0.25ng/ml至50.0ng/ml。對于AMPA，LC/MS/MS校準范圍是0.5ng/ml至50.0ng/ml。通常，對于定量LC/MS/MS分析，分析最少5個校準溶液。
凈回收率可以僅對于加標樣品進行計算(對于現場樣品則不可接受)。如果在對照樣品中的殘留物可以與至少3比1的信噪比響應整合，則可以通過從在加標樣品中測量的mg/kg減去在對照樣品中發現的mg/kg，計算凈回收率。當對照殘余＞LOQ的50％時，使用該對照以LOQ制備的回收樣品無效。如果計算了凈回收率，則那些結果必須被唯一地識別或存在于校正mg/kg的單獨電子數據表列標題。
樣品分析 常規進行至少2個校準標準物的初步運轉，以證明適當的儀器響應并確保LC/MS/MS系統得到平衡。如果分析多組，則在所述組的最后一次和第一次注射之間進行溶劑空白注射，以最小化組間攜帶的風險。校準標準物分析在第一個樣品分析之前并且在最后一次樣品分析之后進行，如此樣品分析被夾在外標校準之間。通常，注射順序從最低到最高預期分析物濃度加以架構。校準標準物試驗與測試樣品摻雜進行，并且在各分析組中在每1-3個樣品前后進行分析。如果儲存的話，提取物和校準標準物被冷藏。通常，在分析組中，對于可接受的定量結果，需要加標樣品回收率(70-120％)。
計算 方法 在動物基質中，N-乙酰草甘膦、草甘膦、N-乙酰AMPA和AMPA殘余被測量為以草甘膦游離酸當量計的ppm(mg/kg)。定量基于平均響應因子，平均響應因子根據與樣品提取物同時分析的多個校準標準物進行確定。使用以兩位有效數字報告的不舍入的值，進行全部計算。加標樣品回收率以近似整數百分比(％)報告。
確定通過平均響應因子分析在殘余樣品中發現的mg/kg的計算如下 無內標校準
有內標校準
其中， PA 是分析物峰面積， FV 是最終提取物體積(mL)， XV 是總提取物體積(mL)， RF 響應因子
RFIS 采用內標的響應因子
ARF 是來自該分析組中的標準物的平均響應因子， IS 是樣品提取物中內標的峰面積， ARFIS 是來自該分析組中的標準物的采用內標的平均響應因子， AF 是等分試樣因子(XV稀釋至FV的mL)， SW 是提取的樣品部分的樣品重量(2.0g)，和 UC 單位換算 μg/1000ng×mg/1000μg×1000g/kg＝mg·g/1000ng·kg 來自加標樣品的回收率百分比(以四舍五入的整數報告)如下計算
無內標的實例 以全脂牛奶LOQ加標的N-乙酰草甘膦，MCX清除 (RMLI MCX 012307)

以整蛋LOQ加標的N-乙酰AMPA，MAX清除(EG-0.025-3)

采用內標的實例 以全脂牛奶LOQ加標的草甘膦，MAX清除

結果和討論 方法確認結果 檢測器響應 采用正或負離子ESI和串聯質譜法檢測的三重四極質譜儀用于樣品提取物分析。通過標準物溶液的分析，N-乙酰草甘膦、草甘膦、AMPA和N-乙酰AMPA的全掃描總離子色譜和光譜分別提供于圖59至圖62。
對于草甘膦、N-乙酰草甘膦和N-乙酰AMPA在0.25-20ng/ml的范圍內或者對于AMPA在0.5-50ng/ml的范圍內，校準標準物一般產生校準標準物響應因子(峰面積/濃度)的％RSD＜20％的線性響應(r平方＞0.99)。使用來自確認組的校準標準物，繪制每一分析物的典型校準曲線，并在圖63中給出。校準標準物的典型離子色譜提供于圖64。來自對照的提取物、乳、蛋和組織基質的LOQ加標和10×LOQ加標樣品提取物的典型離子色譜分別提供于圖65至圖73。
對照 在來自基質樣品的對照提取物的色譜中，在N-乙酰草甘膦、草甘膦或N-乙酰AMPA洗脫的區域中，沒有觀察到顯著的基質干擾。在對照小雞肝臟(0.011mg/kg)和肌肉(0.003mg/kg)樣品中，發現AMPA。
回收率(準確度與精度) 對于乳基質，典型的回收率結果提供于表80至表82；對于蛋基質，提供于表83至表85；而對于動物組織基質，提供于表86至表89。在每一加標水平下的平均回收率結果以及每一基質的總回收率結果提供于概要。來自每種商品的各個樣品組分析的典型結果，包括校準標準物統計數字，提供于表90-101。
表80全脂牛奶確認結果
用作內標的草甘膦和AMPA穩定同位素 表81脫脂乳驗證結果
用作內標的草甘膦和AMPA穩定同位素 na未分析 表82奶油驗證結果
用作內標的草甘膦和AMPA穩定同位素 表83整蛋驗證結果
用作內標的草甘膦和AMPA穩定同位素 表84蛋白驗證結果
用作內標的草甘膦和AMPA穩定同位素 *AMPA數據點離群數據，未包括在回收率數據中 表85蛋黃驗證結果
用作內標的草甘膦和AMPA穩定同位素 表86肝臟驗證結果


草甘膦當量計的mg/kg *同一提取物的2次分析的平均值 表87腎臟驗證結果


草甘膦當量計的mg/kg *同一提取物的2次分析的平均值 **結果離群數據，未包括在回收率統計數據中 表88脂肪驗證結果


草甘膦當量計的mg/kg 表89肌肉驗證結果


草甘膦當量計的mg/kg *同一提取物的2次分析的平均值 **結果離群數據，未包括在回收率統計數據中 表90.典型的方法驗證數據表 全脂牛奶(草甘膦)
表91典型的方法驗證數據表
全脂牛奶(AMPA，N-乙酰AMPA，N-乙酰草甘膦) 表92典型的方法驗證數據表
脫脂乳 表93典型的方法驗證數據表
脫脂乳(AMPA，N-乙酰AMPA，N-乙酰草甘膦) 表94典型的方法驗證數據表
奶油(AMPA，N-乙酰AMPA，N-乙酰草甘膦) 表95典型的方法驗證數據表
奶油(草甘膦，N-乙酰AMPA，N-乙酰草甘膦) 表96典型的方法驗證數據表 整蛋-AMPA分析
表97典型的方法驗證數據表
整蛋-N-乙酰草甘膦、草甘膦和N-乙酰AMPA分析 表98典型的方法驗證數據表 母牛肌肉和肝臟-N-乙酰草甘膦、草甘膦和N-乙酰AMPA分析
表99典型的方法驗證數據表 母牛肌肉-AMPA分析
注釋

在70-110％之外的％Rec，下劃線從樣品中檢測的面積減去對照中檢測的面積。類型(B空白，S標準物，IS內標，C對照樣品，F加標對照樣品，T處理過的樣品，FS加標標準物)。SW樣品重量，XV提取物體積，AF等分試樣因子，FV最終體積，RFIS對IS進行歸一化的響應因子(分析物面積/IS面積/分析物ppb)，RF響應因子(分析物面積/分析物ppb)。發現的mg/kg＝(面積/平均RF)×(FV×XV)/(AF×SW×1000)；發現的mg/kg(IS)＝(面積/IS面積/平均RFIS)×(FV×XV)/(AF×SW×1000)。
表100典型的方法驗證數據表 母牛腎臟和脂肪-N-乙酰草甘膦、草甘膦和N-乙酰AMPA分析
注釋

在70-110％之外的％Rec，下劃線從樣品中檢測的面積減去對照中檢測的面積。類型(B空白，S標準物，IS內標，C對照樣品，F加標對照樣品，T處理過的樣品，FS加標標準物)。SW樣品重量，XV提取物體積，AF等分試樣因子，FV最終體積，RFIS對IS進行歸一化的響應因子(分析物面積/IS面積/分析物ppb)，RF響應因子(分析物面積/分析物ppb)。發現的mg/kg＝(面積/平均RF)×(FV×XV)/(AF×SW×1000)；發現的mg/kg(IS)＝(面積/IS面積/平均RFIS)×(FV×XV)/(AF×SW×1000)。
表101典型的方法驗證數據表 母牛腎臟-AMPA分析
注釋

在70-110％之外的％Rec，下劃線從樣品中檢測的面積減去對照中檢測的面積。類型(B空白，S標準物，IS內標，C對照樣品，F加標對照樣品，T處理過的樣品，FS加標標準物)。SW樣品重量，XV提取物體積，AF等分試樣因子，FV最終體積，RFIS對IS進行歸一化的響應因子(分析物面積/IS面積/分析物ppb)，RF響應因子(分析物面積/分析物ppb)。發現的mg/kg＝(面積/平均RF)×(FV×XV)/(AF×SW×1000)；發現的mg/kg(IS)＝(面積/IS面積/平均RFIS)×(FV×XV)/(AF×SW×1000)。
提取效率 使用本文描述的方法，提取在家禽代謝研究中用14CN-乙酰草甘膦處理的小雞肝臟、脂肪和肌肉樣品，用于提取效率的放射化學確認。一式兩份的來自每一基質的2g子樣品被提取，并且來自每一提取物的等分試樣通過液體閃爍計數(LSC)進行分析，用于獲得放射性回收率。使用原來的14CN-乙酰草甘膦測試物質的比活性(13.83μCi/mg＝30703dpm/μg)，將放射性回收率結果(dpm/g)轉換為μg/g濃度，用于與家禽代謝研究中報告的回收率比較。肝臟、脂肪和肌肉各自的的回收率結果為在代謝研究提取中發現的μg/g濃度的98％、88％和104％。LSC數據和結果提供于表102。
表102.提取效率測定值
每一基質的兩份樣品被提取，并通過LSC(-1A，-1B)分析每一提取物的2個等分試樣。
乳和蛋樣品通常是液體基質，其在分配和固相提取SPE的純化步驟之前稀釋在水溶液中。對于這些基質，沒有進行提取效率測試。
定量限(LOQ) 對于草甘膦、N-乙酰草甘膦、AMPA和N-乙酰AMPA的分析，在該方法中確定的LOQ在蛋在乳、蛋和肌肉基質中為0.025mg/kg(ppm)，而在腎臟、肝臟和脂肪基質中為0.050mg/kg。LOQ被定義為最低加標水平，在該水平下，達到70-110％的平均回收率和RSD＜20％。另外，在該加標水平，對于N-乙酰草甘膦，分析物峰一致地表現出約5-20比1的信噪比。
背景評價 串聯質譜分析存在的背景水平最小。通常，樣品提取物溶液和校準標準物溶液的色譜圖顯得相同。典型基質色譜提供于圖65至圖73。
檢測限(LOD) LOD定義為在基質中響應相當于大約3比1的信噪比(s/n)的分析物濃度。對于各分析物，使用下列方程式，通過在LOQ加標樣品中確定的sn響應，估計LOD。

每一分析物的顯示s/n測定值和計算的估計值的各個色譜提供于圖75-80。所檢測的每一分析物和基質的LOD估計值在表79中總結。
表79 估計的LOD (草甘膦當量計的mg/kg) N-乙酰草甘 基質草甘膦 膦 AMPA N-乙酰AMPA 乳 0.0080.0050.0080.008 蛋 0.0030.0080.0060.007 肝臟0.0090018 0.0190.008 腎臟0.0040.0140.0090.008 脂肪0.0080.0150.0150.009 肌肉0.0040.0060.0080.006 觀察到LOD偏差并且使用該方法的每一實驗室應該估計LOD值。在再純化或分析之前，冷凍儲存的樣品提取物應該解凍并超聲處理大約15分鐘。通常，設定LC/MS/MS結束試驗，以便高百分比有機溶劑(99％甲醇)將在最終分析之后在低流率(0.025ml/min)下持續過夜，以保持HPLC泵和柱完好。
在蒸餾水中制備并儲存在大約4℃的分析物儲備標準物的穩定性顯示出穩定一年以上。數據未示出。也在蒸餾水中制備的加標標準物應該在與儲備溶液相同的時間周期內是穩定的。校準標準物在0.02M磷酸水溶液或80％對照基質/20％0.02M磷酸水溶液中制備，并且在大約4儲存時顯示出在至少2.7℃個月內是穩定的。
與測試分析物共洗脫，沒有觀察到可歸因于玻璃器皿、試劑或基質的干擾。就在N-乙酰草甘膦以后，在m/z212→88MRM躍遷通道洗脫中，觀察到峰，其可歸因于MAX SPE吸附劑。
確證步驟 在ESI正或負離子模式下，監測到N-乙酰草甘膦、草甘膦和N-乙酰AMPA的分子離子的兩個獨立的MS/MS躍遷。對于AMPA，僅僅在ESI負模式下監測到分子離子的兩個獨立的MS/MS躍遷。從校準標準物響應，確定兩個碎片離子的相對響應值比(基礎峰/二級峰)，用于證實基質樣品中的分析物。可接受的證實標準是相比于在校準標準物中觀察到的平均響應共洗脫峰(±5％)和當量離子比(±30％)在與樣品同時分析的LOQ當量濃度以上。顯示每一分析物的計算的響應比和保留時間的典型確證分析提供于表103-106。
表103.典型確證分析 全脂牛奶 草甘膦、N-乙酰草甘膦、N-乙酰AMPA

表104 整蛋 草甘膦、N-乙酰草甘膦、N-乙酰AMPA、AMPA
表105 小雞肝臟和肌肉 AMPA
表106 牛肝臟和肌肉 草甘膦、N-乙酰草甘膦、N-乙酰AMPA
結論 該分析法適于乳、蛋和動物組織基質中草甘膦、N-乙酰草甘膦、AMPA和N-乙酰AMPA殘余的定量。結果證實，在乳、蛋和肌肉基質中以草甘膦當量計的LOQ為0.025mg/kg，而在腎臟、肝臟和脂肪基質中LOQ為0.050mg/kg。全部分析物的估計LOD值在乳、蛋和肌肉基質中以草甘膦當量計的LOQ小于或等于0.008mg/kg，而在腎臟、肝臟和脂肪基質中LOQ小于或等于0.019mg/kg。在所檢測的全部基質中草甘膦的估計LOD小于或等于0.009mg/kg草甘膦當量。
在確認試驗中，對于每一分析物和基質的各加標水平，平均回收率的范圍為從76％(脫脂乳中，AMPA在0.50mg/kg)到110％(在蛋黃中，AMPA為0.025mg/kg)。各加標水平的最大標準偏差是16％(在肝臟中，N-乙酰AMPA為0.050mg/kg)。
基于保留時間、在樣品分析期間檢測的兩個MS/MS母體-與-碎片離子躍遷的相對比，在LOQ和10×LOQ加標水平下，證明草甘膦、N-乙酰草甘膦、AMPA和N-乙酰草甘膦的殘余確證。
冠詞“一個(種)(a)”和“一個(種)(an)”在本文被用來指一個(種)或一個(種)以上(即，至少一個(種))該冠詞在語法上的對象。例如，“一個(種)要素”是指一個(種)或多個(種)要素。如本文所使用，術語“約”，當涉及值時在一些實施方式中，旨在包括從所述量±20％的偏差，在一些實施方式中±10％的偏差，在一些實施方式中±1％的偏差，在一些實施方式中，±0.5％的偏差，以及在一些實施方式中±0.1％的偏差，因為這些偏差適于進行所披露的方法或使用所披露的組合物。
在說明書中提到的全部出版物和專利申請指示本發明有關的領域的普通技術人員的水平。全部出版物和專利申請通過引用并入本文，其程度如同各出版物或專利申請被具體和單獨地指出通過引用并入。
盡管為了清楚理解，上述發明通過例證和實例相當詳細地進行了描述，但是明顯的是，在所附權利要求的范圍內，可以實踐某些變化和修改。
權利要求
1.確定測試樣品中N-乙酰草甘膦的存在或含量的方法，其包括
a)提供懷疑包含所述N-乙酰草甘膦的所述測試樣品；
b)從所述測試樣品提取包含N-乙酰草甘膦的組合物；
c)色譜法分離所述N-乙酰草甘膦與所述組合物中的其它組分；和，
d)分析所述色譜法分離的N-乙酰草甘膦，以確定在所述測試樣品中N-乙酰草甘膦的存在或含量。
2.權利要求1所述的方法，其中通過質譜儀進行分析所述色譜法分離的N-乙酰草甘膦。
3.權利要求1或2所述的方法，其中從所述測試樣品色譜法分離所述N-乙酰草甘膦包括高效液相色譜(HPLC)柱。
4.權利要求2所述的方法，其中在色譜法分離所述N-乙酰草甘膦與所述組合物中的其它組分之前，足夠濃度的磷酸被添加至所述包含所述N-乙酰草甘膦的組合物，其中所述足夠濃度使得在檢測期間N-乙酰草甘膦的響應和線性得以改善。
5.權利要求2所述的方法，其中從所述測試樣品提取包含所述N-乙酰草甘膦的組合物包括選自下列的步驟
a)i)通過液-液提取法從所述測試樣品提取包含所述N-乙酰草甘膦的組合物；和，
ii)將所述提取的包含所述N-乙酰草甘膦的組合物布置在至少一種提取柱上，并從那里洗脫包含所述N-乙酰草甘膦的組合物；
或，
b)i)在允許所述N-乙酰草甘膦被固相提取吸附劑結合的條件下，混合所述測試樣品與所述固相提取吸附劑；和，
ii)通過液體/液體提取，提取所述固相提取吸附劑和來自所述樣品的結合的N-乙酰草甘膦；和，
iii)從所述固相提取吸附劑洗脫所述N-乙酰草甘膦。
6.權利要求6所述的方法，其進一步包括將來自權利要求5步驟(a)(ii)或(b)(iii)的所述洗脫的包含所述N-乙酰草甘膦的組合物布置在陰離子交換提取柱上，并從那里洗脫N-乙酰草甘膦。
7.權利要求1-6任一項所述的方法，其中不進行所述N-乙酰草甘膦的衍生化。
8.權利要求1-7任一項所述的方法，其進一步包括確定在所述測試樣品中氨甲基膦酸(AMPA)、N-乙酰AMPA或草甘膦的存在或含量。
9.確定測試樣品中N-乙酰氨甲基膦酸(N-乙酰AMPA)的存在或含量的方法，其包括
a)提供懷疑包含所述N-乙酰AMPA的所述測試樣品；
b)從所述測試樣品提取包含所述N-乙酰AMPA的組合物；
c)分離所述N-乙酰AMPA與所述組合物中的其它組分；和，
d)分析所述分離的N-乙酰AMPA，以確定在所述測試樣品中N-乙酰AMPA的存在或含量。
10.權利要求9所述的方法，其中分離所述N-乙酰AMPA包括色譜法分離所述N-乙酰AMPA與所述組合物中的其它組分，并通過質譜儀分析所述色譜法分離的N-乙酰AMPA。
11.權利要求10所述的方法，其中從所述測試樣品色譜法分離所述N-乙酰AMPA包括高效液相色譜(HPLC)柱。
12.權利要求10所述的方法，其中在色譜法分離所述N-乙酰AMPA與所述組合物中的其它組分之前，足夠濃度的磷酸被添加至所述包含所述N-乙酰AMPA的組合物，其中所述足夠濃度使得在檢測期間N-乙酰AMPA的響應和線性得以改善。
13.權利要求9-12任一項所述的方法，其中從所述測試樣品提取包含所述N-乙酰AMPA的組合物包括選自下列的步驟
a)i)使用含水稀酸/甲醇溶液從所述測試樣品提取包含所述N-乙酰AMPA的組合物；和，
ii)將所述提取的包含所述N-乙酰AMPA的組合物布置在至少一種提取柱上，并從那里洗脫包含所述N-乙酰AMPA的組合物；
或，
b)i)在允許所述N-乙酰AMPA被固相提取吸附劑結合的條件下，混合所述測試樣品與所述固相提取吸附劑；和，
ii)通過液體/液體提取，提取所述固相提取吸附劑和來自所述樣品的結合的N-乙酰AMPA；和，
iii)從所述固相提取吸附劑洗脫所述N-乙酰AMPA。
14.權利要求13所述的方法，其進一步包括將來自步驟13(a)(ii)或13(b)(iii)的所述洗脫的包含所述N-乙酰AMPA的組合物布置在陰離子交換提取柱上，并從那里洗脫N-乙酰AMPA。
15.權利要求9-14任一項所述的方法，其中不進行所述N-乙酰AMPA的衍生化。
16.權利要求9-15任一項所述的方法，布置進一步包括確定在所述測試樣品中氨甲基膦酸(AMPA)、草甘膦或N-乙酰草甘膦的存在或含量。
17.確定測試樣品中N-乙酰草甘膦或N-乙酰AMPA的存在或含量的方法，其包括
a)提供懷疑包含所述N-乙酰草甘膦或N-乙酰AMPA的所述測試樣品；
b)從所述測試樣品提取包含所述N-乙酰草甘膦或N-乙酰AMPA的組合物，所述提取包括選自下列的步驟
1)i)通過液-液提取法從所述測試樣品提取所述N-乙酰草甘膦或所述N-乙酰AMPA；
ii)將步驟(b)的所述提取的包含所述N-乙酰草甘膦或N-乙酰AMPA的組合物布置在C18提取柱上，并從那里洗脫所述N-乙酰草甘膦或N-乙酰AMPA；
或，
2)i)在允許所述N-乙酰AMPA或所述N-乙酰草甘膦被固相提取吸附劑結合的條件下，混合所述測試樣品與所述固相提取吸附劑；
ii)通過液體/液體提取，提取所述固相提取吸附劑和來自所述樣品的結合的N-乙酰AMPA或結合的N-乙酰草甘膦；和，
iii)從所述固相提取吸附劑洗脫所述N-乙酰AMPA或所述N-乙酰草甘膦；
c)將來自步驟(b)(1)(ii)或(b)(2)(iii)的所述洗脫的N-乙酰草甘膦或N-乙酰AMPA布置在陰離子交換提取柱上，并從那里洗脫N-乙酰草甘膦，其中所述陰離子交換柱具有這樣的官能表面，其具有含季銨的間二乙烯基苯和N-乙烯基吡咯烷酮共聚物；
d)添加足夠濃度的磷酸至步驟(c)所述的洗脫的N-乙酰草甘膦，其中所述足夠濃度允許在檢測期間改善N-乙酰草甘膦的響應和線性；
e)使用苯基-己基高效液相色譜(HPLC)分析柱，色譜法分離N-乙酰草甘膦或所述所述N-乙酰AMPA與步驟(d)的其它組分；和，
f)通過以正離子模式操作的串聯四極質譜儀分析步驟(e)的色譜法分離的樣品，以確定N-乙酰草甘膦或所述N-乙酰AMPA在所述測試樣品中的存在或含量。
18.確定測試樣品中草甘膦的存在或含量的方法，其包括
a)提供懷疑包含所述草甘膦的所述測試樣品；
b)從所述測試樣品提取包含所述草甘膦的組合物；
c)添加足夠濃度的磷酸至步驟(b)的包含所述草甘膦的組合物，其中所述足夠濃度允許在檢測期間改善草甘膦的響應和線性；
d)色譜法分離所述草甘膦與所述組合物中的其它組分；和，
e)分析步驟(d)的色譜法分離的草甘膦，以確定在所述測試樣品中草甘膦的存在或含量；
其中進行所述草甘膦的檢測而不衍生化所述草甘膦。
19.確定測試樣品中草甘膦的存在或含量的方法，其包括
a)提供懷疑包含所述草甘膦的所述測試樣品；
b)使用含水稀酸/甲醇溶液從所述測試樣品提取包含所述草甘膦的組合物；
c)色譜法分離所述草甘膦與所述組合物中的其它組分；和，
d)分析步驟(c)的色譜法分離的草甘膦，以確定在所述測試樣品中草甘膦的存在或含量；
其中進行所述草甘膦的檢測而不衍生化所述草甘膦。
20.權利要求19所述的方法，其中在步驟(b)之后在步驟(c)之前，添加足夠濃度的磷酸至步驟(b)的包含所述草甘膦的組合物，其中所述足夠濃度允許在檢測期間草甘膦的響應和線性得到改善。
21.權利要求19或20所述的方法，其中通過質譜儀進行分析所述色譜法分離的草甘膦。
22.權利要求19-21任一項所述的方法，其中從所述組合物色譜法分離所述草甘膦包括高效液相色譜(HPLC)柱。
23.權利要求19-22任一項所述的方法，其中從所述測試樣品提取包含所述草甘膦的組合物包括選自下列的步驟
a)i)通過液-液提取法從所述測試樣品提取包含所述草甘膦的組合物；和，
ii)將所述提取的包含所述草甘膦的組合物布置在至少一種提取柱上，并從那里洗脫包含所述草甘膦的組合物；
或，
b)i)在允許所述草甘膦被固相提取吸附劑結合的條件下，混合所述測試樣品與所述固相提取吸附劑；和，
ii)通過液體/液體提取，提取所述固相提取吸附劑和來自所述樣品的結合的草甘膦；和，
iii)從所述固相提取吸附劑洗脫所述草甘膦。
24.權利要求23所述的方法，其進一步包括將所述提取柱的洗脫物或所述固相提取吸附劑布置在陰離子交換提取柱上，并從那里洗脫所述草甘膦。
25.確定測試樣品中草甘膦的存在或含量的方法，其包括
a)提供懷疑包含所述草甘膦的所述測試樣品；
b)從所述測試樣品提取包含所述草甘膦的組合物，所述提取包括選自下列的步驟
1)i)通過液-液提取法從所述測試樣品提取所述草甘膦；
ii)將步驟(1)(i)的所述提取的包含所述草甘膦的組合物布置在C18提取柱上，并從那里洗脫所述草甘膦；
或，
2)i)在允許所述草甘膦被固相提取吸附劑結合的條件下，混合所述測試樣品與所述固相提取吸附劑；
ii)通過液體/液體提取，提取所述固相提取吸附劑和來自所述樣品的結合的草甘膦；和，
iii)從所述固相提取吸附劑洗脫所述草甘膦。
c)將來自步驟(b)(1)(ii)或(b)(2)(iii)的所述洗脫的草甘膦布置在陰離子交換提取柱上，并從那里洗脫草甘膦，其中所述陰離子交換柱具有這樣的官能表面，其具有含季銨的間二乙烯基苯和N-乙烯基吡咯烷酮共聚物；
d)添加足夠濃度的磷酸至步驟(c)所述的洗脫的草甘膦，其中所述足夠濃度允許在檢測期間草甘膦的響應和線性得到改善；
e)使用苯基-己基高效液相色譜(HPLC)分析柱，色譜法分離草甘膦與步驟(d)洗脫物中的其它組分；和，
f)通過以正離子模式操作的串聯四極質譜儀分析步驟(e)的色譜法分離的樣品，以確定草甘膦或在所述測試樣品中的存在或含量。
其中進行所述草甘膦的檢測而不衍生化所述草甘膦。
26.確定測試樣品中氨甲基膦酸(AMPA)的存在或含量的方法，其包括
a)提供懷疑包含所述AMPA的所述測試樣品；
b)從所述測試樣品提取包含所述AMPA的至少一種的組合物；
c)色譜法分離所述AMPA與所述組合物中的其它組分；和，
d)分析步驟(c)的色譜法分離的AMPA的至少一種，以確定在所述測試樣品中AMPA的存在或含量；
其中進行所述AMPA的檢測而不衍生化所述AMPA。
27.權利要求26所述的方法，其中通過質譜儀進行分析所述色譜法分離的AMPA。
28.權利要求26-28任一項所述的方法，其中從所述組合物色譜法分離所述AMPA包括高效液相色譜(HPLC)柱。
29.權利要求26-28任一項所述的方法，其中在色譜法分離所述AMPA與所述組合物中的組分之前，足夠濃度的磷酸被添加至所述包含所述AMPA的組合物，其中所述足夠濃度使得在檢測期間AMPA的響應和線性得以改善。
30.權利要求26-29任一項所述的方法，其中從所述測試樣品提取包含所述AMPA的組合物包括選自下列的步驟
a)i)通過液-液提取法從所述測試樣品提取包含所述AMPA的組合物；和，
ii)將所述提取的包含所述AMPA的組合物布置在至少一種提取柱上，并從那里洗脫包含所述AMPA的組合物；
或，
b)i)在允許所述AMPA被固相提取吸附劑結合的條件下，混合所述測試樣品與所述固相提取吸附劑；和，
ii)通過液體/液體提取，提取所述固相提取吸附劑和來自所述樣品的結合的AMPA；和，
iii)從所述固相提取吸附劑洗脫所述AMPA。
31.權利要求30所述的方法，其進一步包括將所述提取柱的洗脫物或所述固相提取吸附劑布置在陽離子交換提取柱上，并從那里洗脫所述AMPA。
32.確定測試樣品中氨甲基膦酸(AMPA)的存在或含量的方法，其包括
a)提供懷疑包含AMPA的所述測試樣品；
b)從所述測試樣品提取包含所述AMPA的組合物，所述提取包括選自下列的步驟
1)i)通過液-液提取法從所述測試樣品提取所述AMPA；
ii)將步驟(1)(i)的所述提取的包含所述AMPA的組合物布置在C18提取柱上，并從那里洗脫所述AMPA；
或，
2)i)在允許所述AMPA被固相提取吸附劑結合的條件下，混合所述測試樣品與所述固相提取吸附劑；
ii)通過液體/液體提取，提取所述固相提取吸附劑和來自所述樣品的結合的AMPA；和，
iii)從所述固相提取吸附劑洗脫所述AMPA；
c)將來自步驟(b)(1)(ii)或(b)(2)(iii)的所述洗脫的AMPA布置在陽離子交換提取柱上，并從那里洗脫AMPA，所述陽離子交換柱具有這樣的官能表面，其具有含磺酸取代基的間二乙烯基苯和N-乙烯基吡咯烷酮共聚物；
d)添加足夠濃度的磷酸至步驟(c)所述的洗脫的AMPA，其中所述足夠濃度允許在檢測期間AMPA的響應和線性得到改善；
e)使用苯基-己基高效液相色譜(HPLC)分析柱，色譜法分離AMPA與步驟(d)的洗脫物中的其它組分；和，
g)通過以正離子模式操作的串聯四極質譜儀分析步驟(e)的色譜法分離的樣品，以確定AMPA或在所述測試樣品中的存在或含量；
其中進行所述AMPA的檢測而不衍生化所述AMPA。
33.確定在油測試樣品中草甘膦、N-乙酰草甘膦、N-乙酰氨甲基膦酸(N-乙酰AMPA)或氨甲基膦酸(AMPA)的存在或含量的方法，其包括
a)提供懷疑包含所述草甘膦、所述N-乙酰草甘膦、所述N-乙酰AMPA或所述AMPA的至少一種的油測試樣品；
b)添加足夠濃度的磷酸至步驟(a)所述的測試樣品，其中所述足夠濃度允許在檢測期間所述草甘膦、所述N-乙酰草甘膦、所述N-乙酰AMPA或所述AMPA的響應和線性得到改善；
c)通過水-有機提取，從所述測試樣品提取包含所述AMPA、所述N-乙酰草甘膦、所述N-乙酰AMPA或所述草甘膦的至少一種的組合物；和，
d)檢測所述AMPA、所述N-乙酰草甘膦、所述N-乙酰AMPA或所述草甘膦的至少一種。
34.權利要求33所述的方法，其中所述檢測包括
從所述組合物色譜法分離所述AMPA、所述N-乙酰草甘膦、所述N-乙酰AMPA或所述草甘膦的至少一種；和，
(b)分析所述色譜法分離的草甘膦、N-乙酰草甘膦、N-乙酰AMPA或AMPA的至少一種，以確定在所述測試樣品中所述草甘膦、所述N-乙酰草甘膦、所述N-乙酰AMPA或所述AMPA的至少一種的存在或含量。
35.權利要求33或34所述的方法，其中所述水-有機有機物提取包括二氯甲烷和磷酸分配。
36.權利要求34所述的方法，其中通過質譜儀進行分析所述色譜法分離的草甘膦、N-乙酰草甘膦、N-乙酰AMPA或AMPA。
37.權利要求34或36所述的方法，其中從所述組合物色譜法分離所述N-乙酰草甘膦、所述AMPA、所述N-乙酰AMPA或所述草甘膦包括高效液相色譜(HPLC)柱。
38.確定在油測試樣品中草甘膦、N-乙酰草甘膦、N-乙酰氨甲基膦酸(N-乙酰AMPA)或氨甲基膦酸(AMPA)的存在或含量的方法，其包括
a)提供懷疑包含所述草甘膦、所述N-乙酰草甘膦、所述N-乙酰AMPA或所述AMPA的至少一種的測試樣品；
b)添加足夠濃度的磷酸至步驟(a)所述的測試樣品，其中所述足夠濃度允許在檢測期間所述草甘膦、所述N-乙酰草甘膦、所述N-乙酰AMPA或所述AMPA的響應和線性得到改善；
c)通過水-有機物分配，從所述測試樣品提取包含所述AMPA、所述N-乙酰草甘膦、所述N-乙酰AMPA或所述草甘膦的至少一種的組合物；
d)使用苯基-己基高效液相色譜(HPLC)分析柱，從步驟(c)的所述組合物色譜法分離所述AMPA、所述N-乙酰草甘膦、所述N-乙酰AMPA或所述草甘膦的至少一種；和
e)通過以正離子模式操作的串聯四極質譜儀分析步驟(d)的色譜法分離的樣品，以確定在所述測試樣品中所述AMPA、所述草甘膦、所述N-乙酰AMPA或所述N-乙酰草甘膦的至少一種的存在或含量。
39.從AMPA純化至少草甘膦、N-乙酰AMPA或N-乙酰草甘膦的方法，其包括
a)提供懷疑包含所述草甘膦、所述N-乙酰AMPA、所述N-乙酰草甘膦或所述AMPA的至少一種的測試樣品；
b)從所述測試樣品提取包含所述N-乙酰草甘膦、所述草甘膦或所述AMPA的至少一種的組合物；和，
c)將步驟(b)的所述組合物布置在陰離子交換提取柱上，并從那里洗脫所述N-乙酰草甘膦、N-乙酰AMPA和草甘膦的至少一種，從而從所述AMPA純化所述草甘膦、N-乙酰AMPA和N-乙酰草甘膦；或，
將步驟(b)的所述組合物布置在陽離子交換提取柱上，并從那里洗脫所述AMPA，從而從所述AMPA純化所述草甘膦、N-乙酰AMPA和所述N-乙酰草甘膦。
40.權利要求2、10、21、27或36任一項所述的方法，其中以正離子模式操作所述質譜儀。
41.權利要求5、17或30任一項所述的方法，其中所述液-液提取法包括用包含甲醇和稀酸的含水混合物提取。
42.權利要求1-41任一項所述的方法，其中所述測試樣品來自于動物或環境樣品。
43.權利要求42所述的方法，其中所述測試樣品來自于植物。
44.權利要求43所述的方法，其中所述測試樣品包括飼料、谷粒、稿稈、植物組織、固體處理部分基質、面粉、粗粉處理部分、干草、外殼、種子、粗粉、硬渣或淀粉。
45.權利要求1-44任一項所述的方法，其中所述測試樣品包括固體基質樣品。
全文摘要
本發明提供了各種方法和組合物，其允許確定在各種測試基質中草甘膦、N-乙酰草甘膦、N-乙酰AMPA或氨甲基磷酸(AMPA)和它的各種代謝物的存在或含量。在一個方法中，確定測試樣品中N-乙酰草甘膦和/或N-乙酰AMPA的存在或含量包括提供懷疑包含N-乙酰草甘膦和/或N-乙酰AMPA的測試樣品；從所述測試樣品提取所述N-乙酰草甘膦和/或N-乙酰AMPA；和檢測在提取物中的N-乙酰草甘膦和/或N-乙酰AMPA。在其它方法中，確定草甘膦、N-乙酰草甘膦、N-乙酰AMPA或氨甲基膦酸(AMPA)或其代謝物在測試樣品中的存在或含量。所述方法包括提供懷疑包含草甘膦、N-乙酰草甘膦、N-乙酰AMPA或AMPA或其代謝物的至少一種的測試樣品；從所述測試樣品提取所述草甘膦、N-乙酰草甘膦、N-乙酰AMPA或AMPA的至少一種；和從所述測試樣品檢測所述草甘膦、所述N-乙酰草甘膦、所述N-乙酰AMPA和所述AMPA的至少一種；其中進行所述草甘膦、N-乙酰草甘膦、N-乙酰AMPA或AMPA的檢測而不衍生化所述草甘膦、所述N-乙酰草甘膦、N-乙酰AMPA或所述AMPA。
文檔編號A01N57/00GK101646348SQ200880010069
公開日2010年2月10日 申請日期2008年3月25日 優先權日2007年3月27日
發明者F·Q·小布拉姆布爾, A·M·彭茨 申請人:納幕爾杜邦公司